本发明涉及溶菌酶发酵技术领域，具体为一种溶菌酶的发酵方法。
背景技术：
溶菌酶又称细胞壁水解酶，能专一性地作用于细菌细胞壁肽聚糖分子，能使n-乙酰胞壁酸与乙酰葡萄糖氨之间的β-1，4糖苷键断裂，使细菌细胞壁变得松驰而达到溶解细菌的效果。溶菌酶广泛分布于高等动植物组织及其分泌物、原生动物、昆虫、植物以及各种微生物中。溶菌酶作为人体正常体液及组织中的非特异免疫因子之一，具有多种药理作用，参与机体多种免疫反应，有抗菌、抗病毒的功效，在机体正常防御功能和非特异免疫中，具有保持机体生理平衡的重要作用。它可以改善和增强巨噬细胞吞噬和消化功能，激活白细胞吞噬功能，并能改善细胞抑制剂所导致的白细胞减少，从而增强机体的抵抗力。溶菌酶能直接水解革兰氏阳性菌，在分泌型免疫球蛋白a、补体的参与下，还能水解革兰氏阴性菌如大肠杆菌等。对耐药性细菌同样具有溶菌作用，而且具有疗效显著和对人体副作用小的特点，因而是一种较为理想的药用酶。溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白直接作用，与dna、rna、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。溶菌酶作为酶类抗菌药，能参与粘多糖代谢，在配合内服和外用药的同时，可起到强力消炎作用，它还可与各种诱发炎症的酸性物质结合使其失活，并能够增强抗生素和其它药物的疗效，改善组织基质的粘多糖代谢，从而达到消炎、修复组织的目的。溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶。
溶菌酶是一种强碱性蛋白，与氧化物、碘化物及碳酸盐等容易形成结晶盐，在蛋清中加入一定量的上述化合物，并调节溶液的ph值到其等电点(ph＝10.5)，在最适宜的情况下，溶菌酶结晶将慢慢地析出，于72-96小时达到最高产率，但是现有的蛋清溶菌酶在生产时，不能利用生产时的蛋黄液，使得蛋黄被大量浪费，而且现有技术生产的蛋清溶菌酶纯度不高，影响溶菌酶的品质。
技术实现要素：
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种溶菌酶的发酵方法，解决了现有的蛋清溶菌酶在生产时，不能利用生产时的蛋黄液，使得蛋黄被大量浪费，而且现有技术生产的蛋清溶菌酶纯度不高，影响溶菌酶品质的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种溶菌酶的发酵方法，具体包括以下步骤：
步骤一：装柱，阳离子交换树脂cm-sephdex用稀缓冲盐水溶液浸泡一昼夜，并不时轻轻搅动使之平衡，在与此溶剂平衡期间，让装柱的cm-sephdex材料沉降，用倾泻法除掉悬液中漂浮的小颗粒，然后装柱，注意装柱时不要夹入气泡，柱的大小视加工规模而定；
步骤二：收集提取液，收集鸡蛋清，用双层纱布过滤以除去碎蛋壳及胚索后，按其体积的两倍量加入水，小心搅拌使其混合，需要注意的是，搅拌时速度不宜过快；搅拌方向不得中途改变；不能起泡、搅棒应该光滑等，否则将可能引起蛋白质变性；
