一种利用普通生化设备分离纯化高温菌株的方法与流程

本发明涉及菌株的分离纯化技术，具体涉及一种利用普通生化设备分离纯化高温菌株的方法。

背景技术：

嗜热微生物一般指能在55℃以上的高温环境中生长繁殖的微生物(郦惠燕,邵靖宇.嗜热菌的耐热分子机制[j].生命科学,200012(1))，是在高温环境下生存的一类微生物，有其特有的适应机制和特定的新陈代谢模式。目前，嗜热微生物的应用越来越引起重视。例如，堆肥过程中高温菌相比于常温菌可以分解更加广泛的有机物质，尤其在堆肥的高温段，高温菌的微生物活性高，生长代谢速率高，能够有效杀死大部分的致病病原菌，保证堆肥最终达到无害化，故高温菌在固废堆肥过程中具有更高的应用价值。

但是，由于嗜热微生物对生长温度的特殊要求，具体要求见参考文献“董锡文,薛春梅,吴玉德.极端微生物及其适应机理的研究进展[j].微生物学杂志,2005(01)”。在分离纯化过程中，若纯化温度过高，则必须提高对生化设备的要求。目前，一般的生化培养箱最高设置温度为60℃，若要筛选出在70℃生长的菌株，则需要专门定制生化设备，耗时耗力。并且，纯化过程中温度过高也会引起固体平板培养基融化，无法形成单一菌落等问题，导致常规的生化培养箱无法得到纯培养物。相应的，若纯化温度过低，则会低于高温菌株的最低生长温度，导致部分高温菌株无法在该温度下生长，从而无法在该平板培养基上得到目标菌种。经文献调研，耐热菌和兼性嗜热菌低于30℃也能生长，最高生长温度分别为45～55℃和50～65℃；专性嗜热菌和极端嗜热菌的最低生长温度40℃，最适生长温度高于65℃；极端嗜热菌的最高生长温度高于70℃(崔静岚,陈晨,秦智慧,俞春娜,沈慧,沈超峰,陈英旭.嗜热菌对有机污染物的降解及其应用研究进展[j].应用生态学报,2012,23(11))。因此如果想要得到高温菌株，纯化温度必须高于40℃，但是也存在中温菌的最高生长温度可达50℃的情况(戴红光.中温菌的分离及其应用[j].矿业快报,2006(10))。因此如果想要得到目标高温菌，纯化温度也必须不低于50℃。再者，为了尽量减少固体培养基在高温下出现融化的风险，因此设定纯化温度为50℃。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术中存在的缺陷，提供一种简单有效、适用性强、普通生化设备也能满足要求的分离纯化高温菌株的方法，从而能够有效的在高温条件下得到纯培养物。

为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案如下：一种利用普通生化设备分离纯化高温菌株的方法，包括以下步骤：

(1)将研磨后的土样加入液体培养基中，在70℃水浴锅中恒温振荡培养48小时，对高温菌进行第一轮筛选；

(2)第一轮筛选得到的培养液经离心后静置，取上清液按体积比1％的比例加入第二轮液体培养基，70℃水浴锅中恒温振荡培养48小时，再次筛选；

(3)将第二轮筛选得到的菌液按10⁰，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5梯度稀释涂布于固体培养基，在50℃恒温生化培养箱倒置48小时得到单菌落，多次纯化得到纯菌。

进一步，如上所述的利用普通生化设备分离纯化高温菌株的方法，其中，所述的液体培养基的制备方法如下：溶解10g胰蛋白胨，5g酵母粉和10g氯化钠，调节ph值至中性后定容至1l制备成液体培养基并高温灭菌。

进一步，如上所述的利用普通生化设备分离纯化高温菌株的方法，其中，所述的固体培养基的制备方法如下：溶解10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，10g琼脂和16g植物凝胶,调节ph值至中性后定容至1l，高温灭菌后倒入平板制备成固体培养基。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明将菌株筛选在70℃水浴锅中进行，菌株分离与纯化在温度50℃的恒温生化设备中进行，就可以利用普通常规生化设备(此类设备一般最高设置温度60℃)纯化出在70℃生长的高温菌株；

(2)本发明选取的50℃纯化温度，满足绝大多数嗜热微生物生长温度，因此此温度适用于绝大部分嗜热微生物的分离；

(3)本发明避免了高温菌研究中由于所需要纯化温度过高导致的固体培养基融化问题；

(4)本发明优化后的固体培养基可以耐受大于50℃的高温；

(5)本发明的高温菌株分离纯化方法操作简单、方便，成本低廉。

附图说明

图1为本发明的分离纯化方法从污泥腐熟土样中分离出的单菌落图片。

图2为本发明的分离纯化方法从污泥腐熟土样中分离出的单菌株的生长情况随温度变化曲线(即按1％的菌液投加量加入液体培养基，测定48h后不同温度下菌液在600nm处吸光度)。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步的详细说明。

1)制备培养基：

液体培养基：溶解10g胰蛋白胨，5g酵母粉和10g氯化钠，用5mol/l的naoh溶液调节ph值至中性后定容至1l制备成液体培养基并高温灭菌。

固体培养基：溶解10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠和10g琼脂，并同时加入16g植物凝胶提高固体培养基的耐高温性能,然后用5mol/l的naoh溶液调节ph值至中性后定容至1l，高温灭菌后倒入平板制备成固体培养基。

2)第一轮筛选高温菌：

将研磨后的污泥腐熟土样加入液体培养基中，在70℃水浴锅恒温振荡培养48h，对高温菌进行第一轮筛选；

3)第二轮筛选高温菌：

第一轮筛选得到的培养液离心后静置30min，取上清液按体积比1％的比例加入新的液体培养基进行第二轮筛选，70℃水浴锅恒温振荡培养48h，筛选得到适应高温生长的较高浓度菌液；

4)分离和纯化高温菌：

将得到的菌液按10⁰，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5梯度稀释，涂布于固体培养基，在50℃的恒温生化培养箱倒置48h得到单菌落，沾取单菌落重新在液体培养基中扩培，得到的菌液按10⁰，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5梯度稀释，涂布于固体培养基，并在50℃的恒温生化培养箱倒置48h培养，此操作重复2次，得到的单菌落认为是纯培养物。

5)菌株鉴定

对步骤4)的纯培养物中得到的菌株(见图1)，命名为p2-1,并进行dna提取，采用细菌通用引物27f-1492r进行pcr扩增,后送至生物公司测序。

该纯培养物的序列分析结果如表1所示：

表1.污泥腐熟土样分离菌株p2-1序列鉴定结果

经过对该菌株在不同温度下生长浓度测定，如图2所示，该菌株最适生长温度温度为50℃，最高耐受温度超过70℃。

以上举例仅是本发明的一个具体实施例。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其同等技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。