条纹斑竹鲨免疫球蛋白新抗原受体可变区库引物及应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种条纹斑竹鲨免疫球蛋白新抗原受体可变区库引物及应用。

背景技术：

抗体可分为双链抗体与单链抗体。双链抗体,也称为传统抗体(vh)，它的单体是由四条肽链形成的对称结构，主要包括两条轻链和两条重链，重链和轻链之间由二硫键连接。双链抗体由于分子大、结构复杂、价格昂贵限制了它们的生产及在临床应用上的推广。

相对于传统抗体，在驼科动物和软骨鱼类中存在着天然的缺失轻链的纯重链抗体，其可变区被称为“纳米抗体”，具有分子量小、毒性低、组织渗透性强、溶解性好、易改造与表达的特点，它们能克服传统抗体的不足，并有望治疗更多的疾病，并大大降低抗体药物的生产成本。

鲨鱼和骆驼是两种能够产生纯重链抗体的物种，鲨鱼产生的重链抗体被称为免疫球蛋白新抗原受体(ignewantigenreceptor,ignar)，ignar是同型二聚体，其中每条链由五个恒定结构域，以及与抗原结合的可变结构域(vnar)组成。由于鲨鱼抗体产生于高渗透压(约5倍于正常动物)和高蛋白变性(350mm的尿素)的环境中，因此比驼科抗体具有更高的稳定性。鲨鱼抗体的热稳定性在85摄氏度以上。并且，抗体领域的相关专利基本上都已经掌握在大型药企手中，但在利用鲨鱼进行抗体的制备方面，尚无专利壁垒，因此是一良好的契机。再者，众多的鲨鱼品种中，条纹斑竹鲨(chiloscylliumplagiosum)不属于濒危鲨鱼种类，且体型小、易于人工繁养，最适合做抗体开发。

但是，目前条纹斑竹鲨的全基因组序列未知，对其免疫组库的研究较少，很大程度上限制了其纳米抗体的开发。针对条纹斑竹鲨vnar的扩增，目前的文献仅报道了使用一对引物进行扩增，而该对引物是根据其它种类的鲨鱼设计的。由于鲨鱼vnar基因序列的多样性，决定了仅用目前报道的引物进行免疫组库的扩增建库，必定会造成数据的损失。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种扩增条纹斑竹鲨免疫球蛋白新抗原受体可变区的成套引物。

本发明提供了成套引物，其包括引物组甲和引物组乙；

所述引物组甲包括50条引物中的至少一条；

所述50条引物分别为序列13所示的单链dna分子或其衍生物至序列62所示的单链dna分子或其衍生物；

所述引物组乙包括42条引物中的至少一条；

所述42条引物分别为序列63所示的单链dna分子或其衍生物至序列104所示的单链dna分子或其衍生物。

上述成套引物中，每条所述单链dna分子的衍生物为将该条单链dna分子的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与该条单链dna分子具有相同功能的dna分子。

