本发明属于植物抗病调控基因筛选及应用技术领域，涉及一种烟草抗病毒调控基因筛选方法及应用。
背景技术：
植物cdna文库是指一个植物物种所有cdna的集合。这些cdna通常被插入一个载体，转化至大肠杆菌中混合保存。构建完成后，可供随时选取使用。另外，通过选择使用不同的文库构建载体，可以进行不同的植物功能基因组学研究。比如用植物表达载体构建的文库，可以用于植物体内瞬时过表达分析，筛选特定目标功能的调控基因。因此，植物cdna文库的利用是植物功能基因组学研究的基本研究手段，也是规模化筛选、分离和克隆目的调控基因的主要途径之一。植物cdna文库的构建步骤主要包括植物组织总rna提取，mrna纯化，反转录，连入载体，均一化处理，连接产物的细菌转化，质粒提取，pcr和酶切检验，容量和重组率分析等。
植物基因功能通常通过比较分析基因的超常规表达与正常表达情况下的表型(phenotype)或功能发挥情况来判断。基因的超常规表达包括高于正常水平的表达和低于正常水平的表达两大类。高于正常水平的表达主要为超表达/过表达(over-expression)，主要通过连接一个强启动子来驱动目的基因表达的方式来达到。低于正常水平的表达主要通过rna干扰(rnainterfering,rnai)、基因敲低(knock-down)和基因敲除(knock-out)等方式来达到。超表达通过构建和转化一个含有同一序列片段相反方向插入一个内含子或其它不表达的序列形成的发卡结构来实现，结果是目的基因表达的降低。基因敲低还可以通过病毒诱导的基因沉默(virus-inducedgenesilencing，vigs)来实现。基因敲除(knock-out)则通过在植物基因组中的目的基因中插入一个长的非植物序列或切除目的基因等方式来达到，结果是目的基因表达的完全或近乎完全的抑制。对于单个基因，只要构建基因超表达植株和/或超表达植株、基因敲除突变体，比较这些植株的表型和性状与野生型/正常植株的差异，就能明确目的基因对该性状的调节功能。但对于亚组学和组学水平的规模化基因功能分析，则需要构建所有基因的超表达库、突变体库或vigs文库方可达到筛选和分离目标基因的目的。
由于外源基因的导入，导致植物中与该外源基因一致及与之高度同源的植物内源基因的转录本积累受到抑制的现象称为转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，ptgs)。“病毒诱导的基因沉默”(virus-inducedgenesilencing，vigs)是植物中研究最广泛的ptgs现象。vigs现象本来是植物抗病毒侵染的一种自然机制。但近年来，已被开发成为一项快速基因功能鉴定新技术。只需将植物目的基因片段插入病毒载体，构建成重组病毒，侵染植物后即可用于抑制与插入片段高度同源的植物内源目的基因的表达，从而探明该基因功能。经过数年的研究，该思路已发展成一项可以快速高通量研究植物基因功能的成熟技术，在植物功能基因组学的研究中正得到越来越广泛的应用。
目前已有的用于功能丧失(loss-of-function)研究的方法主要包括化学突变分析，转座子或农杆菌t-dna插入突变分析。这些方法在拟南芥等少数模式植物基因功能研究中非常有效，但在其他植物中尚未能大规模的应用。另外，抑制目的基因表达的技术还包括反义rna技术，rnai技术以及化学制剂诱导性基因沉默技术。所有这些技术均需构建转基因植株。vigs技术与现有这些技术相比，具有以下优点或特点：
首先，在未获取全长序列甚至事先不知道序列的情况下即可进行vigs分析。vigs可以est序列为对象，可以某一个片段为对象进行功能鉴定，也可以cdna文库为对象进行目的基因筛选分析。
