NK细胞无动物源培养基的制作方法

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种nk细胞无动物源培养基。

背景技术：

自然杀伤细胞(naturalkillercell，nk)是一群不同于t、b淋巴细胞的大颗粒淋巴细胞，它来源于骨髓肝细胞，主要分布于外周血、肝脏和脾脏，时抗肿瘤的第一道防线。无需抗原预先致敏即可直接识别和杀伤肿瘤细胞，能发挥非特异性杀伤靶细胞的作用，尤其是对多种肿瘤细胞有快速杀伤和溶解的作用，对肺癌、肝癌、卵巢癌、食道癌、结肠癌、胃癌、宫颈癌、骨癌等均有效果，以nk细胞为中心的巨噬细胞，24小时加以监视，一旦发现癌细胞，就陆续加以清除。。特别是对淋巴瘤和白血病细胞作用更为明显，因此，在机体免疫监视和早期抗感染免疫过程中起重要作用，是抗瘤免疫的第一线细胞，能迅速溶解某些肿瘤细胞。

临床试验显示nk细胞过继免疫治疗恶性肿瘤具有良好的应用前景。体外实验表明，细胞因子诱导的nk细胞是一种高细胞毒活性的免疫效应细胞。由于nk细胞在人体内的含量极少，nk疗法是采用特殊的培养方法，把癌患者本身的nk细胞在体外培养增殖，使细胞数目扩大数千倍且细胞毒活性极大增强，再回输患者的体内，是一种简单有效、安全又积极的最新强力治癌疗法。

但是，现有的nk细胞培养基由于含有血清或其他动物源成分，很难与nk细胞分离，进入人体之后会存在会产生毒副作用。无动物源培养基因其成分相对清楚、不存在动物源性病原微生物污染、批次间重复性好、便于细胞表达产品的分离纯化等优点，得到了普遍的应用。然而，商业化的nk细胞培养基其配方一直是秘而不宣的核心商业秘密，价格昂贵且应用范围有限。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种nk细胞无动物源培养基，用于解决现有技术中存在的诸多问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种nk细胞无动物源培养基，各原料物质的浓度为：

l-精氨酸120-250mg/l；

l-门冬氨酸200-300mg/l；

l-胱氨酸二盐酸盐50-110mg/l；

l-苯丙氨酸16-35mg/l；

l-脯氨酸82-96mg/l；

l-苏氨酸105-133mg/l；

l-酪氨酸23-45mg/l；

丁二酸45-58mg/l；

丙酮酸钠85-92mg/l；

无水磷酸二氢钠30-50mg/l；

氯化钾263-322mg/l；

氯化钠132-155mg/l；

氯化镁55-63mg/l；

无水氯化钙82-88mg/l；

葡萄糖2000-3200mg/l；

还原谷胱甘肽12-15mg/l；

d-泛酸钙2-8mg/l；

酚红4-6mg/l；

叶酸2-3.6mg/l；

烟酰胺1-2.2mg/l；

氯化胆碱5-13mg/l；

盐酸吡哆醇2-3.6mg/l；

核黄素盐酸0.8-1.0mg/l；

酒石酸胆碱18-29mg/l；

2-巯基乙醇3-6mg/l；

硫胺素1.2-3.3mg/l；

维生素b120.1-0.3mg/l；

铁0.1-0.2mg/l；

钴0.1-0.2mg/l；

糖醇1.3-5.3mg/l；

纤维素6.6-8.5mg/l；

维生素e2-3.6mg/l；

2-氨基吡啶0.1-0.6mg/l；

白介素-20.3-0.6mg/l；

白介素-210.6-1.1mg/l。

优选地，所述nk细胞无动物源培养基还含有以下浓度的原料物质：

硝酸钙55-63mg/l；

硝酸钾46-49mg/l；

硝酸铵33-45mg/l。

优选地，所述nk细胞无动物源培养基，各原料物质的浓度为：

l-精氨酸189mg/l；

l-门冬氨酸246mg/l；

l-胱氨酸二盐酸盐78mg/l；

l-苯丙氨酸22mg/l；

l-脯氨酸86mg/l；

l-苏氨酸123mg/l；

l-酪氨酸35mg/l；

丁二酸52mg/l；

丙酮酸钠89mg/l；

无水磷酸二氢钠38mg/l；

氯化钾282mg/l；

氯化钠145mg/l；

氯化镁58mg/l；

硝酸钙56mg/l；

硝酸钾48mg/l；

硝酸铵39mg/l；

无水氯化钙84mg/l；

葡萄糖2650-3105mg/l；

还原谷胱甘肽14mg/l；

d-泛酸钙6mg/l；

酚红5mg/l；

叶酸2.9mg/l；

烟酰胺1.8mg/l；

氯化胆碱7mg/l；

盐酸吡哆醇2.9mg/l；

核黄素盐酸0.89mg/l；

酒石酸胆碱19mg/l；

2-巯基乙醇4mg/l；

硫胺素2.3mg/l；

维生素b120.2mg/l；

铁0.16mg/l；

钴0.17mg/l；

糖醇4.3mg/l；

纤维素7.5mg/l；

维生素e2.6mg/l；

2-氨基吡啶0.46mg/l；

白介素-20.56mg/l；

白介素-210.81mg/l。

如上所述，本发明的nk细胞无动物源培养基，具有以下有益效果：

该nk细胞无动物源培养基为化学成分限定的无动物源培养基，克服了市售无血清培养基导致的细胞活性差、贴壁性差以及分泌外源蛋白的能力差等缺点。试验证明，采用本发明所述培养基，能保证nk细胞活性都大于30%，细胞数量达到1×10¹⁰。采用本发明所述培养基可以使产品更易于纯化，提高回收率，适合其高密度生长或高水平目的产物表达。