上述成套引物中，所述引物组甲中的各条引物的配比均为等摩尔比；

和/或，所述引物组乙中的各条引物的配比均为等摩尔比；

上述成套引物中，所述引物组甲中一条引物与所述引物组乙中的一条引物的摩尔比为1：10-10：1；

优选地，所述引物组甲中一条引物与所述引物组乙中的一条引物的摩尔比具体为5:6。本发明第二个目的是提供含有上述成套引物的pcr试剂或试剂盒。

上述pcr试剂中，所述引物组甲中每条引物在所述pcr试剂中的浓度为0.004μm～0.2μm；

和/或，所述引物组乙中每条引物在所述pcr试剂中的浓度为0.004μm～0.2μm；

优选地，所述所述引物组甲中每条引物在所述pcr试剂中的浓度为0.004μm；

优选地，所述引物组乙中每条引物在所述pcr试剂中的浓度为0.0048μm。

上述产品中，每个引物均为独立包装。

本发明还提供了一种制备上述pcr试剂或试剂盒的方法，包括如下：将上述成套引物中每条引物单独包装，制备产品。

本发明还提供了上述的成套引物或上述pcr试剂或试剂盒在如下中的应用：

e1)扩增条纹斑竹鲨的免疫球蛋白新抗原受体的可变区；

e2)构建条纹斑竹鲨的免疫球蛋白新抗原受体的可变区文库；

e3)扩增条纹斑竹鲨的免疫球蛋白新抗原受体基因簇；

e4)制备条纹斑竹鲨的免疫球蛋白新抗原受体的可变区产品；

e5)制备条纹斑竹鲨的免疫球蛋白新抗原受体产品。

本发明第三个目的是提供一种扩增条纹斑竹鲨的的免疫球蛋白新抗原受体的可变区的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：使用上述的成套引物对条纹斑竹鲨进行多重pcr扩增，实现扩增条纹斑竹鲨的的免疫球蛋白新抗原受体的可变区。

本发明第四个目的是提供一种构建条纹斑竹鲨的免疫球蛋白新抗原受体的可变区核酸文库的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：使用上述方法进行扩增获得扩增产物，将所述扩增产物进行核酸文库构建，实现构建条纹斑竹鲨的免疫球蛋白新抗原受体的可变区文库。

