本发明涉及一种采用离体角膜器官评价光损伤的体外方法。
背景技术：
日常生活中，人类的眼睛暴露于紫外光后可诱发光对角膜的损伤作用，尤其是长时间暴露在阳光下(接触高剂量紫外线)会造成眼睛损伤，损伤包括白内障、黄斑变性、结膜黄斑、翼状胬肉和角膜炎。
uva更接近可见光，能量比uvb和uvc低。但是uva射线可以通过角膜到达眼睛内的晶状体和视网膜。过度暴露于uva辐射与某些类型的白内障的发展有关，uva射线可能在黄斑变性的发展中起作用。角膜几乎吸收了90％以上的uvb，在高短期剂量下，uvb射线也会引起光角膜炎，或称光角膜晒伤，是一种角膜疼痛的炎症反应。
在高海拔地区，长时间在海滩或滑雪时，可能导致严重的光角膜炎，称为“雪盲症”，通常持续24-48小时可以导致暂时性视力丧失，并伴有疼痛。而工人(如电焊工)职业暴露于工业高强度uv，容易造成角膜炎或结膜炎等损伤。
光毒性物质由于吸收光子，被激活后释放能量或者刺激机体产生自由基，从而引起机体局部损伤效应。角膜直接暴露于光线下，环境中的水溶性或脂溶性外源化学物接触于眼睛后，可能诱发眼光毒性效应，对角膜和眼球产生有害相应。
目前眼科研究通常采用动物模型(兔子)进行，且缺乏公认一致的毒理学评价方法。传统动物实验的缺点包括：主观性/重复性差、物种差异、周期长、成本高、通量低、使用活体动物造成动物痛苦死亡等。
目前，以体外技术为核心的试验方法，逐渐被许多国家和地区的监管部门所接收和认可。美国替代方法研究评价中心(iccvam)提出了一系列非动物测试方法。全球范围内多个地区和国家通过法规禁止/部分禁止或限制动物试验的进行。目前开发了多种眼刺激体外方法，用于取代原有的兔子眼刺激/腐蚀性测试，但是尚无眼光毒性/光损伤的体外评价方法。
体外方法是根据体内眼光损伤发生的机理开发的，角膜直接暴露于uv，可直接导致角膜基质粘多糖裂开，并且改变其生理功能。离体角膜来源于废弃的动物眼球组织，不需要额外牺牲动物，天然角膜与人体角膜接近，离体角膜在短期内可以维持正常生理活性，可以模拟角膜光暴露，且成本低、结果稳定。牛角膜浑浊度渗透性试验是oecd认可的替代方法之一，用于取代传统兔眼试验，用于眼损伤的分类和标示，其应用广泛，数据被多方所接受。
实际生活中，眼球可能接触到多种外源化学物和紫外线，角膜作为眼球最外层直接接触紫外线，紫外线可直接或间接(激活光毒物)造成光损伤，而评估光损伤的保护和修复作用的模型目前尚未成型，也缺乏评价眼光毒物的方法。目前基于离体角膜眼光损伤模型未见相关专利和文献报道。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题，就是提供一种采用离体角膜器官评价光损伤的体外方法，利用离体动物角膜的光损伤模型，评价受试物质对光损伤角膜的保护和修复作用，或者用于眼光毒性的评价，本方法具有成本低、通量高、可重复、不额外牺牲动物等优点，可以对多种受试物进行快速评价。
解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案来实现的：
一种采用离体角膜器官评价光损伤的体外方法，其特征是包括以下步骤：
(1)离体角膜的制备和维持
无菌环境下分离动物离体眼球完整角膜，并固定于专用的生物膜夹持器中，生物膜夹持器填充相应的培养液，置于培养箱中孵育；
(2)光损伤模型的制备
卸下生物膜夹持器前室玻璃片，暴露角膜上皮；
(3)药物干预
根据研究目的和药物作用，选择受试物干预的模式和时间；
(4)评价指标的测量
根据研究目的和药物作用，选择指标包括测量角膜厚度、角膜浑浊度、角膜上皮渗透性、氧化应激或炎症相关指标，还包括对角膜进行组织学分析；
(5)结果分析
根据暴露模式，对所选指标进行处理，并做数据分析。
