本发明涉及提高微藻中虾青素含量的方法。
背景技术：
：雨生红球藻被公认为自然界中生产天然虾青素的最好生物，因此，利用这种微藻提取虾青素无疑具有广阔的发展前景，已成为国际上天然虾青素生产的研究热点。雨生红球藻于自然界中主要生长分布在小的水塘和雨后积水形成的小的临时性水泡中，是自然界中合成和积累虾青素最多的微生物。雨生红球藻对环境的适应能力极强：在适宜的生长条件下，它以带鞭毛的游动细胞进行快速的生长繁殖；而当条件变得恶劣时，雨生红球藻的游动细胞就会失去鞭毛，细胞壁加厚，同时积累大量的红色物质，细胞由此进入休眠状态。休眠40年后细胞仍有活性，在适宜的条件下，还能繁殖产生新的绿色细胞。目前尚未有人研究将碘化物作为催化剂，将硫酸铜作为氧化剂，用以提高微藻中虾青素含量。微藻生长分为游动生长阶段和不动生长阶段两个阶段，游动生长阶段主要蓄积营养物质和能量，不动生长阶段为促进微藻中营养物质和能量向虾青素转变。由此可见，处理游动生长阶段和不动生长阶段的微藻，均会对虾青素的含量造成影响。目前尚未有，将微藻生长的两个阶段分别处理，以提高微藻中虾青素含量的方法。技术实现要素：本发明提供提高微藻中虾青素含量的方法，解决技术问题是将碘化物和硫酸铜应用于微藻培养中，以提高微藻中虾青素的含量。为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：提高微藻中虾青素含量的方法，将游动生长阶段微藻培养液接种至缺氮培养基中，置于封闭式光生物反应器中，进行培养，至微藻培养液转变为红色，且颜色不再发生明显改变，即得不动生长阶段微藻培养液，缺氮培养基中含有碘化物和硫酸铜。优选地，所述缺氮培养基是缺氮bg11培养基或缺氮bm培养基中的一种。优选地，缺氮培养基的的ph是3.5～5.5。优选地，所述碘化物为碘化钾和碘化钠中的一种或任意比例的几种；缺氮培养基、碘化物和硫酸铜的质量比是999.75～999.945:0.005～0.05:0.05～0.2。优选地，培养条件为培养温度28～32℃；光照强度为100～200μmol/(m2·s)；二氧化碳浓度为10～15%。优选地，游动生长阶段微藻培养液按照以下步骤制得：将微藻接种至培养基中，置于封闭式光生物反应器中，进行培养，得游动生长阶段微藻培养液；所述微藻是小球藻、杜氏盐藻和雨生红球藻中的一种或任意比例的几种。优选地，培养基中含有三磷酸腺苷。优选地，培养基中还含有甘氨酸组分；所述甘氨酸组分是甘氨酸、甘氨酸钠和甘氨酸钾中的一种或任意比例的几种。优选地，所述培养基为bg11或bm中的一种；培养基和三磷酸腺苷的质量比是999.95～999.99:0.01～0.05；或，培养基、三磷酸腺苷和甘氨酸组分的质量比是999.95～999.99:0.01～0.05:0.01～0.05。优选地，培养条件为培养温度18～27℃；光照强度为60～90μmol/(m2·s)；二氧化碳浓度为2～10%；培养4～7天。发明具有以下有益技术效果：本发明将atp应用于游动生长阶段微藻培养液中，可提高微藻中虾青素的含量。具体实施方式下面结合具体实例进一步说明本发明。实施例1提高微藻中虾青素含量的方法，将游动生长阶段微藻培养液接种至缺氮培养基中，置于封闭式光生物反应器中，进行培养，至微藻培养液转变为红色，且颜色不再发生明显改变，即得不动生长阶段微藻培养液，缺氮培养基中含有碘化物和硫酸铜。所述缺氮培养基是缺氮bg11培养基。缺氮培养基的的ph是6.0。