本发明还提供了由上述方法扩增得到的条纹斑竹鲨的免疫球蛋白新抗原受体的可变区。

本发明第五个目的是提供一种条纹斑竹鲨的免疫球蛋白新抗原受体的可变区。

本发明提供的可变区，其包括如下a-d中至少一种，

(a)所述可变区为如下a1)-a4)中任一所示的核酸分子：

a1)编码区包括序列表中序列1第1-276位核苷酸；

a2)编码区包括序列2第1-282位核苷酸；

a3)编码区包括序列3第1-288位核苷酸；

a4)与a1)或a2)或a3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码相同蛋白的dna分子；

a5)在严格条件下与a1)或a2)或a3)限定的核苷酸序列杂交，且编码相同蛋白的dna分子；

(b)所述可变区为如下b1)-b4)中任一所示的核酸分子：

b1)编码区包括序列表中序列4第1-268位核苷酸；

b2)编码区包括序列5第1-247位核苷酸；

b3)编码区包括序列6第1-264位核苷酸；

b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码相同蛋白的dna分子；

b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码相同蛋白的dna分子；

(c)所述可变区为如下c1)-c4)中任一所示的核酸分子：

c1)编码区包括序列表中序列7第1-254位核苷酸；

c2)编码区包括序列8第1-254位核苷酸；

c3)编码区包括序列9第1-254位核苷酸；

c4)与c1)或c2)或c3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码相同蛋白的dna分子；

c5)在严格条件下与c1)或c2)或c3)限定的核苷酸序列杂交，且编码相同蛋白的dna分子；

(d)所述可变区为如下d1)-d4)中任一所示的核酸分子：

d1)编码区包括序列表中序列10第1-256位核苷酸；

d2)编码区包括序列11第1-256位核苷酸；

d3)编码区包括序列12第1-256位核苷酸；

d4)与d1)或d2)或d3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码相同蛋白的dna分子；

d5)在严格条件下与d1)或d2)或d3)限定的核苷酸序列杂交，且编码相同蛋白的dna分子。

本发明第六个目的是提供一种条纹斑竹鲨的免疫球蛋白新抗原受体的基因簇。

本发明提供了一种条纹斑竹鲨的免疫球蛋白新抗原受体的基因簇，其包括由上述方法扩增得到的条纹斑竹鲨的免疫球蛋白新抗原受体的可变区；

或本发明提供了一种条纹斑竹鲨的免疫球蛋白新抗原受体的基因簇，其包括上述条纹斑竹鲨的免疫球蛋白新抗原受体的可变区。

本发明在自主完成的条纹斑竹鲨全基因组测序项目基础上，设计了一套更为全面的新抗原受体可变区(vnar)扩增引物，为开发条纹斑竹鲨中的纳米抗体奠定良好的基础。

本发明的实验证明，发明人在自主完成条纹斑竹鲨基因组测序基础上，获得了条纹斑竹鲨的基因组信息，进一步分析了条纹斑竹鲨的免疫相关基因，从其基因组上共发现编码ignar的4个基因簇。在此基础上，针对每个基因簇，设计了一组特异的扩增引物，包括位于v基因区域的正向引物(表3)和位于c基因的反向引物(表4)。这些引物覆盖了所有的ignar基因簇，能够扩增得到全长的vnar序列。所以，利用这些引物进行多重pcr扩增，可以得到更完整的vnar序列库。目前文献中用于做vnar扩增的引物只有一对，能够扩增出所对应的基因簇1。而在条纹斑竹鲨的基因组上，发现了共4个ignar基因簇，并且通过本发明中的引物，能够扩增出全部基因簇所对应的vnar序列。所以认为本发明中的引物能够扩增出完整的vnar库序列。

附图说明

图1为对vnar的扩增。其中，1为基因簇1对应的vnar，2为基因簇2对应的vnar，3为基因簇3对应的vnar，4为基因簇4对应的vnar；m为200bpdna分子标准。

图2为扩增出的vnar片段克隆至pmd18-t载体后进行的克隆pcr。基因簇编号下面的泳道为对应的克隆编号。m为200bpdna分子标准。

图3为条纹斑竹鲨基因簇结构以及对应的引物位置。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明中ignar基因簇的结构如下：v-d-d-d-d-j-c；v-d-j-c基因发生重排，编码一类鲨鱼特有的免疫球蛋白，即ignar抗体。vnar是指ignar抗体上的可变区，由重排后的v-d-j基因(不包括c基因)编码。

实施例1、条纹斑竹鲨ignar基因簇引物的设计及合成

在自主完成的条纹斑竹鲨全基因组测序基础上，获得了条纹斑竹鲨的全基因组信息，进一步分析了条纹斑竹鲨的免疫相关基因，从基因组上发现了编码ignar的4个基因簇。在此基础上，针对每个基因簇，设计了一组特异的扩增引物。

图1为对vnar的扩增。

4个基因簇的4种v基因序列如表1：

表1条纹斑竹鲨ignar基因簇v基因序列

说明：表中，v_1、v_2、v_3、v_4为4个基因簇的4种v基因。

4个基因簇的ch1基因序列如表2；完整的c基因包含6个外显子，分别为ch1、ch2、ch3、ch4、ch5和ch6。ch1与j基因相连，引物一般设计在这个区域。

表2条纹斑竹鲨ignar基因簇ch1基因序列

说明：表中，ch1_1、ch1_2、ch1_3、ch1_4为4个基因簇的4种ch1基因。

针对发现的v基因和ch1基因，设计用于扩增vnar的引物，引物设计软件是primer5.0和oligo7等，扩增vnar的引物由如下表3和表4所示的引物组成，条纹斑竹鲨基因簇结构以及对应的引物位置如图3所示。