所述的步骤(1)中的动物离体眼球组织为牛眼球、猪眼球或羊眼球之类畜牧业或养殖业中废弃的动物眼球组织，动物的年龄范围在12个月至60个月内，在动物死亡2h内进行眼球摘取，短暂保存于4℃、含抗生素的无菌hbss缓冲液中，6h内运输回实验室进行试验；专用生物膜夹持器指的是申请人公司开发的生物膜夹持器(专利号：zl200620019463.7)，培养箱温度32±1℃，湿度40-70％，孵育1-2h，培养液为含1％小牛血清的mem培养基。
所述的步骤(2)具体为：采用太阳光模拟仪或紫外辐照仪，优先选择紫外光(uv)进行暴露，同时监测uva、uvb的强度，暴露时间30分钟到240分钟；暴露环境温度32±1℃，湿度40-70％。
所述的步骤(3)受试物应在原始状态下进行测试，或者采用应用液或浓缩液进行，或根据实际要求选择合适的测试浓度(＞0，≤100％)；前提是需要保证受试物并不直接对角膜产生有害作用；如需要用到相应的溶剂，应选为无菌水/生理盐水、培养液或其他可以证明对角膜无损伤的溶剂，受试物加样体积为0.5-2ml。
所述的步骤(3)根据研究目的和药物作用差异，受试物暴露模式有3种：光损伤前，光损伤中和光损伤后；暴露时间10分钟至240分钟，优选进行1-5个浓度的暴露，每次评价至少进行3次独立测试。
所述的步骤(4)评价指标的测量，角膜厚度优选采用a型超声测量，角膜基质优选浊度仪测量，角膜上皮渗透性优选荧光素漏出法测量(荧光素钠浓度0.5-5％)，作为光刺激性评价指标。
所述的步骤(4)评价指标的测量，氧化应激指标选择sod、mda、ros、gsh-px、或过氧化氢酶，炎症指选择il-1α、il-1β或tnf-α炎症因子或促炎症因子；收集生物膜夹持器后室液体或者角膜组织匀浆液，根据商品化的检测试剂盒说明书进行相应指标的分析。
所述的步骤(5)最终数据采用均数±标准差表示，试验组与空白组/对照组进行比较，差异在2倍或以上，或者经统计学单因素方差分析差异具有统计学意义者，判定为指标阳性结果；每个类型的指标出现2种或以上阳性结果时，具有阳性作用效应，如抗氧化、抗炎、抗光刺激等，参考化学物或类似化学物的理化信息等已知信息，权重评价指标，以获得更加可靠的预测。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明使用离体动物角膜组织，其结构接近人体天然角膜，结果可信度高、重复性好，且角膜来源于无需额外牺牲活体动物，符合3rs原则；
(2)本发明通过uv暴露制备光损伤模型，符合实际暴露情况，具有科学性；
(3)本发明采用多方面指标，可作为毒性筛查或者药理研究；
(4)本发明建立的方法可以代替活体动物试验，直接用于评价化学品、日化品、药品、医疗器械等眼光损伤的研究；
具体实施方式
实施例1基于离体牛角膜的光损伤模型的建立
1、实验材料的准备
1.1溶液的配制
1.1.1hbss溶液：商品化购买(购自sigma)，使用前加入青霉素(100iu/ml)和链霉素(100iu/ml)。
1.1.2mem培养基：商品化购买(购自sigma)，使用前加入1％胎牛血清(购自gibco)。
1.1.3荧光素钠溶液：准确称取荧光素钠(购自sigma)0.125g，加入25mldpbs溶液，配制成0.5％荧光素钠溶液，4℃避光保存8周。
1.2试验器械的准备：所有取牛眼球的器械和分离角膜的器械都需要经过无菌或消毒处理。
1.3受试物准备：生理盐水。
1.4培养条件：温度32±1℃，湿度40-70％
1.5离体牛眼球的获取：由屠宰场经培训的工作人员摘取，并立即放入冰冷hbss中，完成后运输回实验室。
2试验过程
2.1离体角膜的制备和维持
2.1.1检查眼球，弃去任何肉眼可见损伤或病变的眼球。以手术刀在角膜外2-3mm孔膜处做一小切口，剪刀环切下角膜，外周保留2-3mm巩膜，夹住巩膜，以镊子轻轻剥离玻璃体和虹膜，完整分离角膜。