所述碘化物为碘化钾；缺氮培养基、碘化钾和硫酸铜的质量比是999.945:0.005:0.05。培养条件为培养温度30℃；光照强度为150μmol/(m2·s)；二氧化碳浓度为14%。游动生长阶段微藻培养液按照以下步骤制得：将微藻接种至培养基中，置于封闭式光生物反应器中，进行培养，得游动生长阶段微藻培养液；培养条件为培养温度20℃；光照强度为80μmol/(m2·s)；二氧化碳浓度为6%；培养7天。所述培养基为bg11。实施例2提高微藻中虾青素含量的方法，将游动生长阶段微藻培养液接种至缺氮培养基中，置于封闭式光生物反应器中，进行培养，至微藻培养液转变为红色，且颜色不再发生明显改变，即得不动生长阶段微藻培养液，缺氮培养基中含有碘化物和硫酸铜。所述缺氮培养基是缺氮bg11培养基。缺氮培养基的的ph是4.5。所述碘化物为碘化钾；缺氮培养基、碘化钾和硫酸铜的质量比是999.945:0.005:0.05。培养条件为培养温度30℃；光照强度为150μmol/(m2·s)；二氧化碳浓度为14%。游动生长阶段微藻培养液按照以下步骤制得：将微藻接种至培养基中，置于封闭式光生物反应器中，进行培养，得游动生长阶段微藻培养液；培养条件为培养温度20℃；光照强度为80μmol/(m2·s)；二氧化碳浓度为6%；培养7天。所述培养基为bg11。实施例3提高微藻中虾青素含量的方法，将游动生长阶段微藻培养液接种至缺氮培养基中，置于封闭式光生物反应器中，进行培养，至微藻培养液转变为红色，且颜色不再发生明显改变，即得不动生长阶段微藻培养液，缺氮培养基中含有碘化物和硫酸铜。所述缺氮培养基是缺氮bg11培养基。缺氮培养基的的ph是4.5。所述碘化物为碘化钾；缺氮培养基、碘化钾和硫酸铜的质量比是999.945:0.005:0.05。培养条件为培养温度30℃；光照强度为150μmol/(m2·s)；二氧化碳浓度为14%。游动生长阶段微藻培养液按照以下步骤制得：将微藻接种至培养基中，置于封闭式光生物反应器中，进行培养，得游动生长阶段微藻培养液；培养条件为培养温度20℃；光照强度为80μmol/(m2·s)；二氧化碳浓度为6%；培养7天。所述培养基为bg11，所述培养基为bg11中含有三磷酸腺苷；培养基bg11和三磷酸腺苷的质量比是999.99:0.01。实施例4提高雨生红球藻中虾青素含量的方法，将雨生红球藻接种至培养基中，置于封闭式光生物反应器中，进行培养，得游动生长阶段雨生红球藻培养液，培养基中含有三磷酸腺苷；培养条件为培养温度20℃；光照强度为80μmol/(m2·s)；二氧化碳浓度为6%；培养7天。培养基中还含有甘氨酸组分；所述甘氨酸组分是甘氨酸钾。所述培养基为bg11；培养基、三磷酸腺苷和甘氨酸组分的质量比是999.98:0.01:0.01。将游动生长阶段雨生红球藻培养液接种至缺氮培养基中，置于封闭式光生物反应器中，进行培养，至雨生红球藻培养液转变为红色，且颜色不再发生明显改变，即得不动生长阶段雨生红球藻培养液；培养条件为培养温度30℃；光照强度为150μmol/(m2·s)；二氧化碳浓度为14%。所述缺氮培养基是缺氮bg11培养基。缺氮培养基的的ph是4.5。缺氮培养基中还包括碘化钾和硫酸铜；缺氮培养基、碘化钾和硫酸铜的质量比是999.945:0.005:0.05。实施例5提高雨生红球藻中虾青素含量的方法，将雨生红球藻接种至培养基中，置于封闭式光生物反应器中，进行培养，得游动生长阶段雨生红球藻培养液，培养基中含有三磷酸腺苷；培养条件为培养温度20℃；光照强度为80μmol/(m2·s)；二氧化碳浓度为6%；培养7天。