一种基于DNA片段富集及测序技术的产前无创胎儿染色体检测系统的制作方法

本发明涉及染色体异常检测系统，具体的讲，本发明涉及一种基于dna片段特异性富集及第二代测序技术的产前无创胎儿染色体检测系统。

背景技术：

人类遗传病中，染色体疾病是人类最常见的基因疾病，目前因染色体不正常引起的疾病约300多种，这类患者的细胞染色体都具有一定的数目异常或结构异常。对于由染色体变异而导致的遗传疾病，往往不存在有效的治疗手段，因此人们对新生胎儿是否存在染色体变异而患有先天性遗传疾病的重视程度逐渐提高。随着孕妇外周血中游离胎儿dna的发现，无创产前胎儿dna检测技术有效地减少了高风险孕妇因假阳性而受侵入性诊断导致正常胎儿流产或者感染的风险。然而，传统地无创产前胎儿dna检测技术具有相对较大的局限性。

染色体异常是造成大量先天性缺陷(包括精神发育迟缓)的主要原因。异常一般表现为染色体dna重复或缺失，以及染色体非整倍性，后者指的是完全的染色体的异常存在或缺失。当生物体具有少于或多于正常二倍体的染色体数量时，就会产生大量异常特征并因此多种综合征。唐氏综合征，亦称21三体综合征，是染色体非整倍性最常见的例子，包括一条额外的21号染色体。其他常见的染色体非整倍性有13三体综合征、18三体综合征、特纳综合征和克兰菲尔特综合征(klinefelterˊssyndrome)。

唐氏综合征是一种相对常见的遗传障碍，每800个活产婴儿中大约有一个罹患该综合征。该综合征是由额外的全染色体21(三体性21，t21)的存在所致，或较不常见地，由额外的该染色体的大部分的存在所致，涉及其他常染色体的三体性(即t13或t18)也发生在活产婴儿中，但比t21更罕见。通常存在由额外染色体或染色体缺陷所致的胎儿非整倍性的疾病，在母体无细胞血浆dna中的胎儿dna分子群体中产生失调，这是可检测的。开发用于胎儿染色体异常的产前诊断的可靠方法在生殖保健中是一项长期目标，给予通过羊膜穿刺术和绒毛膜绒毛取样而获得胎儿材料的方法是入侵性的，并且对于妊娠具有不可忽视的风险，甚至是有经验的临床医生手中也如此。在目前实践中，这样的入侵性诊断的方法在具有增加唐氏妊娠机会的征兆的情况下被经常使用。

21、13、18染色体非整倍体胎儿的发病率约1/500，携带这些疾病的孩子将来会给家庭和社会带来沉重的负担，对于染色体异常产前检测的选择主要限于有创性方法，这些方法会有致使胎儿丢失的风险。最常用的检测异常的方法是羊膜穿刺术。然而，由于羊膜穿刺术是有创性方法，因此通常只用于高龄产妇，因为高龄产妇的胎儿出现染色体异常的风险有所增加。现有的产前诊断方法处理取样步骤是有创性的，操作也耗时费力。例如，吉姆萨染色法是最广为使用的技术，这种方法要求实验时，细胞处于细胞分裂中期或者正在分裂，没对染色体要染上特征性的明带或者暗带谱。采用这种方法，所有的染色体能够被一一区分并容易展现任何结构上的或数量上的异常性质。吉姆萨染色法不是总能检测出精细的染色体重排。如果怀疑染色体重排，但用这种方法检测不到，进一步的详细分析可以使用荧光原位杂交或图谱核型分析进行。用吉姆萨染色法，测试结果需要一到两周。

因此，建立用于胎儿染色体异常诊断的无创性方法非常有益，目前无创产前检测技术已经应用推广，准确性高达99.9％，绝大部分的染色体非整倍体胎儿都可以被检测出来。然而据卫生部发布的《中国出生缺陷防治报告2012》中指出，我国的胎儿出生缺陷发生率与世界中等输入国家的平均水平接近，约为5.6％，每年新增出生缺陷数约90万例，明显可见的出生缺陷约25万例，约占婴儿比例1.5％，婴儿死因中19.1％是出生缺陷直接导致。而最严重的染色体非整倍体异常只占明显可见的出生缺陷的13％，而其他87％的严重出生缺陷目前还没有有效的检测方法。