表3条纹斑竹鲨ignar基因簇v基因引物序列集合

表4条纹斑竹鲨ignar基因簇c基因引物序列集合

说明：上表所示r代表ag任意一种；y代表ct任意一种；m代表ac任意一种；k代表gt任意一种；s代表gc任意一种；w代表at任意一种。

实施例2、条纹斑竹鲨ignar基因簇引物的应用

1、多重pcr扩增

提取条纹斑竹鲨脾脏的cdna，用表3和表4所示的引物进行多重pcr扩增，得到扩增产物。具体如下：

将表3所示的各个引物经化学合成，用无酶水(dnaseandrnase-freewater)稀释至10μm，然后将引物等摩尔量混合，即为正向混合引物；

将表4所示的各个引物经化学合成，用无酶水(dnaseandrnase-freewater)稀释至10μm，然后将引物等摩尔量混合，即为反向混合引物；

将上述正向混合引物和反向混合引物加入如下pcr扩增的体系中：

上述pcr扩增的反应程序如下：

2、测序

将上述扩增产物克隆至pmd18-t载体，转化到大肠杆菌中，得到多个克隆。

图2为扩增出的vnar片段克隆至pmd18-t载体后进行的克隆pcr。

挑出多个克隆进行测序，将测序结果与表1中的v基因序列进行比对，通过相似性即能判断序列来自于哪个簇。

每个基因簇随机挑取3个克隆的测序结果如表5所示：

扩增所得序列为免疫球蛋白新抗原受体可变区vnar序列，3个克隆扩增产物序列如表5所示。

表5条纹斑竹鲨ignar引物扩增片段序列

其中，下划线部分为c区序列；未带下划线部分为vnar序列。

经比对分析，所有扩增序列均为vnar序列+c区部分序列，表明所设计的引物能够成功地扩增vnar。并且，除了基因簇1以外，另外3个基因簇也能够成功扩增出。vnar的序列多样性非常多，由v-d-j基因之间的重排导致。

序列表

<110>深圳华大生命科学研究院

<120>条纹斑竹鲨免疫球蛋白新抗原受体可变区库引物及应用

<160>112

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>359

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

acgaccacaaaggaggcaggcgaatcactgaccatcaattgcgtcctaagagattccagc60

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<210>2

<211>365

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

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<210>3

<211>371

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

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<210>4

<211>345

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

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<210>5

<211>324

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

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<210>6

<211>341

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

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<210>7

<211>340

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

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<210>8

<211>340

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

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<210>9

<211>340

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

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<210>10

<211>337

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

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<210>11

<211>337

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

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<210>12

<211>337

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

gggcgaatctttaaccatcaactgcgtcctaagagatgttaactacggattgtacagcac60

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agttgaggacagtggcacgtatagatgtggagcatgtgacgatataactggacatagctg240