培养基中还含有甘氨酸组分；所述甘氨酸组分是甘氨酸钾。所述培养基为bg11；培养基、三磷酸腺苷和甘氨酸组分的质量比是999.98:0.01:0.01。将游动生长阶段雨生红球藻培养液接种至缺氮培养基中，置于封闭式光生物反应器中，进行培养，至雨生红球藻培养液转变为红色，且颜色不再发生明显改变，即得不动生长阶段雨生红球藻培养液；培养条件为培养温度30℃；光照强度为150μmol/(m2·s)；二氧化碳浓度为14%。所述缺氮培养基是缺氮bg11培养基。缺氮培养基的的ph是4.5。实施例6将游动生长阶段微藻培养液接种至缺氮培养基中，置于封闭式光生物反应器中，进行培养，至微藻培养液转变为红色，且颜色不再发生明显改变，即得不动生长阶段微藻培养液，缺氮培养基中含有碘化物和硫酸铜。实施例7提高小球藻中虾青素含量的方法，将小球藻接种至培养基中，置于封闭式光生物反应器中，进行培养，得游动生长阶段小球球藻培养液，培养基中含有三磷酸腺苷；培养条件为培养温度18℃；光照强度为60μmol/(m2·s)；二氧化碳浓度为3%；培养5天。培养基中还含有甘氨酸组分；所述甘氨酸组分是甘氨酸钾。所述培养基为bm；培养基、三磷酸腺苷和甘氨酸组分的质量比是999.98:0.04:0.05。将游动生长阶段小球藻培养液接种至缺氮培养基中，置于封闭式光生物反应器中，进行培养，至小球藻培养液转变为红色，且颜色不再发生明显改变，即得不动生长阶段小球藻培养液；培养条件为培养温度28℃；光照强度为120μmol/(m2·s)；二氧化碳浓度为11%。所述缺氮培养基是缺氮bg11培养基。缺氮培养基的的ph是3.6。缺氮培养基中还包括碘化钠和硫酸铜；缺氮培养基、碘化钠和硫酸铜的质量比是999.912:0.008:0.08。实施例8提高杜氏盐藻中虾青素含量的方法，将杜氏盐藻接种至培养基中，置于封闭式光生物反应器中，进行培养，得游动生长阶段杜氏盐藻培养液，培养基中含有三磷酸腺苷；培养条件为培养温度25℃；光照强度为70μmol/(m2·s)；二氧化碳浓度为4%；培养6天。培养基中还含有甘氨酸组分；所述甘氨酸组分是甘氨酸钾和甘氨酸钠按照质量比1:1的组合物。所述培养基为bg11；培养基、三磷酸腺苷和甘氨酸组分的质量比是999.97:0.01:0.02。将游动生长阶段杜氏盐藻培养液接种至缺氮培养基中，置于封闭式光生物反应器中，进行培养，至杜氏盐藻培养液转变为红色，且颜色不再发生明显改变，即得不动生长阶段杜氏盐藻培养液；培养条件为培养温度31℃；光照强度为180μmol/(m2·s)；二氧化碳浓度为15%。所述缺氮培养基是缺氮bg11培养基。缺氮培养基的的ph是4.2。缺氮培养基中还包括碘化钾、碘化钠和硫酸铜；缺氮培养基、碘化钾、碘化钠和硫酸铜的质量比是999.895:0.005:0.01:0.1。实施例9提高雨生红球藻中虾青素含量的方法，将雨生红球藻接种至培养基中，置于封闭式光生物反应器中，进行培养，得游动生长阶段雨生红球藻培养液，培养基中含有三磷酸腺苷；培养条件为培养温度22℃；光照强度为85μmol/(m2·s)；二氧化碳浓度为7%；培养7天。培养基中还含有甘氨酸组分；所述甘氨酸组分是甘氨酸钠。所述培养基为bm；培养基、三磷酸腺苷和甘氨酸组分的质量比是999.93:0.03:0.04。