本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种细菌粘附细胞的快速检测方法。
背景技术：
：粘附是病原菌入侵宿主细胞的先决条件之一。在感染过程中，病原菌通过粘附和定值后，发挥一系列致病作用。在细菌性疫病的防控中，若能阻止细菌与宿主细胞的粘附，便能有效防控该疫病的发生。判断一种药物或添加剂是否能有效减少或阻止细菌的粘附，通常需要建立一种体外细菌粘附试验模型，通过统计细菌在细胞的粘附率来确定该药物对细菌粘附的抑制效果。粘附是细菌的粘附素与宿主细胞相应受体之间的结合过程。已有研究表明,粘附素多为细菌菌毛，此外还有一些非菌毛性蛋白和糖类，而细菌所粘附的受体多为糖蛋白。由于不同的细菌，其粘附素的组成成分和分子结构不同，它们识别和结合宿主细胞受体的能力就不同，因而不同的细菌菌株对细胞的粘附能力是不同的。益生菌是一类活的微生物，能促进肠道内菌群的生态平衡，是对宿主健康有益的活菌制剂，它们也是人和动物肠道重要的生理性细菌；许多研究表明，益生菌可干扰病原菌的生长、繁殖。公开号为cn107523604a的中国发明专利，公开了一种细菌与细胞粘附的快速检测方法及其应用。所述快速检测方法其检测步骤如下：s1.培养细胞，形成单层细胞；s2.培养细菌，并加入荧光染料cfse标记细菌，标记30min～60min后加入终止剂终止反应；细胞与荧光染料标记后的细菌以数量比1：300～400共培养2.5h～3h，再洗除未粘附的细菌；然后检测细胞的荧光强度，并计算粘附率；其中，细菌为可粘附但不入侵动物细胞的细菌，细胞为能贴壁生长的动物细胞。该发明所述的快速检测方法适用于细菌对宿主细胞粘附率的检测，在体外粘附试验模型的基础上，采用cfse荧光染料标记细菌，通过检测细胞的荧光强度，即可得知细胞上细菌的粘附率。然而，该发明方法不适用于多种细菌同时粘附细胞的检测，无法为预防某些病原菌侵染疾病的发生提供依据。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种细菌粘附细胞的快速检测方法，通过将有益菌和病原菌同时粘附细胞，探索有益菌对病原菌的抗粘附影响，为预防某些病原菌侵染疾病的发生提供了简单、快速、有效的依据。本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：一种细菌粘附细胞的快速检测方法，包括细胞培养、细菌培养和细菌粘附，具体包括如下步骤：s1.培养细胞，形成单层细胞；s2.分别培养有益菌和病原菌，并加入荧光染料cfse标记各种细菌，标记30-60min后加入终止剂终止反应；s3.将细胞与荧光染料标记后的有益菌和病原菌共培养，粘附0.1-1.5h后，洗除未粘附的细菌；然后检测细胞的荧光强度，并计算粘附率。作为优选，步骤s2中有益菌培养用培养基含有培养基重量0.01-0.1％的1,2:4,5-二-o-异亚丙基-d-呋喃核酮糖和0.002-0.005％的芸苔素，1,2:4,5-二-o-异亚丙基-d-呋喃核酮糖和芸苔素的特殊存在，能够促进有益菌进行生长代谢，尤其是促进有益菌产生更多具有抗病原微生物活性的产物，如有机酸(乳酸、乙酸等)、过氧化氢、细菌素等，这些活性代谢产物具有良好的抑菌杀菌性能，可对病原菌起到一定的抗菌效果，从而抑制病原菌对细胞的粘附；同时，能够在一定程度上稳定抗菌物质的活性，延长抗菌作用时间，使得当有益菌和病原菌共同粘附时，有益菌具有长效的竞争优势从而抑制病原菌发挥作用。作为优选，步骤s2中cfse的浓度为120-150μm。作为优选，步骤s2中进行荧光标记的细菌密度为107-108cfu/ml。作为优选，步骤s2中cfse与细菌菌液体积比为2.5-3:1。