中国专利申请2012800108284中公开了一种胎儿性染色体的非侵入性产前基因分型，该发明提供了用于分析母本样品，从而确定孕妇的男性胎儿是否继承了母亲的x连锁突变的方法、仪器和系统。获得样品中胎儿dna的百分率，并确定两种可能性(胎儿继承突变的等位基因或正常的等位基因)的截断值。然后，将x染色体上突变等位基因相对于正常等位基因的比例与截断值相比较，以作出继承了哪个等位基因的分类。备选地，可以将由x染色体上的目标区域得到的等位基因的数量与x染色体上的参照区域的等位基因的数量相比较，从而鉴别缺失或扩增。可以通过计数与胎儿特有的等位基因的反应，并校正数量以说明反应中的统计学分布来计算胎儿dna的百分率。但是该申请公开产前基因分型主要用于检测胎儿是否继承了母亲的x连锁突变，在整个在检测过程中对dna片段的选取是随机的，覆盖深度低，对于染色体上某个特定区域，无法保证一定有dna片段被检测到且有足够数量满足后续分析，所以该方法无法准确的检测小片段的染色体异常。

因此，急需一种不仅可以检测胎儿整条染色体异常，还可以检测染色体上局部片段的扩增和缺失，用于补充出生缺陷的遗传检测系统。

技术实现要素：

为了解决上述面临的技术问题，本发明旨在提供一种基于dna片段特异性富集及第二代测序技术的产前无创胎儿染色体检测的方法、仪器及系统，该检测系统，不仅可以检测胎儿整条染色体的异常，还可以检测染色体上更小片段的重复和缺失。本发明使用的是得自孕妇的血浆样本，在母体血浆中不仅含有较少百分比的胎儿细胞，以及较小百分比的胎儿dna。

一种基于dna片段特异性富集检测产前胎儿染色体异常的方法，该方法包括：

(1)获取孕妇外周血样本，分离样本中的血浆游离dna；

(2)使用人类基因组全部外显子的dna探针或引物对步骤(1)得到的血浆游离dna进行富集，得到dna片段；

(3)对步骤(2)富集到的dna片段进行测序；

(4)根据步骤(3)得到的测序结果，识别测序得到的每个dna序列在人类参考基因组上的位置，对于人类参考基因组上每个目标富集区域，将识别到的该区域的dna序列计数，对于n个不重叠的目标富集区域，得到n个计数，按照人类参考基因组上的位置将n个数排成一个向量a；