tctgttctactaccaaaaagggagtggcaccgttctgactgtgaaccctggactacagcc300

tactgcaccagtcatcagtctattttattctgcaact337

<210>13

<211>14

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

tttactcaatgggt14

<210>14

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

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<210>15

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

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<210>16

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

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<210>17

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

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<211>18

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<213>人工序列

<400>18

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

gaacaaacaccgacaacgaca21

<210>20

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

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<210>21

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>21

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<210>22

<211>20

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<213>人工序列

<400>22

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<210>23

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>23

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<211>16

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<213>人工序列

<400>24

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<210>25

<211>11

<212>dna

<213>人工序列

<400>25

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<210>26

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>26

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<211>23

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<213>人工序列

<400>27

ccaaacaccgaaaacgataataa23

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<211>16

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<213>人工序列

<400>28

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<210>29

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>29

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<210>30

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>30

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<210>31

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<213>人工序列

<400>31

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>32

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>33

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<210>34

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>34

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<210>35

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>35

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<210>36

<211>18

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<213>人工序列

<400>36

ccgaaaacgataataagg18

<210>37

<211>23

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<213>人工序列

<400>37

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<210>38

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>38

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<210>39

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>39

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<210>40

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>40

cttcaaggattgatcaaaaaccga24

<210>41

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>41

ggaccaaacaccgaaaac18

<210>42

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>42

cgagatcagcaacaaaaac19

<210>43

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>43

caccgagaacaataacgaagg21

<210>44

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>44

caccgaaaacgataataag19

<210>45

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>45

aaccgagatcagcaac16

<210>46

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>46

ggttgaccaaacaccgagaac21

<210>47

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>47

ggaccaaacaccgaaaacg19

<210>48

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>48

gatcaaaaaccgagatcagc20

<210>49

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>49

ccaaacaccgaaaacgataa20

<210>50

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>50

cgacaacaaaggaggcag18

<210>51

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>51

caataacgaaggagacaggc20

<210>52

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>52

cgataataaggggggcaaccgaa23

<210>53

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>53

cagcaacaaaaacttcgg18

<210>54

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>54

gaggcaggcgaatcactgac20

<210>55

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>55

agacaggcgaatcactgacca21

<210>56

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>56

ggcaaccgaatcactgaccatc22

<210>57

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>57

tcgggcgaatctttaaccatc21

<210>58

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>58

cgaatcactgaccatcaattgcg23

<210>59

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>59

atcactgaccatcaac16

<210>60

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>60

cactgaccatcaactgcgtc20

<210>61

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>61

tttaaccatcaactgcgtc19

<210>62

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>62

cctaaaagatgctagcta18

<210>63

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>63

cgatgttgaactaatttc18

<210>64

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>64

ctgttgaatgaatttcctttc21

<210>65

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>65

ctgaactaatttcttttctg20

<210>66

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>66

ggtagcagaatgagaaac18

<210>67

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>67

gcagaatgggaaacttgac19

<210>68

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>68

gtttcagaatgggaaacgtgac22

<210>69

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>69

gcagaatgaaaaacatgacagc22

<210>70

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>70

cttgacaactgtacacag18

<210>71