2.1.2将角膜上皮朝上置于生物膜夹持器后室，放上并固定前室。随后加入mem培养基，排空气泡。再次检查角膜有无异常，弃去任何异常角膜。将生物膜夹持器水平放置于培养箱中孵育1.5h。
2.2角膜浑浊度测量：取出含角膜的生物膜夹持器，更换新鲜培养液。采用德国basf角膜浊度仪，记录每个角膜照度值，并随机分为3组，每组10个角膜。
2.3光暴露：去除前室液体，卸下玻璃片，加入生理盐水0.5ml，将夹持器竖直放置于紫外光下，调整距离和暴露时间，使之达到所需剂量。相应的对照组采用相同的暴露时间，但不进行紫外光照。
2.4冲洗：暴露结束后用培养液冲洗角膜3次，重新填充前室培养液，再次测量角膜浑浊度。
2.5荧光素漏出：吸弃前室液体，加入1ml0.5％荧光素钠溶液，竖直放置，在培养箱中孵育90min。收集后室液体，充分混匀，取200μl后室液体，在490nm波长读取吸光度值(od490)。
3数据分析
3.1计算
浊度变化值δop＝op暴露后-op暴露前
荧光素渗透值od490＝受试物od490-平均阴性对照od490
3.2角膜基质和上皮功能评价
在本次试验条件下，随着暴露时间的延长，对照组op和od490并未出现明显变化，而模型组在uva暴露下，op有明显的增加，且呈现剂量依赖性，但od490并无明显增加。显示不同剂量的紫外光会对角膜产生损伤。
实施例2基于离体牛角膜的光损伤模型评价光毒性物质
1、实验材料的准备
1.1溶液的配制
1.1.1hbss溶液：商品化购买(购自sigma)，使用前加入青霉素(100iu/ml)和链霉素(100iu/ml)。
1.1.2mem培养基：商品化购买(购自sigma)，使用前加入1％胎牛血清(购自gibco)。
1.1.3荧光素钠溶液：准确称取荧光素钠(购自sigma)0.125g，加入25mldpbs溶液，配制成0.5％荧光素钠溶液，4℃避光保存8周。
1.1.4组织匀浆液：含0.01mol/ltris，0.001mol/ledta-na2，0.01mol/l蔗糖，8g/lnacl，调节ph至7.4。
1.2试验器械的准备：所有取牛眼球的器械和分离角膜的器械都需要经过无菌或消毒处理。
1.3受试物准备：样品、生理盐水。
1.4培养条件：温度32±1℃，湿度40-70％
1.5离体牛眼球的获取：由屠宰场经培训的工作人员摘取，并立即放入冰冷hbss中，完成后运输回实验室。
2试验过程
2.1离体角膜的制备和维持
2.1.1检查眼球，弃去任何肉眼可见损伤或病变的眼球。以手术刀在角膜外2-3mm孔膜处做一小切口，剪刀环切下角膜，外周保留2-3mm巩膜，夹住巩膜，以镊子轻轻剥离玻璃体和虹膜，完整分离角膜。
2.1.2将角膜上皮朝上置于生物膜夹持器后室，放上并固定前室。随后加入mem培养基，排空气泡。再次检查角膜有无异常，弃去任何异常角膜。将生物膜夹持器水平放置于培养箱中孵育1.5h。
2.2角膜浑浊度测量：取出含角膜的生物膜夹持器，更换新鲜培养液。采用德国basf角膜浊度仪，记录每个角膜照度值，并随机分为3组，每组10个角膜。
2.3光暴露：去除前室液体，卸下玻璃片，加入不同浓度受试物0.5ml，将夹持器竖直放置于紫外光下，调整距离和暴露时间。
2.4冲洗：暴露结束后用培养液冲洗角膜3次，重新填充前室培养液，再次测量角膜浑浊度。
2.5荧光素漏出：吸弃前室液体，加入1ml0.5％荧光素钠溶液，竖直放置，在培养箱中孵育90min。收集后室液体，充分混匀，取200μl后室液体，在490nm波长读取吸光度值(od490)。
2.6sod测定：将角膜剪碎后置于离心管中加入19倍体积的组织匀浆液，冰箱研磨匀浆，制备5％角膜组织匀浆，4℃低温离心10min(3000r/min)，取上清液备用。考马斯亮蓝法做蛋白定量，用sod试剂盒测定sod含量。
3数据分析
3.1计算