(5)将无染色体异常的孕妇的外周血样本，按照与步骤(1)-(4)相同方法计算并计算每个目标富集区域的所有样本的序列数的均值，得出向量b；

(6)使用如下方法得到向量c＝(ci)，其中ai是向量a的第i个元素，bi是向量b的第i个元素；ci是向量c的第i个元素；

ci＝ai/bi

上述步骤(2)中所述的富集为探针杂交捕获的富集方法，该富集方法同时富集母亲和胎儿的特异片段。

上述步骤(3)中所述的测序，其平均测序深度大于100x，即需要富集的基因组序列位置上平均有100个以上dna片段覆盖到。

上述步骤(4)中所述的每个目标富集区域的宽度为50-500碱基。

优选地，上述步骤(4)中所述的每个目标富集区域的宽度为100-400碱基。

本发明还提供了一种基于dna片段特异性富集及第二代测序技术的产前无创胎儿染色体检测系统，包括四个模块：

模块一，获取孕妇外周血样本，分离提取样本中的血浆游离dna，此模块为一套dna提取装置；

模块二，使用人类基因组上一些特定位置的dna探针或引物对模块一得到的血浆游离dna进行富集，得到dna片段，此模块为一套dna富集装置；

模块三，对模块二富集到的dna片段进行测序检测，得到检测好的dna序列，此模块为一台第二代dna测序仪；

模块四，对模块三检测好的dna序列进行数据处理，此包含一台计算机及9个计算程序：

程序一，此程序为一序列定位程序，将序列定位于长序列上，找到合适的位置，人类基因组是24个长序列，检测得到的dna序列是数百万个短序列；

程序二，调用程序二，使用定位于人类基因组上的dna数量进行性别计算；

程序三，如果是男性胎儿，调用程序三对每个染色体上的dna片段含量定量；

程序四，如果是男性胎儿，调用程序四对每个染色体上每百万碱基长度区域上的dna片段含量定量；

程序五，如果是男性胎儿，调用程序五对胎儿每个染色体上目标富集区域的碱基定型；

程序六，如果是女性胎儿，调用程序六对每个染色体上的dna片段含量定量；

程序七，如果是女性胎儿，调用程序七对每个染色体上每百万碱基长度区域上的dna片段含量定量；

程序八，如果是女性胎儿，调用程序八对胎儿每个染色体上目标富集区域的碱基定型；

程序九，调用程序九对母体每个染色体上目标富集区域的碱基定型。

在一个具体实施例中，提供了一种基于dna片段特异性富集检测产前胎儿染色体异常的方法，该方法包括：

(1)获取孕妇外周血样本，使用模块一中的dna提取装置，分离提取出外周血样本中的血浆游离dna，得到血浆游离dna；

(2)使用模块二中的dna富集装置以及人类基因组上的dna探针或引物对步骤(1)中得到的血浆游离dna进行富集，得到dna片段；

(3)使用模块三中的第二代dna测序仪对步骤(2)中得到的dna片段进行测序，得到检测好的dna序列；

(4)使用计算机以及9个程序对步骤(3)中得到的检测好的dna序列进行数据处理：

程序一，此程序为一序列定位程序，将模块三中得到的检测好的dna序列定位于人类基因组上，检测得到的dna序列是数百万个短序列；

程序二，调用程序二，使用定位于人类基因组上的dna数量进行性别计算；

程序三，如果是男性胎儿，调用程序三对每个染色体上的dna片段含量定量；

程序四，如果是男性胎儿，调用程序四对每个染色体上每百万碱基长度区域上的dna片段含量定量；

程序五，如果是男性胎儿，调用程序五对胎儿每个染色体上目标富集区域的碱基定型；

程序六，如果是女性胎儿，调用程序六对每个染色体上的dna片段含量定量；

程序七，如果是女性胎儿，调用程序七对每个染色体上每百万碱基长度区域上的dna片段含量定量；

程序八，如果是女性胎儿，调用程序八对胎儿每个染色体上目标富集区域的碱基定型；

程序九，调用程序九对母体每个染色体上目标富集区域的碱基定型。

上述步骤(2)中所述的dna探针为exome中的探针，通过exome的测序数据，进行胎儿基因组中较大片段的基因拷贝数变异(cnv)的计算；

上述胎儿基因组中基因拷贝数变异(cnv)的计算还包括13、18和21号染色体三体概率的计算。

上述dna探针的捕获区域还包括encode区域、tfbs区域和ncrna&sirna区域。

上述dna探针的长度为1-3万个基因的编码蛋白产物的序列。

本发明在实施过程中为了精确检测基因拷贝数变异，可以在基因组任何范围选择一定数量的探针，优选地可以在基因组中1-10m的固定区内选择一定数量的探针；再优选为在基因组中1m、2m、3m、5m和10m的固定区内选择一定数量的探针。

