本发明属于生物发酵技术领域，特别涉及一种可降解有机磷农药的侧孢芽孢杆菌的发酵工艺研究。
背景技术：
自从有机磷农药面世以来，其生产和应用已有70余年的历史。作为一类高效、广谱的农药制剂，有机磷农药被广泛大量应用到农业生产上，在很大程度上提高了农作物的产量，成为全球农业增产增收的重要保证，也为解决人口增长与粮食短缺问题做出巨大贡献。目前，世界上有机磷农药商品己达上百种，是国内外应用最广泛的一类农药。我国是农业大国，也是世界上农药使用量最大的国家。据不完全统计，我国平均每年大约使用25万吨农药，其中有机磷农药就有三十余种，包括杀虫剂、杀菌剂、除草剂等。我国有机磷农药的产量占全国农药总量的一半以上，占全世界总产量的1/3。然而，随着农业可持续发展理念的形成、发展和深入，随着人们对环境质量、生态平衡、健康标准评价尺度的提高。有机磷农药的危害引起了全世界的广泛关注，并由此在一定程度上限制了某些有机磷农药品种的生产和销售，甚至停产。
水胺硫磷化学名称为o-甲基-o-(邻异丙氧羟基苯基)硫代磷酞胺，英文名isocarbophos。是德国拜耳公司60年代开发成功的，水胺硫磷是目前国内及发展中国家使用较多的农药。我国在80年代工业化生产，目前国内己有十多家生产厂，年产量达2万吨。水胺硫磷是高效、广谱的有机磷杀虫、杀瞒剂，杀卵作用强，广泛应用于粮食作物、棉花、果树、林木、牧草等作物，也可用于蔬菜、已结果实的果树、近期将采收的茶树、烟草、中草药等作物。
陈碧娟、李永琪等分别报道了水胺硫磷对海洋藻类、贝类、甲壳类动物、梭鱼和成体中国对虾具有毒性。杨远和等研究表明0.1%-0.7%的水胺硫磷可经过完整的皮肤进入机体，在未发生皮肤损伤的情况下造成机体中毒。冯忻等采用田间喷施试验方法，研究了水胺硫磷与甲基对硫磷在苹果中的残留动态，结果表明，水胺硫磷与甲基对硫磷相比具有高残留、消解慢的特点，尤其是在果肉中，残留量更高。
随着甲胺磷、对硫磷等剧毒农药的禁用，水胺硫磷这类高毒性农药的生产和使用量呈上升趋势，因此研究水胺硫磷等有机磷农药的生物降解具有重要意义。国内对水胺硫磷生物降解的研究仅有同济医科大学环境医学研究所的赵金辉等人进行过，在国外由于水胺硫磷的高毒性，发达国家已经禁用，对其降解研究也较少，目前仅发现黄杆菌和动性球菌属的微生物能够降解水胺硫磷。
有机磷农药的消除方法主要有物理的、化学的、生物的方法。其中生物方法具有方便、快捷、有效的优点，不会造成二次污染。已经成为研究农药分解的首选方法。生物降解有机磷农药主要是利用微生物及其产物进行生物修复，是消除和解毒高浓度农药残留和中毒的一种安全、有效、快捷、廉价的方法。
自1973年sethunathan&yoshida等人报道黄杆菌具有降解二嗦味和对硫磷的能力以来，对微生物降解有机磷农药的研究迅速展开。尽管只有短短的40余年，却取得了巨大的成效。最初的几年(1973-1984)，研究多集中在对降解剧毒有机磷农药的菌株的筛选和选育方面上，如:munnecke等(1974)分离到一株具有降解对硫磷的作用的假单胞菌((pseudomonas)。brown等(1979)分离到一株能够降解对硫磷黄杆菌(flavobacterium)。1985年以后，对微生物降解有机磷农药的研究已经进入酶和基因的水平，同时不断有新的降解有机磷农药的菌株被报道。
总之，微生物降解有机磷农药的研究已取得很大进展，但由于有机磷农药污染的特殊性，实际应用仍有许多困难。今后可以着重在基因工程方面的研究，能将多种降解基因共同转化到同一微生物细胞内，将得到高效广谱降解有机磷农药的“超级菌”，来更有效地消除农药对环境的污染。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供一种可降解有机磷农药的侧孢芽孢杆菌的发酵工艺研究。将本株侧孢芽孢杆菌首先在实验室中进行了降解农药特性、降解条件、产生的具有降解作用酶的相关研究。
本发明是通过如下技术方案实现的，本发明提供一种可降解有机磷农药的侧孢芽孢杆菌的发酵工艺研究，通过以下步骤完成：（1）种子液制备；（2）含水胺硫磷农药培养基的配制及接种；（3）水胺硫磷降解率的测定；（4）实验菌株降解有机磷农药特性的研究；（5）实验菌株降解水胺硫条件的研究；（6）实验菌株降解有机磷农药酶的研究；（7）水胺硫磷降解产物及降解途径的研究；（8）菌株的使用安全性实验。
作为优选，步骤（2）含水胺硫磷农药培养基的配制及接种：将配制好的无机盐液体培养基分装至250ml的三角瓶中，每瓶装量为50ml，灭菌后待温度降到室温时，在超净操工作台中，每瓶培养基中加入水胺硫磷50ml，再加入活化好的菌液5ml；每处理重复3次，对照加入等量的不接菌的培养液，按上述方法配制培养基并接种，30℃180r/min震荡培养84h。
作为优选，步骤（3）水胺硫磷降解率的测定：分别取样测定培养前后培养液中的无机磷及总磷含量，并计算出实验菌株对有机磷农药的降解率，以不接菌的培养基作对照。
作为优选，步骤（4）实验菌株降解有机磷农药特性的研究：分别对实验菌株进行降解水胺硫磷遗传稳定性试验、对水胺硫磷耐受性试验、对辛硫磷、甲拌磷等多种农药对比性试验。