附图说明

图1显示为采用实施例1所述培养基，不同时期的nk细胞镜下图。

图2显示为流式检测细胞活性图。

图3显示为nk细胞在不同培养基中培养后的活性对比。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指绝对压力。

此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1

l-精氨酸189mg/l；

l-门冬氨酸246mg/l；

l-胱氨酸二盐酸盐78mg/l；

l-苯丙氨酸22mg/l；

l-脯氨酸86mg/l；

l-苏氨酸123mg/l；

l-酪氨酸35mg/l；

丁二酸52mg/l；

丙酮酸钠89mg/l；

无水磷酸二氢钠38mg/l；

氯化钾282mg/l；

氯化钠145mg/l；

氯化镁58mg/l；

硝酸钙56mg/l；

硝酸钾48mg/l；

硝酸铵39mg/l；

无水氯化钙84mg/l；

葡萄糖2650-3105mg/l；

还原谷胱甘肽14mg/l；

d-泛酸钙6mg/l；

酚红5mg/l；

叶酸2.9mg/l；

烟酰胺1.8mg/l；

氯化胆碱7mg/l；

盐酸吡哆醇2.9mg/l；

核黄素盐酸0.89mg/l；

酒石酸胆碱19mg/l；

2-巯基乙醇4mg/l；

硫胺素2.3mg/l；

维生素b120.2mg/l；

铁0.16mg/l；

钴0.17mg/l；

糖醇4.3mg/l；

纤维素7.5mg/l；

维生素e2.6mg/l；

2-氨基吡啶0.46mg/l；

白介素-20.56mg/l；

白介素-210.81mg/l。

制备方法：根据各原料物质的溶解特性分类溶解，然后于24℃混合，调节混合液的ph值至7.21，定容即得。

实施例2

l-精氨酸125mg/l；

l-门冬氨酸200mg/l；

l-胱氨酸二盐酸盐110mg/l；

l-苯丙氨酸35mg/l；

l-脯氨酸96mg/l；

l-苏氨酸105mg/l；

l-酪氨酸23mg/l；

丁二酸58mg/l；

丙酮酸钠92mg/l；

无水磷酸二氢钠50mg/l；

氯化钾322mg/l；

氯化钠155mg/l；

氯化镁63mg/l；

无水氯化钙88mg/l；

葡萄糖3200mg/l；

还原谷胱甘肽15mg/l；

d-泛酸钙8mg/l；

酚红6mg/l；

叶酸3.6mg/l；

烟酰胺2.2mg/l；

氯化胆碱5mg/l；

盐酸吡哆醇2mg/l；

核黄素盐酸0.8mg/l；

酒石酸胆碱18mg/l；

2-巯基乙醇3mg/l；

硫胺素1.2mg/l；

维生素b120.1mg/l；

铁0.1mg/l；

钴0.1mg/l；

糖醇1.3mg/l；

纤维素6.6mg/l；

维生素e2mg/l；

2-氨基吡啶0.1mg/l；

白介素-20.3mg/l；

白介素-210.6mg/l。

制备方法：根据各原料物质的溶解特性分类溶解，然后于16℃混合，调节混合液的ph值至7.32，定容即得。

实施例3

l-精氨酸250mg/l；

l-门冬氨酸300mg/l；

l-胱氨酸二盐酸盐50mg/l；

l-苯丙氨酸16mg/l；

l-脯氨酸82mg/l；

l-苏氨酸105mg/l；

l-酪氨酸45mg/l；

丁二酸45mg/l；

丙酮酸钠85mg/l；

无水磷酸二氢钠30mg/l；

氯化钾263mg/l；

氯化钠132mg/l；

氯化镁55mg/l；

无水氯化钙82mg/l；

葡萄糖2000mg/l；

还原谷胱甘肽12mg/l；

d-泛酸钙2mg/l；

酚红4mg/l；

叶酸2mg/l；

烟酰胺1mg/l；

氯化胆碱13mg/l；

盐酸吡哆醇3.6mg/l；

核黄素盐酸1.0mg/l；

酒石酸胆碱29mg/l；

2-巯基乙醇6mg/l；

硫胺素3.3mg/l；

维生素b120.3mg/l；

铁0.2mg/l；

钴0.2mg/l；

糖醇5.3mg/l；

纤维素8.5mg/l；

维生素e3.6mg/l；

2-氨基吡啶0.6mg/l；

白介素-20.6mg/l；

白介素-211.1mg/l。

制备方法：根据各原料物质的溶解特性分类溶解，然后于26℃混合，调节混合液的ph值至7.16，定容即得。

培养验证试验：

将培养型nk细胞接种到生物反应器中，反应器参数设置为：温度37℃，转速90rpm/min，溶氧60%，ph值7.25。以市售同类培养基为对照。

试验结果见图1-图3。

自体nk免疫细胞疗法治疗自体肿瘤的方法：抽取患者20-40ml血液，体外分离出少量nk细胞，然后采用本发明nk细胞培养基进行培养，使nk细胞活性达到30%以上，细胞数量达到1010左右。再将活化的nk细胞回输到患者体内，以此来提高患者的免疫力和对癌细胞的杀生能力，从而治疗自体肿瘤。此外，采用相同方法，还可治疗一些慢性病，如糖尿病、高血压、动脉粥样硬化症及通风等。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。