将游动生长阶段微藻培养液接种至缺氮培养基中，置于封闭式光生物反应器中，进行培养，至微藻培养液转变为红色，且颜色不再发生明显改变，即得不动生长阶段微藻培养液；培养条件为培养温度32℃；光照强度为200μmol/(m2·s)；二氧化碳浓度为12%。所述缺氮培养基是缺氮bg11培养基。缺氮培养基的的ph是5.5。缺氮培养基中还包括碘化钾和硫酸铜；缺氮培养基、碘化钾和硫酸铜的质量比是999.845:0.005:0.15。实施例10提高微藻中虾青素含量的方法，将微藻接种至培养基中，置于封闭式光生物反应器中，进行培养，得游动生长阶段微藻培养液，培养基中含有三磷酸腺苷。将游动生长阶段微藻培养液接种至缺氮培养基中，置于封闭式光生物反应器中，进行培养，至微藻培养液转变为红色，且颜色不再发生明显改变，即得不动生长阶段微藻培养液。下面结合实验数据进一步说明本发明的有益效果：实验一1、实验供试材料1材料与方法：1.1试验地点：烟台广源食品检测有限公司。1.2实验检测：虾青素含量。1.3供试材料：实施例1、实施例2、实施例3和实施例4。1.4检测方法：制备样品：1）分别取空白（除缺氮培养基中不含有碘化物和硫酸铜外，其它制备条件均与实施例1一致）、实施例1、实施例2、实施例3和实施例4制备的不动生长阶段雨生红球藻培养液，按照细胞总od630mm=5计算每个样品的体积置于离心机中，以4500rpm的转速，在4℃条件下离心8.5min，弃上清液；2）将离心得到的藻细胞用ph6.8的pbs吹洗，转移到1.5mep管中，以4500rpm的转速，在4℃条件下离心8.5min，弃上清液；3）加入适量直径0.2mm氧化锆珠于ep管中，并加入300μl丙酮，将其置于细胞破碎仪中，使用细菌芽胞模式进行破碎，4000r/min，破碎3min，间隔时间1min；4）将破碎后的细胞加入200μl丙酮后静置5min，放入离心机中，以13000rpm转速离心3min，取上清液转移到另一离心管中；5）加500μl丙酮到ep管内充分提取虾青素，以3000rpm转速离心3min，取上清液转移到另一离心管中，再重复一次；6）将三次得到的上清液混合，定容到1.5ml，置于-80℃冰箱中以待hplc检测。虾青素含量检测：将检测到的紫外波长467nm下的峰面积进行加和，利用虾青素标准曲线计算样品中虾青素含量。1）高效液相色谱中流动相由二氯甲烷、乙腈和甲醇按照7:2:1的体积比进行混合，色谱柱为c18柱，填充颗粒大小为5μm，色谱柱内径4.6mm，长度250mm；2）采用等度洗脱的方式进行洗脱，总的运行时间为32min，样品注射体积为10μl，流速恒定为0.7ml/min。3）检测器为二极管阵列检测器（dad，agilengt1260series）（agilengttechnologies，waldbronn，germany），检测波长为467nm，分色在30℃下在相同的色谱柱上分析；4）质谱参数设置如下：离子喷射源esi（负模式）；喷雾器喷射面积40pis；干气温度为325℃；干气（氮气）流速8l/min。本实验除检测物不同外，其它操作均一致。2结果与分析虾青素含量，见表1。表1样品虾青素含量（%）空白0.6实施例10.8实施例21.1实施例32.2实施例42.8由表1可以看出，采用碘化钾和硫酸铜处理的实施例1在促进虾青素转化方面优于空白，而调低ph的实施例2的效果又好于实施例1。而在对游动生长阶段微藻进行处理的实施例3和实施例4，可明显提高虾青素的含量；而加入甘氨酸的实施例4的效果又好于仅加入三磷酸腺苷的实施例3。由此可见，本发明可以提高微藻中虾青素的含量。当前第1页12