作为优选，步骤（5）实验菌株降解水胺硫条件的研究：分别对实验菌株进行碳氮比、不同温度、接菌量、金属离子等条件下降解水胺硫情况进行试验；
作为优选，步骤（6）实验菌株降解有机磷农药酶的研究：对实验菌株进行降解有机磷农药酶的类型、酶在细胞中分部、酶的提取及纯化进行相关的实验。
侧孢芽孢杆菌具有多种生物活性，具有很高的功能性和实用性价值，在农业、养殖业等有广阔的应用前景。为了更加充分的开发利用侧孢芽孢杆菌的生物活性，可以从以下几个方面加强研究：1、对该菌进行遗传改造，提高其应用效力；2、加大对侧孢芽孢杆菌的杀虫活性、杀虫机理的研究，来解决部分害虫对转基因抗虫植物的抗性问题；3、对其产生的抑菌物质进行深入的研究，以便在农业、医药、食品等行业的推广应用；4、通过遗传育种、基因工程等方面的技术提高侧孢芽孢杆菌降解有机磷农药的能力。
本发明的有益效果是：
本研究以农田喷洒农药的浓度来研究本菌株对有机磷农药降解作用的研究，以进一步了解农药喷洒剂量对生物菌肥生产本菌株的影响及该菌对有机磷农药的降解能力，研究实验效果明显，实验操作简单，生长状况改善、环境改善、经济效益显著。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分所介绍的，微生物降解有机磷农药的研究已取得很大进展，但由于有机磷农药污染的特殊性，实际应用仍有许多困难。今后可以着重在基因工程方面的研究，能将多种降解基因共同转化到同一微生物细胞内，将得到高效广谱降解有机磷农药的“超级菌”，来更有效地消除农药对环境的污染。
一种可降解有机磷农药的侧孢芽孢杆菌的发酵工艺研究，通过以下步骤完成：（1）种子液制备；（2）含水胺硫磷农药培养基的配制及接种；（3）水胺硫磷降解率的测定；（4）实验菌株降解有机磷农药特性的研究；（5）实验菌株降解水胺硫条件的研究；（6）实验菌株降解有机磷农药酶的研究；（7）水胺硫磷降解产物及降解途径的研究；（8）菌株的使用安全性实验。
步骤（2）含水胺硫磷农药培养基的配制及接种：将配制好的无机盐液体培养基分装至250ml的三角瓶中，每瓶装量为50ml，灭菌后待温度降到室温时，在超净操工作台中，每瓶培养基中加入水胺硫磷50ml，再加入活化好的菌液5ml；每处理重复3次，对照加入等量的不接菌的培养液，按上述方法配制培养基并接种，30℃180r/min震荡培养84h。
步骤（3）水胺硫磷降解率的测定：分别取样测定培养前后培养液中的无机磷及总磷含量，并计算出实验菌株对有机磷农药的降解率，以不接菌的培养基作对照。
步骤（4）实验菌株降解有机磷农药特性的研究：分别对实验菌株进行降解水胺硫磷遗传稳定性试验、对水胺硫磷耐受性试验、对辛硫磷、甲拌磷等多种农药对比性试验。
步骤（5）实验菌株降解水胺硫条件的研究：分别对实验菌株进行碳氮比、不同温度、接菌量、金属离子等条件下降解水胺硫情况进行试验；
步骤（6）实验菌株降解有机磷农药酶的研究：对实验菌株进行降解有机磷农药酶的类型、酶在细胞中分部、酶的提取及纯化进行相关的实验。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
实施例
山东省主要农作物为玉米、小麦和水稻，所以选取水稻作为实验对象。将本株侧孢芽孢杆菌生产制成微生物菌肥和液体菌剂，在水稻播种、生长期间分别施用本菌株制成的微生物菌肥和液体菌剂，检测土壤中和作物上残留农药含量。
侧孢芽孢杆菌分解有机磷农药的田间实验研究，包括如下实验：（1）微生物菌肥和液体菌剂的制备；（2）田间对照组实验的选择和设计；（3）播种前土壤农药残留的检测；（4）水稻生长期间农药的施用与菌剂的施用；（5）菌剂施用前后，土壤、作物上农药的残留检测；（6）大米残留农药的检测；（7）实验结果分析。（8）菌剂、菌肥田间施用安全性试验。
水稻生长状况及有机磷农药残留评价，对水稻生长状况、农药残留、环境改善等方面进行评价。
（1）水稻生长状况指标：统计实验期间水稻的病虫害、亩产量、株高、成熟时间、稻粒饱满程度。
（2）有机磷农药残留指标：对施用菌肥前后土壤中有机磷农药残留量、生长中后期土壤中残留量、施用液体菌剂前后植株残留农药量、脱壳大米上农药残留量进行检测。
（3）环境改善指标：对施用菌肥、菌剂后农田周围野生植物、昆虫、小动物等进行取样检测农药残留以及种类、数量的统计。
（4）经济效益指标：因为国家制定相关法律，有机磷农药残留超标的农作物将不能进入市场。再施用侧孢芽孢杆菌菌肥、菌剂后，统计作物成本和效益，并与未使用农田进行比较。
当然，上述说明也并不仅限于上述举例，本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述；以上实施例仅用于说明本发明的技术方案并非是对本发明的限制，参照优选的实施方式对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换都不脱离本发明的宗旨，也应属于本发明的权利要求保护范围。