一种抑制猪流行性腹泻病毒感染的多肽及应用的制作方法

本发明涉及病毒学、生物信息学和细胞生物学领域，特别是涉及一种抑制猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)感染的多肽及其应用。

背景技术：

猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea，ped)是一种高度接触性猪肠道传染病，以发病猪呕吐、水样腹泻、脱水为主要特征。ped对各年龄阶段的猪都会造成影响，尤其对7日龄以内的哺乳仔猪具有高致死性，病死率高达100％。ped已对我国养猪业造成巨大的经济损失，成为制约国内养猪业健康发展的传染病之一。ped病原猪流行性腹泻病毒(pedvirus，pedv)是一种具有囊膜的单股正链rna病毒，属于套式病毒目(nidovirales)冠状病毒科(coronaviridae)α-型冠状病毒属(alphacoronavirus)，具有特征性的冠状病毒囊膜“纤突”结构。其中，pedv纤突糖蛋白(spikeglycoprotein，s)含有保守的七价重复1区(heptadrepeat1，hr1)和七价重复2区(heptadrepeat2，hr2)。hr1和hr2最终形成融合中心(fusioncore)完成病毒囊膜与宿主细胞靶膜融合这一关键过程，发挥着重要的致病和免疫学功能。虽然已有针对其他冠状病毒hr2的抗病毒学研究，但是基于pedvhr2抗病毒感染尚有待全面阐明。

技术实现要素：

针对现有研究的不足，本发明的目的是提供一种抑制猪流行性腹泻病毒感染的多肽及应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种抑制猪流行性腹泻病毒感染的多肽，其氨基酸序列为：natylnltgeiadleqrseslrntteelqsliyninntlvdl。

以所述多肽序列为核心，任何对所述多肽序列的优化、修饰，包括对多肽片段的截短。

一种多肽在制备猪流行性腹泻抗病毒疫苗和药物中的应用。

本发明根据生物信息学预测pedvhr2，通过氨基酸序列比对设计了基于hr2的衍生多肽并进行合成。本发明利用合成的hr2衍生多肽对pedv感染宿主小肠上皮细胞ipec-j2过程进行抑制；通过荧光定量pcr鉴定，合成多肽具有抑制病毒感染宿主细胞的作用，可应用于抗pedv感染。

本发明有益效果：

1、本发明综合利用病毒学、生物信息学和细胞生物学等技术，提供了一种抑制pedv感染的多肽，利用本发明所述的合成多肽可抑制pedv感染宿主细胞；

2、本发明提供的多肽信息丰富了pedvfusioncore功能，为后续研究pedv膜融合机制提供参考；

3、本发明提供的多肽可应用于制备pedv抗病毒疫苗和药物。

附图说明

图1是pedvhr1和hr2预测情况。

图2是pedvhr1和hr2氨基酸序列示意图。

图中，pedv氨基酸序列在上，hcov-nl63氨基酸序列在下；氨基酸序列第982位至第1121位、第1278位至第1317位分别代表预测的hr1和hr2(窄框)，第1005位至第1061位、第1273位至第1314位分别代表设计的hr1和hr2衍生多肽(宽框)。

图3是pedvhr1和hr2衍生多肽特征分析情况。

图中，七价重复氨基酸残基位置可用a、b、c、d、e、f和g表示，其中a和d位置的氨基酸残基为疏水性氨基酸或含有很大侧链的氨基酸。

图4是hr1和hr2合成衍生多肽抑制pedv感染宿主细胞情况。

图中，ns表示p>0.05，***表示p<0.001。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1.pedvhr2预测

通过在线软件learncoil-vmf(http://night-ingale.lcs.mit.edu/cgi-bin/vmf)对pedvch/hubei/2016毒株s蛋白的hr1和hr2进行预测。learncoil-vmf软件识别典型的hr特征，即在hr1和hr2中大约各自有3～4个七价重复，每个重复都从亮氨酸或异亮氨酸开始。结果如图1所示，pedvs蛋白预测的hr1和hr2分别位于第982-1121位氨基酸和第1278-1317位氨基酸。