其次，vigs操作简便，能快速获取表型。利用vigs在植株当代即能获取功能丧失表型，无需通过大规模筛选获取突变体。另外，从vigs导入至表型产生仅需几周，因此非常迅速。这是vigs的最明显的优点之一。
第三，vigs无需构建转基因植株。这对于那些转基因植株获取非常困难的植物种类来说至关重要。
第四，vigs可用于突变致死的基因功能研究。对于突变致死基因，无法得到其突变体。而vigs可以在较大的苗期中进行这些基因功能的研究。
第五，vigs可用于功能冗余基因的功能研究。许多植物基因以基因家族形式存在，一个家族内的基因成员往往具有相似的功能，因此对基因家族中单个成员基因的突变往往没有明显的表型。vigs可以克服这个困难，只需将基因家族成员之间最保守区域克隆入vigs载体，再进行vigs，即可抑制整个家族基因的表达，从而观察到表型。当然，如果选择家族基因成员最特异的序列进行vigs，则可以观察到该单个基因的丧失功能表型。
植物抗病性通过病原物接种分析进行检测和评估。不同类型病原物的接种方法各不相同。对于真菌，能产生分生孢子的，通常以分生孢子悬浮液喷雾接种植物。不产生分生孢子的，则以菌丝块等接种植物。对于卵菌，一般先培养产生大量孢子囊，而后低温培养使之释放游动孢子，最后以游动孢子悬浮液接种植物。对于细菌，常以菌体悬浮液剪叶、针刺、注射、喷雾等法接种植物。对于病毒，常以提纯的病毒粒子、人工体外转录产物或提取和提纯的病毒摩擦、注射或通过昆虫等传播媒介接种植物。对于菌原体，常通过传播介体接种或者嫁接接种。对于线虫，常以一定数量的二龄幼虫接触植物根部茎基部或根围土壤中接种植物。多数情况下，接种后需要保持较高的相对湿度，合适的温度和光照条件。接种后按不同时间点连续观察病害发生症状，统计发病率和发病严重度，计算病情指数，计算菌量或采用rt-pcr检测病原物生物量。通过与感病对照植物发病情况的对比分析，明确目标植物的抗病性。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种无需构建转基因植株或突变体的快速获取目的病毒调控基因的方法。
本发明提供的烟草抗病毒调控基因筛选方法，包括以下步骤：
(1)以vigs载体为目的载体，构建烟草cdna文库，进行均一化处理后获取可直接用于基因沉默筛选分析的vigs-cdna文库；
(2)cdna文库-vigs分析：将构建完成的vigs-cdna文库质粒转化至农杆菌，获得农杆菌文库，将农杆菌文库涂板培养获取单菌落，对每个单菌落分别进行vigs沉默分析；
(3)抗病毒调控基因的筛选：对cdna文库各菌落的vigs沉默植株进行抗病毒分析，筛选获得抗病毒相关菌落；
(4)抗病毒调控基因的鉴定：对筛选获得的抗病毒相关菌落对应的基因进行测序分析，并对获得的序列进行同源性分析和功能预测，获取抗病毒调控基因。
本发明的上述方法中，步骤(1)构建烟草cdna文库的方法是：
1)提取烟草总rna，获得烟草mrna，构建dsn均一化cdna初级文库，将均一化处理的cdna通过bp重组反应克隆入载体，然后转化感受态细胞，通过涂板和单克隆检测，分析文库的容量和均一化效果；
2)进行vigs次级文库的构建：提取步骤1)得到的cdna初级文库质粒，将得到的初级文库质粒稀释后通过lr重组反应克隆入vigs载体；通过涂板和单克隆检测，分析文库的容量和重组率；
3)鉴定获取容量大和重组率高的烟草vigs-cdna文库。
优选地，vigs载体为ptrvg，得到的vigs-cdna文库为ptrvg-cdna文库。
本发明的烟草抗病毒调控基因筛选方法步骤(2)对每个单菌落分别进行vigs沉默分析的方法为：
1)吸取部分农杆菌菌液涂板培养，同时培养转化了的农杆菌文库；挑取单菌落，接种于含抗生素的液体培养基中进行培养，收集菌体细胞，重悬至od600值为2，恢复培养后，按1：1(v:v)比例将转化了的农杆菌和插入目的基因片段的vigs-cdna文库转化菌进行混合；