步骤三：ph沉淀，向上述提取液中十分缓慢地加入0.5摩尔/升的盐酸，边加入边搅拌，将混合液的ph值调节至7.5(注意盐酸不要过量)，片刻后，在放有玻璃棉塞的过滤漏斗中过滤此混合物以除去蛋白质沉淀，收集起滤液，然后向滤液中加入浓缓冲盐水熔液，测定此溶液的ph值为8.2，如若不是，视具体情况用0.5摩尔/升的盐酸或氢氧化钠溶液将ph值调至8.2；
步骤四：柱层析，小心地将上述液体加到cm-sephdex柱中，当抽提液进入柱中后，先用适量的稀缓冲盐水液洗，然后用前述配得的ph＝10.5的碳酸钠--碳酸氢钠缓冲液洗脱，收集洗脱液直到溶菌酶全部从柱上洗脱时为止；
步骤五：结晶，将上述收集到的洗脱液用0.5摩尔/升的氢氧化钠溶液调节其ph值到其等电点后，再慢慢加入氯化纳细粉使共最终浓度为0.3摩尔/升，注意要边加入边搅拌，使氯化纳及时溶解，以避免局部盐浓度过高或沉积于容器的底部，加完后在低温下(5℃以下)静置3--4天让其结晶，如结晶已完全形成，则吸去上层清液后，便可离心分离出晶体。
优选的，所述ph为8.2的氯化钠—tris-edta浓缓冲盐溶波为每升水中加入市购的氯化钠及tris-edta各0.5摩尔配制而成，所述稀缓冲盐水液由前述配得的浓缓冲盐水液加水10倍稀释而得。
优选的，所述盐酸溶液和氢氧化钠溶液为0.5摩尔/升的盐酸及氢氧化钠溶液，从化工商店中购得的氢氧化钠及纯度高的盐酸配制而成。
优选的，所述碳酸氢钠缓冲液为ph＝10.5的碳酸钠--碳酸氢钠缓冲液，从化工商店购得的碳酸钠及碳酸氢钠加以配制，以每升水中加入0.8摩尔的碳酸钠及0.2摩尔的碳酸氢钠而成。
优选的，所述步骤二中，蛋黄可用于提取抗绿脓杆菌的生化药品卵黄油或其它用途。
(三)有益效果
本发明提供了一种溶菌酶的发酵方法。与现有技术相比具备以下有益效果：
(1)、该溶菌酶的发酵方法，通过装柱、收集提取液、ph沉淀、柱层析和结晶，阳离子交换树脂cm-sephdex用稀缓冲盐水溶液浸泡一昼夜，并不时轻轻搅动使之平衡，在与此溶剂平衡期间，让装柱的cm-sephdex材料沉降，用倾泻法除掉悬液中漂浮的小颗粒，然后装柱，注意装柱时不要夹入气泡，柱的大小视加工规模而定；收集鸡蛋清，用双层纱布过滤以除去碎蛋壳及胚索后，按其体积的两倍量加入水，小心搅拌使其混合，需要注意的是，搅拌时速度不宜过快；搅拌方向不得中途改变；不能起泡、搅棒应该光滑等，否则将可能引起蛋白质变性；向上述提取液中十分缓慢地加入0.5摩尔/升的盐酸，边加入边搅拌，将混合液的ph值调节至7.5(注意盐酸不要过量)，片刻后，在放有玻璃棉塞的过滤漏斗中过滤此混合物以除去蛋白质沉淀，收集起滤液，然后向滤液中加入浓缓冲盐水熔液，测定此溶液的ph值为8.2，如若不是，视具体情况用0.5摩尔/升的盐酸或氢氧化钠溶液将ph值调至8.2；小心地将上述液体加到cm-sephdex柱中，当抽提液进入柱中后，先用适量的稀缓冲盐水液洗，然后用前述配得的ph＝10.5的碳酸钠--碳酸氢钠缓冲液洗脱，收集洗脱液直到溶菌酶全部从柱上洗脱时为止；将上述收集到的洗脱液用0.5摩尔/升的氢氧化钠溶液调节其ph值到其等电点后，再慢慢加入氯化纳细粉使共最终浓度为0.3摩尔/升，注意要边加入边搅拌，使氯化纳及时溶解，以避免局部盐浓度过高或沉积于容器的底部，加完后在低温下(5℃以下)静置3--4天让其结晶，如结晶已完全形成，则吸去上层清液后，便可离心分离出晶体；通过结晶经分离、干燥后即为溶菌酶成品，纯度不足，通过重结晶方法进一步纯化，将溶菌酶附属的溶质溶于溶剂后，将溶剂进行吸附后，将溶质进行重结晶便可以纯化。