作为优选，步骤s2中细菌荧光标记的时间为25-35min。作为优选，步骤s2中的终止剂为含20-50％胎牛血清的完全培养基。作为优选，步骤s3粘附过程中，将有益菌和病原菌同时加入受体细胞，再加入有益菌体积分数为0.03-0.06％的n-苄氧羰基甘氨酸和0.001-0.003％的质粒dna，n-苄氧羰基甘氨酸和质粒dna具有协同作用，其一能够加速细菌粘附达到饱和的时间，从而加快后续检测步骤的进行；其二有利于改善有益菌的粘附适应性，使得有益菌一方面粘附受体细胞表面的特异性受体，一方面与病原菌表面的非特异性受体进行附着，最终使得有益菌在细胞表面形成一层生物屏障，构成有利的定植抗力，阻止病原菌的粘附和定植，保护了细胞不受病原菌的侵害。本发明的有益效果为：1)本发明检测方法中省去了细胞裂解的过程，减少了因细胞未完全裂解而产生的误差；省去了菌落计数的过程，减少了因菌落计数产生的误差；直接通过荧光检测即可快速获得检测结果，检测的过程简单、快速，且耗费的时间不到传统方法的一半；2)本发明通过将有益菌和病原菌同时粘附细胞，探索有益菌对病原菌的抗粘附影响；其影响因素包括，有益菌通过对病原菌粘附从而降低病原菌对细胞的粘附侵害，同时有益菌可分泌乳酸和某些蛋白质类的抗菌物质将病原菌杀死，从而宏观上表现为动物疾病减少，生长、发育加快；在实际生产应用中，本发明检测方法为有益菌对细胞进行保护提供了依据。本发明采用了上述技术方案提供范文，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。具体实施方式下面分别以埃希氏大肠杆菌和嗜热链球菌结合实施例对本发明作进一步详细描述：本发明实施例采用受体细胞为caco-2细胞，有益菌选用嗜酸乳杆菌和两歧双歧杆菌，病原菌选用大肠杆菌k88和猪霍乱沙门氏菌。实施例1：一种细菌粘附细胞的快速检测方法，包括细胞培养、细菌培养和细菌粘附，具体包括如下步骤：(1)将caco-2细胞生长在10％灭活(30min，56℃)胎牛血清、终浓度为100u/ml的含100g/l青、链霉素的dmem(含25mmol/l葡萄糖)培养基中，在37℃、5％co2培养箱中培养；粘附试验所用caco-2细胞接种于24孔培养板，密度为1.4×104个/孔，在37℃、5％co2培养箱中培养，每隔1d更换1次培养基；细胞在融合后使用；(2)各细菌用液体培养基：嗜酸乳杆菌生长在mrs肉汤培养基中，两歧双歧杆菌生长在加入少许l-盐酸半胱氨酸的mrs培养基中，在5％co2厌氧培养箱中37℃培养48h；大肠杆菌k88、猪霍乱沙门氏菌培养在mh肉汤中，37℃培养10h；培养完毕后，4000r/min离心10min，收集细菌，用hank's液洗2次，最后用dmem培养液悬浮细菌，调整细菌浓度为107-108cfu/ml，备用；上述有益菌培养基中还含有培养基重量0.06％的1,2:4,5-二-o-异亚丙基-d-呋喃核酮糖和0.002％的芸苔素，1,2:4,5-二-o-异亚丙基-d-呋喃核酮糖和芸苔素的特殊存在，能够促进有益菌进行生长代谢，尤其是促进有益菌产生更多具有抗病原微生物活性的产物，如有机酸(乳酸、乙酸等)、过氧化氢、细菌素等，这些活性代谢产物具有良好的抑菌杀菌性能，可对病原菌起到一定的抗菌效果，从而抑制病原菌对细胞的粘附；同时，能够在一定程度上稳定抗菌物质的活性，延长抗菌作用时间，使得当有益菌和病原菌共同粘附时，有益菌具有长效的竞争优势从而抑制病原菌发挥作用；荧光染料标记方法为：称取一定量的cfse粉末，加dmso溶解，配制成浓度为135μm的cfse溶液，取2.5mlcfse溶液小心加入到上述收集有细菌(1ml)的离心管内，轻轻吹打将cfse溶液与细菌混匀，于37℃、200r/min避光孵育20min