2)植株的浸润接种：将混合农杆菌液浸润苗龄为20-25d的烟草上部完全伸展的1-2个叶片，以浸润转化了的农杆菌和vigs-egfp农杆菌的混合菌液作为对照；
3)将浸润接种后的烟草培养，让目的基因进行有效的沉默。
一个具体的实施方式为：
(1)农杆菌单菌落的获取：吸取部分农杆菌菌液涂板培养，同时培养trvl农杆菌，挑取单菌落；
(2)接种体的制备：分别挑取单菌落，接种于含卡那霉素和利福平的yeb液体培养基中进行小量摇菌培养过夜，再进行大量培养；收集菌体细胞，用mmai溶液重悬至od600值为2；恢复培养2h后，按1：1(v:v)比例将trv1农杆菌和插入目的片段的ptrvg-cdna文库转化菌进行混合；
(3)植株的浸润接种：采用针筒浸润法，将混合农杆菌液浸润苗龄为20-25d的烟草上部完全伸展的1-2个叶片，以浸润trv1农杆菌和ptrvg-egfp农杆菌的混合菌液作为对照；
(4)沉默培养：将浸润接种后的烟草置于21℃，16h/8h光/暗周期下培养，让目的基因进行有效的沉默。
本发明提供的烟草抗病毒调控基因筛选方法步骤(3)的抗病毒分析方法为：沉默处理两周后，对cdna文库各菌落的vigs沉默植株分别进行抗病毒分析，接种烟草病毒，接种后，观察和记录病毒病害症状，获取沉默后病毒病害症状严重度发生显著改变的菌落，这些菌落对应的基因即为抗病毒调控基因的候选基因。
优选地，所述病毒为马铃薯y病毒(pvy)和烟草花叶病毒(cmv)。
本发明提供的烟草抗病毒调控基因筛选方法步骤(4)对筛选获得的抗病毒相关菌落对应的基因进行测序分析，获取这些基因的序列，并对这些序列进行烟草和其它植物基因组数据库的blast分析、保守结构域分析，预测基因功能，从而获取抗病毒调控基因。
本发明提供了上述烟草抗病毒调控基因筛选方法在烟草病毒病防治中的应用。
本发明提供了所述烟草抗病毒调控基因筛选方法在制备抗病毒转基因烟草中的应用。
本发明提供了所述烟草抗病毒调控基因筛选方法在获取烟草抗病毒调控基因并用于烟草种质资源改良中的应用。
本发明具有以下优点：(1)本发明方法巧妙利用vigs技术进行抗病调控基因的筛选，无需构建突变体或转基因植株，一个分析周期仅需几周，非常迅速，适用于很难构建获取转基因植株的物种中进行抗病毒调控基因的筛选，操作简便，能快速获取目的调控基因。(2)本发明在组学水平进行抗病毒调控基因的筛选，筛选全面，效率高。本发明采用文库-vigs方法，因此是在基因组水平上的盲筛，筛选范围大，候选对象全面，可以有效筛选到新的抗病毒调控基因。(3)本发明适用于突变致死基因的筛选。对于突变致死基因，无法得到其突变体，因而无法利用突变体进行抗病毒调控功能分析。而vigs可以在较大的苗期中进行这些基因抗病毒功能的研究。因此，本方法适用于突变致死基因的筛选，是对利用突变体进行抗病毒调控基因筛选方法的有效补充，并且筛选全面，具有良好的市场应用前景。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例所用生化试剂均为市售可得。
实施例1本氏烟抗病毒调控基因的筛选和鉴定
本实施例提供了一套以cdna文库vigs技术为基础的本氏烟抗病毒调控基因的筛选和鉴定技术体系。主要步骤包括：
(1)本氏烟vigs-cdna文库的构建
以vigs载体ptrvg为目的载体，构建本氏烟cdna文库，进行均一化处理，获取可直接在本氏烟中进行基因沉默筛选分析的本氏烟vigs-cdna文库。具体步骤如下：
采用trizolreagent试剂盒提取本氏烟总rna。再采用