根据仪器说明书，计算浊度值，浊度变化值δop＝op暴露后-op暴露前
荧光素渗透值od490＝受试物od490-平均阴性对照od490
sod相对含量(％)：各组sod含量/空白对照组sod含量×100
3.2结果分析
在本次试验条件下，模型组与空白对照组相比，op值、od值和sod相对含量均未变现出明显变化。样品对照组在不同浓度下，op值和od值变化不明显，但sod相对含量随样品浓度升高而降低。在样品组中，角膜膜op值和od值均出现了不同程度的升高，而sod相对含量显著降低。从数据可以看出，角膜在受试物和紫外线同时暴露下，角膜的基质和上皮组织均出现了较明显的损伤，表现为op值和od值升高，而sod相对含量明显下降也显示出了角膜受到明显的氧化损伤。对比样品组和样品对照组可以发现，受试物在接受紫外辐照后对角膜产生了明显的损伤作用，可能由于紫外光的照射使受试物转变为激发态，而产生的光毒性效应。
4结论：该模型可以用于眼光毒性物质的快速筛查。
实施例3基于离体牛角膜的光损伤模型评价海藻糖的保护作用
1、实验材料的准备
1.1溶液的配制
1.1.1hbss溶液：商品化购买(购自sigma)，使用前加入青霉素(100iu/ml)和链霉素(100iu/ml)。
1.1.2mem培养基：商品化购买(购自sigma)，使用前加入1％胎牛血清(购自gibco)。
1.1.3组织匀浆液：含0.01mol/ltris，0.001mol/ledta-na2，0.01mol/l蔗糖，8g/lnacl，调节ph至7.4。
1.2试验器械的准备：所有取牛眼球的器械和分离角膜的器械都需要经过无菌或消毒处理。
1.3受试物准备：生理盐水(ns)、维生素c溶液(vitc)不同浓度的海藻糖溶液。
1.4培养条件：温度32±1℃，湿度40-70％
1.5离体牛眼球的获取：由屠宰场经培训的工作人员摘取，并立即放入冰冷hbss中，完成后运输回实验室。
2试验过程
2.1离体角膜的制备和维持
2.1.1检查眼球，弃去任何肉眼可见损伤或病变的眼球。以手术刀在角膜外2-3mm孔膜处做一小切口，剪刀环切下角膜，外周保留2-3mm巩膜，夹住巩膜，以镊子轻轻剥离玻璃体和虹膜，完整分离角膜。
2.1.2将角膜上皮朝上置于生物膜夹持器后室，放上并固定前室。随后加入mem培养基，排空气泡。再次检查角膜有无异常，弃去任何异常角膜。将生物膜夹持器水平放置于培养箱中孵育1.5h。
2.2角膜浑浊度测量：取出含角膜的生物膜夹持器，更换新鲜培养液。采用op-kit角膜浊度仪，记录每个角膜浊度值，并随机分为6组，每组10个角膜。
2.3光暴露：去除前室液体，卸下玻璃片，加入不同浓度受试物0.5ml，空白对照组加入ns，阳性对照组加入vitc，将夹持器竖直放置于紫外光下，调整距离和暴露时间，阴性对照组加入ns但不进行光辐照。
2.4冲洗：暴露结束后用培养液冲洗角膜3次，重新填充前室培养液，再次测量角膜浑浊度。
2.5sod测定：将角膜剪碎后置于离心管中加入19倍体积的组织匀浆液，冰箱研磨匀浆，制备5％角膜组织匀浆，4℃低温离心10min(3000r/min)，取上清液备用。考马斯亮蓝法做蛋白定量，用sod试剂盒测定sod含量。
3数据分析
3.1计算
浊度变化值δop＝op暴露后-op暴露前
sod相对含量(％)：各组sod含量/空白对照组sod含量×100
3.2结果分析
在本次试验条件下，空白对照组op值显著高于阴性对照组，同时其sod相对含量显著低于其阴性对照组，表明空白对照组角膜损伤较严重，光损伤模型造模有效。样品组中，随浓度的升高，角膜浊度值减小，而sod相对含量升高，结果与阳性对照组维生素c相似。有研究表明海藻糖具有保护蛋白质和稳定sod的作用，与本研究通过分析海藻糖在紫外暴露下角膜的浑浊度和sod含量，结果表明，海藻糖对光损伤后的角膜具有一定的保护作用。