(2)、该溶菌酶的发酵方法，通过收集提取液，收集鸡蛋清，用双层纱布过滤以除去碎蛋壳及胚索后，按其体积的两倍量加入水，小心搅拌使其混合，需要注意的是，搅拌时速度不宜过快；搅拌方向不得中途改变；不能起泡、搅棒应该光滑等，否则将可能引起蛋白质变性，蛋黄可用于提取抗绿脓杆菌的生化药品卵黄油或其它用途，解决了现有的蛋清溶菌酶在生产时，不能利用生产时的蛋黄液，使得蛋黄被大量浪费的情况的出现，可以将蛋黄进行利用，来生产其他产品，增加的经济效益，提个工厂的收益。
具体实施方式
对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供一种技术方案：一种溶菌酶的发酵方法，具体包括以下步骤：
步骤一：装柱，阳离子交换树脂cm-sephdex用稀缓冲盐水溶液浸泡一昼夜，并不时轻轻搅动使之平衡，在与此溶剂平衡期间，让装柱的cm-sephdex材料沉降，用倾泻法除掉悬液中漂浮的小颗粒，然后装柱，注意装柱时不要夹入气泡，柱的大小视加工规模而定；
步骤二：收集提取液，收集鸡蛋清，用双层纱布过滤以除去碎蛋壳及胚索后，按其体积的两倍量加入水，小心搅拌使其混合，需要注意的是，搅拌时速度不宜过快；搅拌方向不得中途改变；不能起泡、搅棒应该光滑等，否则将可能引起蛋白质变性；
步骤三：ph沉淀，向上述提取液中十分缓慢地加入0.5摩尔/升的盐酸，边加入边搅拌，将混合液的ph值调节至7.5(注意盐酸不要过量)，片刻后，在放有玻璃棉塞的过滤漏斗中过滤此混合物以除去蛋白质沉淀，收集起滤液，然后向滤液中加入浓缓冲盐水熔液，测定此溶液的ph值为8.2，如若不是，视具体情况用0.5摩尔/升的盐酸或氢氧化钠溶液将ph值调至8.2；
步骤四：柱层析，小心地将上述液体加到cm-sephdex柱中，当抽提液进入柱中后，先用适量的稀缓冲盐水液洗，然后用前述配得的ph＝10.5的碳酸钠--碳酸氢钠缓冲液洗脱，收集洗脱液直到溶菌酶全部从柱上洗脱时为止；
步骤五：结晶，将上述收集到的洗脱液用0.5摩尔/升的氢氧化钠溶液调节其ph值到其等电点后，再慢慢加入氯化纳细粉使共最终浓度为0.3摩尔/升，注意要边加入边搅拌，使氯化纳及时溶解，以避免局部盐浓度过高或沉积于容器的底部，加完后在低温下(5℃以下)静置3--4天让其结晶，如结晶已完全形成，则吸去上层清液后，便可离心分离出晶体。
ph为8.2的氯化钠—tris-edta浓缓冲盐溶波为每升水中加入市购的氯化钠及tris-edta各0.5摩尔配制而成，稀缓冲盐水液由前述配得的浓缓冲盐水液加水10倍稀释而得，盐酸溶液和氢氧化钠溶液为0.5摩尔/升的盐酸及氢氧化钠溶液，从化工商店中购得的氢氧化钠及纯度高的盐酸配制而成，碳酸氢钠缓冲液为ph＝10.5的碳酸钠--碳酸氢钠缓冲液，从化工商店购得的碳酸钠及碳酸氢钠加以配制，以每升水中加入0.8摩尔的碳酸钠及0.2摩尔的碳酸氢钠而成，步骤二中，蛋黄可用于提取抗绿脓杆菌的生化药品卵黄油或其它用途。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。