采用clonemineriicdnalibraryconstructionkit和trimmer-2cdnanormalizationkit构建dsn均一化cdna初级文库。先以mrna为模板，dsn-attb2-rt-primer为引物，合成cdna第一链。然后合成cdna第二链。再将cdna与制备好的dsn-attb1adapter相连，获得含有dsn-attb1和dsn-attb2接头的cdna。加入dsn溶液，进行cdna杂交反应。以接头中含有的pcrprimerm1为引物，进行pcr扩增，获得dsn均一化cdna。将均一化处理的cdna通过bp重组反应克隆入pdonr222载体，然后转化大肠杆菌。通过涂板和单克隆检测，分析文库的容量和均一化效果。
然后，按以下步骤进行ptrvg-dest次级文库的构建：
采用
鉴定获取容量大和重组率高的本氏烟ptrvg-cdna文库。本发明构建获取的本氏烟vigs-cdna文库的文库容量为4.5×106cfu/ml，文库总克隆数达1.3×107cfu，可用于目的基因的vigs筛选。
(2)本氏烟cdna文库-vigs分析
将构建完成的本氏烟vigs-cdna文库质粒通过电击转化至农杆菌菌株gv3101，获得农杆菌文库。将文库涂板培养获取单菌落，对每个单菌落分别进行vigs沉默分析。具体步骤：
吸取部分菌液涂板培养，同时培养trvl农杆菌，分别挑取单菌落，接种于1ml含卡那霉素(kan，50μg/ml)和利福平(rif，50μg/ml)的yeb液体培养基中，28℃，200rpm培养过夜。吸取100μl培养好的菌液接种至新的100mlyebi溶液中，28℃，200rpm培养，至菌液od600为0.8-1.2。8000rpm离心10min，收集菌体细胞，然后用mmai溶液重悬至od600＝2(vmmai＝v菌液×od600/2)。重悬的菌液于28℃，60rpm恢复培养2h。恢复培养好后，按1：1(v:v)比例将trv1和插入目的片段的ptrvg-cdna文库转化菌进行混合。采用针筒浸润法，将混合农杆菌液浸润苗龄为20-25d的本氏烟上部完全伸展的1-2个叶片，以浸润trv1农杆菌和ptrvg-egfp农杆菌的混合菌液作为对照。vigs处理后的本氏烟置于21℃，16/8光/暗周期下培养，让目的基因进行有效的沉默。
(3)本氏烟抗病毒调控基因的筛选
上述沉默处理两周后，对cdna文库各菌落的vigs沉默植株分别进行抗病毒分析，分别接种马铃薯y病毒(pvy)和烟草花叶病毒(cmv)。采集分别表现明显pvy和cmv症状的叶片，以pbs提取病毒，离心后的上清粗提液用于接种。采用汁液摩擦接种上部两个嫩叶，每叶200μl病毒粗提液。接种后2周，观察和记录病毒病害症状。获取沉默后病毒病害症状严重度发生显著改变的菌落。这些菌落对应的基因即为抗pvy和cmv病毒调控基因的候选基因。
本发明经过对907个本氏烟ptrvg-cdna文库菌落基因在3600多个本氏烟植株中的vigs分析，获得了基因沉默后接种pvy后症状和病害严重度显著改变的基因42个，接种cmv后症状和病害严重度显著改变的基因31个。
(4)本氏烟抗病毒调控基因的鉴定
对筛选获得的抗病毒相关菌落对应的基因进行测序分析，获取这些基因的序列，并对这些序列进行本氏烟和其它植物基因组数据库的blast分析、保守结构域分析，预测基因功能，从而获取抗病毒调控基因。
本发明对上述筛选获得的73个菌落对应基因进行了测序，进一步对获得的序列进行同源性分析和功能预测，分别鉴定获得潜在的本氏烟抗pvy调控基因10个和抗cmv调控基因10个。揭示了蛋白泛素化和蛋白酶体降解、转录调控因子和一组信号传导因子可能在抗pvy病毒中起重要作用，而dad1和cathepsinb蛋白酶介导的程序性细胞死亡(pcd)、蛋白膜转运和内吞以及亚细胞定位变化可能在抗cmv病毒中起重要作用。