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>71

gtgacaactgtatatagaacc21

<210>72

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>72

gacagctgtacatagag17

<210>73

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>73

gtatatagaaccactgct18

<210>74

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>74

gtacatagagccgctgttc19

<210>75

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>75

cgctgctccattcctgca18

<210>76

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>76

ctgctccattcctgcatgg19

<210>77

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>77

actttaagcgaacttgtcg19

<210>78

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>78

gtcgagctaaaatcatcg18

<210>79

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>79

tcatcggtcgctgttttcgt20

<210>80

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>80

tttcgttggagatgtagttgt21

<210>81

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>81

gaaatccgtttgctctctgttct23

<210>82

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>82

gtagttgtaacgtcagaa18

<210>83

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>83

cagaacgtatggtatttcc19

<210>84

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>84

ttcttctgccaggtcactgcaa22

<210>85

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>85

gccaggtcactgcaatgtttt21

<210>86

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>86

ttttcaggatagtacccg18

<210>87

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>87

tgatgagacaaatcagttg19

<210>88

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>88

tgaagaaatccatttgccctct22

<210>89

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>89

ctctgttcttcagttgcaga20

<210>90

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>90

agtagtgtagactgatgattg21

<210>91

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>91

aatccatttgccctctgttct21

<210>92

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>92

cagaaatccgtttactctctgttct25

<210>93

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>93

tcagagtagaggagactga19

<210>94

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>94

gtgtagactgatgattg17

<210>95

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>95

aatccgtttgctctcttttcttc23

<210>96

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>96

gtagaggagactgatgac18

<210>97

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>97

ttgctctcttttcttcagt19

<210>98

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>98

gcagagtagtgtagactgatgaytggt27

<210>99

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>99

cagaataaaatagactgatg20

<210>100

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>100

cagaaatccgtttgctctc19

<210>101

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>101

tggtggagaaggttgtttg19

<210>102

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>102

tggtcgagaagggtatgctc20

<210>103

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>103

ctggtggagaaggctgcgcg20

<210>104

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>104

ctggtgcagtaggctgtagtcc22

<210>105

<211>265

<212>dna

<213>人工序列

<400>105

atgtctttactcaatgggttgaacaaacaccgacaacgacaacaaaggaggcaggcgaat60

cactgaccatcaattgcgtcctaaaaggttccagctatgcattgtgtaacacgtactggt120

atttcacaaaaaagggcgctacaaagaaggagagcttatcaaatggcggacgatacgcgg180

aaacagtgaacaaggcatcaaagtccttttctttgcgaattagtgacctaagagttgaag240

acagtggtacatatcactgtaaagc265

<210>106

<211>270

<212>dna

<213>人工序列

<400>106

ccagatgtctttactgcatgggttgaccaaacaccgagaacaataacgaaggagacaggc60

gaatcactgaccatcaactgtgtcctaaaagatgctagctatgcattgagtggcacgtac120

tggtatctgacaaaattggatgcaacaaagtgggaccgcatatcaattggtggacgatac180

tctgaaacagtgaacaagggatcaaagtccttttctttgcgacttcgtgatctgagagtt240

gaagacagtggtgcatatcactgtgaagcg270

<210>107

<211>271

<212>dna

<213>人工序列

<400>107

ccagatgtctttactggttgggtggaccaaacaccgaaaacgataataaggggggcaacc60

gaatcactgaccatcaactgcgtcctaagagatccgagctatgcattttatagcacgtac120

tggtatctaacaaaattgggcgcaacaaacaaggagagcatgtcgattggcggtcggtac180

gctgaaacagtgaacaagggttcaaattccttttcactgcgaattactgatctcagagtt240

gaagacagtggcacttatcagtgtggagcat271

<210>108

<211>255

<212>dna

<213>人工序列

<400>108

atgctccacatctatacgtgccactgtcctcaactctcagatcactaattttcagagaaa60

aggacgataatccctcgtttactgattcaacatatcgttcaccagttgatatgctctcct120

cgtttgttgagcccaattttgtccaataccagcctgtgctgtacaatccgtagttaacat180

ctcttaggacgcagttgatggttaaagattcgcccgaagtttttgttgctgatctcggtt240

tttgatcaatccttg255

<210>109

<211>315

<212>dna

<213>人工序列

<400>109

acaaccttctccaccaatcatcagtctacactactctgcaactgaagaacagagggcaaa60

tggatttcttcaactgatttgtctcatcaccgggtactatcctgaaaacattgcagtgac120

ctggcagaagaacggaaataccatacgttctgacgttacaactacatctccaacgaaaac180

agcgaccgatgattttagctcgacaagttcgcttaaagtgcccctgcgggaatggaacag240

cgactctgtgtacagctgtcaagtttctcattctgctaccagtagtaaccagagaaaaga300

aattagttcaacatc315

<210>110

<211>311

<212>dna

<213>人工序列

<400>110

atacccttctcgaccagtcatcagtctcctctactctgaagaacagagagcaaacggatt60

tctgcagctggtttgtctaatcaacaaattctatcctgaaaacattgcggtgaaatggca120

gaagaatggaaatgccataggttctggctttacaaccacatctccattgaaaacagcgaa180

caacgactttagctctaccagtttgcttaaagtgcccctgcaggaatggagcagcggttc240

tgtgtacagttgtcaagtttcccattctgcaaccagcagtaaccagagaaaggaaattca300

ttcaacagccg311

<210>111

<211>320

<212>dna

<213>人工序列

<400>111

ggcgcgcagccttctccaccagtcatcagtctactctactctgcaactgaagaacagaga60

gtaaacggatttctgcagctggtttgtgtaatcagcggatattatcccgaaacaattgca120

gtgacctggcagaagaatggaaatgctataaattctggcttcacaaccacgcctccaatg180

acaacaacgaccgctgattttagctctacaagttggcttaaagtgcccatgcaggaatgg240

agcagtggttctatatacagttgtcacgtttcccattctgaaaccaacagtaacctcaga300

aaagaaattagttcagcatc320

<210>112

<211>320

<212>dna

<213>人工序列

<400>112

ggcgcgcagccttctccaccagtcatcagtctactctactctgcaactgaagaacagaga60

gtaaacggatttctgcagctggtttgtgtaatcagcggatattatcccgaaacaattgca120

gtgacctggcagaagaatggaaatgctataaattctggcttcacaaccacgcctccaatg180

acaacaacgaccgctgattttagctctacaagttggcttaaagtgcccatgcaggaatgg240

agcagtggttctatatacagttgtcacgtttcccattctgaaaccaacagtaacctcaga300

aaagaaattagttcagcatc320