实施例2.pedvhr2衍生多肽设计

参考fusioncore晶体结构已经解析的人冠状病毒nl63(hcov-nl63)hr1和hr2氨基酸序列(图2，宽框)，对pedvhr1和hr2衍生多肽进行设计，最终分别选取第1005-1061位氨基酸和第1273-1314位氨基酸作为hr1和hr2衍生多肽序列，氨基酸序列分别为saignitsafesvkeaisqtskglntvahaltkvqevvnsqgaaltqltvqlqhnfq(seqidno.1)和natylnltgeiadleqrseslrntteelqsliyninntlvdl(seqidno.2)。经分析，其氨基酸组成符合冠状病毒七价重复特征，即一组整齐排列的七价重复氨基酸残基，其残基位置可用a、b、c、d、e、f和g表示，其中a和d位置的氨基酸残基为疏水性氨基酸或含有很大侧链的氨基酸(图3)。将hr1和hr2衍生多肽交由上海吉尔生化有限公司合成，纯度均大于95％。

实施例3.pedvhr2衍生多肽抑制pedv感染宿主细胞

3.1pedvhr2衍生多肽抑制pedv增殖

将pedv宿主小肠上皮细胞ipec-j2按2×10⁵个/ml，500μl/孔铺设24孔板，于37℃co2培养箱中培养24h。使用无血清dmem培养基(美国gibco公司)分别稀释pedvch/hubei/2016毒株和hr1、hr2合成衍生多肽，病毒感染复数(moi)为1，合成衍生多肽终浓度为0.1-1000nm，以只含病毒和二甲基亚砜(dmso)的dmem培养基为对照。将moi＝1的病毒和终浓度为0.1-1000nm的合成衍生多肽混匀后，37℃放置1h。使用pbs洗板3遍，每孔加入500μl混合液，每组处理细胞设置三个重复孔。37℃孵育1h后，pbs洗板3遍，洗去没有与ipec-j2细胞结合的病毒和合成衍生多肽，加入500μl细胞维持液(含100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素，质量分数0.3％胰蛋白胨磷酸盐肉汤和质量分数0.03％酵母浸出粉的dmem培养基)，37℃培养12h。弃去上清，收集细胞，通过荧光定量pcr方法检测细胞内感染病毒的含量。该实验独立重复三次。

3.2荧光定量pcr检测pedvhr2衍生多肽抑制pedv感染宿主细胞

使用rna提取试剂trizol(美国invitrogen公司)提取pedv感染细胞的总rna，使用primescript^tm反转录试剂盒(takara公司)生成互补dna(cdna)作为荧光定量pcr模板。采用相对荧光定量pcr对感染细胞内的病毒含量进行测定，以pedv核衣壳蛋白(n)mrna含量表示病毒的含量，以3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)为内参，采用2^-δδ^ct法对数据进行分析。引物和反应体系见表1和表2，反应程序使用abi荧光定量pcr仪自带fast测序(美国appliedbiosystems公司)。

表1相对荧光定量pcr引物序列

表2相对荧光定量pcr反应体系

实验数据以组平均值和均值标准误差(sem)表示，统计学分析利用origin软件非配对双尾studentt检验进行。p>0.05为无统计学差异，p<0.05为有统计学差异，p<0.01为有显著统计学差异，p<0.001为有极其显著的统计学差异。

结果如图4显示，0.1-1000nmhr1合成衍生多肽均没有明显抑制作用，而hr2合成衍生多肽即使在0.1nm低浓度下也能够显著降低细胞内病毒的含量，表明hr2合成衍生多肽具有抑制病毒感染宿主细胞的作用。

以上所述仅为本发明较佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>河南省农业科学院

<120>一种抑制猪流行性腹泻病毒感染的多肽及应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

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<212>prt

<213>猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrheavirus)

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<213>猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrheavirus)

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