上述步骤(2)中所述的富集为探针杂交捕获的富集方法，该富集方法同时富集母亲和胎儿的特异片段。

步骤(3)中所述的测序采用第二代高通量测序技术，其平均测序深度大于100x。

所述的染色体异常为dna重复或dna缺失。

其中，所述的染色体异常为非整倍性；所述的非整倍性为21三体、18三体或13三体。

在一个具体实施例中，提供了一种基于dna片段特异性富集检测产前胎儿染色体异常的方法，该方法包括：

模块一：

a、用streck公司的cell-freednabct试管采集孕12周的待测孕妇的血液5ml；

b、使用qiagen公司的qiaampcirculatingnucleicacidkit试剂盒提取步骤a采集血液血浆中的游离dna；

c、使用kapabiosystems公司的kapahyperprepkit试剂盒对步骤b提取出的血浆游离dna构建文库；

模块二：

使用roche公司的seqcapezhumanexomeprobesv3.0dna捕获试剂盒富集模块一得到的dna文库中的人外显子序列；

模块三：

使用illumina公司的nextseq500型号高通量测序仪器对模块二中富集后的人外显子序列测定32g碱基的数据，dna序列长度为双端150长度，得到dna序列；

模块四：

a、使用程序一bwa软件将模块三检测得到的dna序列定位于人类基因组hg19上；

b、使用程序二和程序一的结果，计算胎儿性别，得到胎儿性别男性；

c、使用程序三、四、五、九和程序一的结果进行计算得到胎儿染色体整体定量、染色体局部区域定量、目标富集区域胎儿dna碱基定型、目标富集区域母体dna碱基定型。

本发明与现有技术相比，有益效果在于：

(1)本申请公开了一种基于dna片段特异性富集及产前胎儿染色体异常检测系统，该申请中使用dna富集技术，并将该技术应用到孕妇血浆游离dna检测胎儿染色体异常精确度高。

(2)本申请中公开的检测系统，富集dna操作中使用探针杂交捕获的富集方法，该富集方法同时富集母亲和胎儿的特异片段，而无需仅对胎儿dna进行富集。

(3)本申请提供的检测系统不仅实现了胎儿整条染色体含量的检测，还实现了胎儿局部染色体含量的检测。

(4)本发明提供的检测系统实现了同时检测胎儿dna碱基型和母体dna碱基型的检测。

附图说明

图1为本发明公开的基于dna片段富集及胎儿染色体检测系统流程图。

具体实施方式

实施例1一种基于dna片段特异性富集检测产前胎儿染色体异常的方法，该方法包括：

(1)获取孕妇外周血样本，分离样本中的血浆游离dna；

(2)使用人类基因组全部外显子的dna探针或引物对步骤(1)得到的血浆游离dna进行探针杂交捕获富集，同时富集得到母亲和胎儿的dna片段；

(3)对步骤(2)富集到的dna片段进行测序，平均测序深度大于100x，即需要富集的基因组序列位置上平均有100个以上dna片段覆盖到；

(4)根据步骤(3)得到的测序结果，识别测序得到的每个dna序列在人类参考基因组上的位置，对于人类参考基因组上每个目标富集区域，将识别到的该区域的dna序列计数，对于n个不重叠的目标富集区域，得到n个计数，按照人类参考基因组上的位置将n个数排成一个向量a；