；用4℃预冷的含40％胎牛血清完全培养基洗涤细菌菌液，离心，重悬细菌使密度为107-108cfu/ml；细菌于37℃培养箱孵育25min即可用于后续试验，或4℃避光保存；(3)将细胞培养至单层，用无菌hank's液洗3次，在24孔板中分别加入嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌、大肠杆菌k88和猪霍乱沙门氏菌菌液(浓度为3×108cfu/ml)各1ml，加入0.1mln-苄氧羰基甘氨酸溶液和0.004ml质粒dna提取液，置于37℃，5％co2培养箱中培养，粘附0.1h后，分别计数粘附的细菌数；n-苄氧羰基甘氨酸和质粒dna具有协同作用，其一能够加速细菌粘附达到饱和的时间，从而加快后续检测步骤的进行；其二有利于改善有益菌的粘附适应性，使得有益菌一方面粘附受体细胞表面的特异性受体，一方面与病原菌表面的非特异性受体进行附着，最终使得有益菌在细胞表面形成一层生物屏障，构成有利的定植抗力，阻止病原菌的粘附和定植，保护了细胞不受病原菌的侵害。实施例2：本实施例采用的原料和方法同实施例1，不同之处在于2.8mlcfse溶液与1ml细菌混匀，于37℃、200r/min避光孵育30min；细胞与细菌的共培养粘附时间为1h。实施例3：本实施例采用的原料和方法同实施例1，不同之处在于3.0mlcfse溶液与1ml细菌混匀，于37℃、200r/min避光孵育35min；细胞与细菌的共培养粘附时间为1.5h。实施例4：将嗜酸乳杆菌和两歧双歧杆菌的培养上清液在37℃与200mg/l胰蛋白酶、100mg/l蛋白酶k、250mg/l乳酸脱氢酶分别作用2h，再加入大肠杆菌k88和猪霍乱沙门氏菌，作用10h；对照组为嗜酸乳杆菌和两歧双歧杆菌的培养上清液直接与大肠杆菌k88和猪霍乱沙门氏菌作用10h，测定大肠杆菌k88和猪霍乱沙门氏菌的存活率；经测定，嗜酸乳杆菌和两歧双歧杆菌培养上清液对大肠杆菌k88和猪霍乱沙门氏菌生长均有很强的抑制作用，作用10h后，抑制率均达到100％；而用胰蛋白酶处理过的嗜酸乳杆菌或两歧双歧杆菌的培养上清液与大肠杆菌k88作用10h后对其的抑制率分别仅为37％和43％；对猪霍乱沙门氏菌的抑制率分别仅为25％和38％；用蛋白酶k和乳酸脱氢酶处理后的情况也是如此；可见，抗菌性能明显降低。对比例1：有益菌培养用培养基不含有1,2:4,5-二-o-异亚丙基-d-呋喃核酮糖和芸苔素，其余部分和实施例2完全一致。对比例2：细菌粘附细胞过程中未添加n-苄氧羰基甘氨酸和质粒dna，其余部分和实施例2完全一致。实施例5：通过检测细胞的荧光强度来确定各细菌在细胞表面的粘附情况，如表1为四种细菌在caco-2细胞表面粘附的数量；容易发现，对比例1和2中4种细菌在caco-2细胞上的粘附程度大同小异，而实施例2中大肠杆菌k88和猪霍乱沙门氏菌两种病原菌的粘附数量很小，说明有益菌培养时，培养基中添加1,2:4,5-二-o-异亚丙基-d-呋喃核酮糖和芸苔素，有利于促进有益菌产生更多具有抗病原微生物的活性产物，这些活性产物对病原菌具有良好的抑菌杀菌性能，从而可降低病原菌对细胞的粘附量；而细菌粘附细胞过程中n-苄氧羰基甘氨酸和质粒dna具有协同作用，能够促进有益菌对病原菌的粘附从而降低病原菌粘附到caco-2细胞上。表1四种细菌粘附到caco-2细胞上的数量log/(cfu/ml)项目嗜酸乳杆菌两歧双歧杆菌大肠杆菌k88猪霍乱沙门氏菌实施例27.897.672.122.54对比例16.937.016.115.72对比例25.585.695.135.26上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。当前第1页12