(5)将无染色体异常的孕妇的外周血样本，按照与步骤(1)-(4)相同方法计算并计算每个目标富集区域的所有样本的序列数的均值，得出向量b；

(6)使用如下方法得到向量c＝(ci)，其中ai是向量a的第i个元素，bi是向量b的第i个元素；ci是向量c的第i个元素；

ci＝ai/bi

上述步骤(4)中所述的每个目标富集区域的宽度为50-500碱基。

实施例2一种基于dna片段特异性富集及第二代测序技术的产前无创胎儿染色体检测系统，包括四个模块：

模块一，获取孕妇外周血样本，分离提取样本中的血浆游离dna，此模块为一套dna提取装置；

模块二，使用人类基因组上一些特定位置的dna探针或引物对模块一得到的血浆游离dna进行富集，得到dna片段，此模块为一套dna富集装置；

模块三，对模块二富集到的dna片段进行测序检测，得到检测好的dna序列，此模块为一台第二代dna测序仪；

模块四，对模块三检测好的dna序列进行数据处理，此包含一台计算机及9个计算程序：

程序一，此程序为一序列定位程序，将序列定位于长序列上，找到合适的位置，人类基因组是24个长序列，检测得到的dna序列是数百万个短序列；

程序二，调用程序二，使用定位于人类基因组上的dna数量进行性别计算；

程序三，如果是男性胎儿，调用程序三对每个染色体上的dna片段含量定量；

程序四，如果是男性胎儿，调用程序四对每个染色体上每百万碱基长度区域上的dna片段含量定量；

程序五，如果是男性胎儿，调用程序五对胎儿每个染色体上目标富集区域的碱基定型；

程序六，如果是女性胎儿，调用程序六对每个染色体上的dna片段含量定量；

程序七，如果是女性胎儿，调用程序七对每个染色体上每百万碱基长度区域上的dna片段含量定量；

程序八，如果是女性胎儿，调用程序八对胎儿每个染色体上目标富集区域的碱基定型；

程序九，调用程序九对母体每个染色体上目标富集区域的碱基定型。

实施例3一种基于dna片段特异性富集检测产前胎儿染色体异常的方法，该方法包括：

(1)获取孕妇外周血样本，使用模块一中的dna提取装置，分离提取出外周血样本中的血浆游离dna，得到血浆游离dna；

(2)使用模块二中的dna富集装置以及人类基因组上的dna探针或引物对步骤(1)中得到的血浆游离dna进行富集，得到dna片段；

(3)使用模块三中的第二代dna测序仪对步骤(2)中得到的dna片段进行测序，得到检测好的dna序列；

(4)使用计算机以及9个程序对步骤(3)中得到的检测好的dna序列进行数据处理：

程序一，此程序为一序列定位程序，将模块三中得到的检测好的dna序列定位于人类基因组上，检测得到的dna序列是数百万个短序列；

程序二，调用程序二，使用定位于人类基因组上的dna数量进行性别计算；

程序三，如果是男性胎儿，调用程序三对每个染色体上的dna片段含量定量；

程序四，如果是男性胎儿，调用程序四对每个染色体上每百万碱基长度区域上的dna片段含量定量；

程序五，如果是男性胎儿，调用程序五对胎儿每个染色体上目标富集区域的碱基定型；

程序六，如果是女性胎儿，调用程序六对每个染色体上的dna片段含量定量；

程序七，如果是女性胎儿，调用程序七对每个染色体上每百万碱基长度区域上的dna片段含量定量；

程序八，如果是女性胎儿，调用程序八对胎儿每个染色体上目标富集区域的碱基定型；

程序九，调用程序九对母体每个染色体上目标富集区域的碱基定型。

上述步骤(2)中所述的dna探针为exome中的探针，通过exome的测序数据，进行胎儿基因组中较大片段的基因拷贝数变异(cnv)的计算；

上述dna探针的捕获区域还包括encode区域、tfbs区域和ncrna&sirna区域。

上述dna探针的长度为1-3万个基因的编码蛋白产物的序列。

上述步骤(2)中所述的富集为探针杂交捕获的富集方法，该富集方法同时富集母亲和胎儿的特异片段。

实施例4一种基于dna片段特异性富集检测产前胎儿染色体异常的方法，该方法包括：

模块一：

a、用streck公司的cell-freednabct试管采集孕12周的待测孕妇的血液5ml；

b、使用qiagen公司的qiaampcirculatingnucleicacidkit试剂盒提取步骤a采集血液血浆中的游离dna；

c、使用kapabiosystems公司的kapahyperprepkit试剂盒对步骤b提取出的血浆游离dna构建文库；

模块二：

使用roche公司的seqcapezhumanexomeprobesv3.0dna捕获试剂盒富集模块一得到的dna文库中的人外显子序列；

模块三：

使用illumina公司的nextseq500型号高通量测序仪器对模块二中富集后的人外显子序列测定32g碱基的数据，dna序列长度为双端150长度，得到dna序列；

模块四：

a、使用程序一bwa软件将模块三检测得到的dna序列定位于人类基因组hg19上；

b、使用程序二和程序一的结果，计算胎儿性别，得到胎儿性别男性；

c、使用程序三、四、五、九和程序一的结果进行计算得到胎儿染色体整体定量、染色体局部区域定量、目标富集区域胎儿dna碱基定型、目标富集区域母体dna碱基定型。