一种异鼠李素-3-O-新橙皮苷制备液相色谱分离方法与流程

本发明属于植物药有效成分提取
技术领域：
，具体涉及一种异鼠李素-3-o-新橙皮苷制备液相色谱分离方法。
背景技术：
：香蒲属植物长于池沼、水边或浅沼泽中，世界共有18种，我国约有10种，资源极其丰富。蒲黄，别名蒲棒花粉、蒲草黄系香蒲科(typhaceae)植物水烛香蒲(typhaangustifolial.)、东方香蒲(typhaorientalispresl.)或同属植物的干燥花粉，具有止血、化胶、通淋的功能，用于吐血、崩漏、外伤出血，经闭痛经，血淋涩痛。蒲黄主要含有凶类、黄酬类、长链脂肪侄类化合物、酸性成分、氨基酸、无机成分等。其中黄酬类成分具有改善微循环、降低心脑组织耗氧量、扩张血管、促凝血、抗炎、降低血脂及抗动脉粥样硬化等作用。2015版中国药典中明确规定异鼠李素-3-o-新橙皮苷为蒲黄的特征成分，为此，实际工作中需要高纯度的异鼠李素-3-o-新橙皮苷单体作为对照品使用，特别是在含有蒲黄的药物制剂开发过程当中，如何快速、简捷的得到高纯度的异鼠李素-3-o-新橙皮苷单体是制剂工艺研发中的关键环节之一。目前主要提取分离方法大多数采用溶剂萃取、正相硅胶柱色谱等分离手段，工艺路线繁琐，收率较低，生产过程中试剂消耗大，难以工业化生产，最终产品的纯度不高，使得异鼠李素-3-o-新橙皮苷作为质量控制用对照品难以满足市场需求。技术实现要素：本发明解决了现有技术的不足，提供一种包括醇提浓缩、大孔树脂柱层析、制备液相色谱纯化的异鼠李素-3-o-新橙皮苷制备液相色谱分离方法，经hplc检测纯度大于99.0％，该方法可以连续规模化生产，并且克服了传统方法正相硅胶色谱柱和溶剂萃取的操作繁琐、分离周期长、环境污染严重的缺点，减少了易挥发溶剂的使用，对环境更加友好，效率更高。本发明所采用的技术方案是：一种异鼠李素-3-o-新橙皮苷制备液相色谱分离方法，该方法包括以下步骤：步骤一：醇提浓缩以蒲黄为原料，经醇提浓缩得到蒲黄提取液；步骤二：大孔树脂柱层析将步骤一所述蒲黄提取液加入大孔树脂柱中层析，经洗脱后得到异鼠李素-3-o-新橙皮苷粗品；步骤三：制备液相色谱纯化将步骤二所述异鼠李素-3-o-新橙皮苷粗品通过制备液相色谱仪进行纯化，即采用反相c18色谱柱经流动相等度洗脱，再经后处理得到异鼠李素-3-o-新橙皮苷精品；步骤四：将步骤三所述异鼠李素-3-o-新橙皮苷精品经甲醇溶解、过滤、减压蒸干，溶剂重结晶，最后经过滤、烘干得到高纯度异鼠李素-3-o-新橙皮苷单体。优选的，在步骤一中，将干燥的蒲黄粉碎后与醇溶液混合提取，其中蒲黄与醇溶液的固液比为1：4～1：8，待提取完全后将提取液采用离心机进行离心处理，然后将离心后的溶液在45～60℃下进行真空旋转蒸发除醇，得到蒲黄提取液。更优选的，所述醇溶液为甲醇水溶液或乙醇水溶液中的一种或两种，且所述醇溶液为体积百分浓度为60％～100％的醇水体系。进一步更优选的，在步骤二中，将所述蒲黄提取液注入大孔树脂柱中，先用去离子水冲洗大孔树脂柱，再用体积百分浓度为30～90％的醇溶液梯度洗脱，然后收集体积百分浓度为70～80％的醇溶液洗脱液，再在温度65～80℃下真空旋转蒸发除醇，得到异鼠李素-3-o-新橙皮苷粗品。进一步更优选的，所述大孔树脂柱为ab-8或d101。进一步更优选的，在步骤三，将步骤二所述的异鼠李素-3-o-新橙皮苷粗品用去离子水复溶后，注入制备液相色谱仪中进行纯化，所述反相c18色谱柱规格为250*200mm，硅胶粒径为10～20μm，流速为500～700ml/min，所述流动相由a相与b相混合而成，其中a相为乙腈，b相为体积百分浓度为0.3～0.9％酸水体系，所述等度洗脱比例为20％a相，所述酸水体系中的酸为甲酸、乙酸、磷酸、三氟乙酸中的一种。进一步更优选的，在步骤四中，所述重结晶溶剂为：甲醇、乙醇、丙酮、乙腈中至少一种。相较于现有技术，本发明具有的有益效果：对高纯度异鼠李素-3-o-新橙皮苷单体经过hplc检验纯度，根据文献及核磁图谱解析结果，所得组分为异鼠李素-3-o-新橙皮苷，运用本发明的方法从蒲黄中分离得到异鼠李素-3-o-新橙皮苷单体，其纯度可高达99.0％，该分离方法样品处理量大，重复性好，产品纯度高，适合于实验室以及工业化规模生产，该方法可控，可以连续规模化生产，并且克服了传统方法正相硅胶色谱柱和溶剂萃取的操作繁琐、分离周期长、环境污染严重的缺点，减少了易挥发溶剂的使用，对环境更加友好。附图说明图1是实施例1中步骤一蒲黄提取液分析液相色谱图；图2是实施例1中步骤三制备液相色谱图；具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。实施例一一种异鼠李素-3-o-新橙皮苷制备液相色谱分离方法，该方法包括以下步骤：步骤一：醇提浓缩将10kg干燥的蒲黄粉碎后置于100l提取罐中，与体积百分浓度为60％甲醇混合，其中蒲黄与醇溶液的固液比为1：4，提取三次，每次180min，待提取完全后将提取液采用离心机进行离心处理，然后将离心后的溶液在45℃下进行真空旋转蒸发除醇，得到蒲黄提取液；步骤二：大孔树脂柱层析将步骤一所述的蒲黄提取液注入已经处理好的ab-8大孔吸附树脂柱中层析，先用5倍柱体积的去离子水洗脱，再用体积百分浓度为30％的甲醇溶液洗脱，再用体积百分浓度为60％的甲醇溶液洗脱，再用体积百分浓度为70％的甲醇溶液洗脱，然后收集体积百分浓度为70％的醇溶液洗脱液，再在温度65℃下真空旋转蒸发除醇，得到异鼠李素-3-o-新橙皮苷粗品；步骤三：制备液相色谱纯化将步骤二所述的异鼠李素-3-o-新橙皮苷粗品用去离子水复溶后，注入制备液相色谱仪中进行纯化，所述反相c18色谱柱规格为250*200mm，硅胶粒径为10μm，流速为500ml/min，所述流动相由a相与b相混合而成，其中a相为乙腈，b相为体积百分浓度为0.3％甲酸水体系，所述等度洗脱比例为20％a相，洗脱比例为：时间(min)乙腈(％)水(％)甲酸(％)02079.70.31002079.70.3然后收集13-15min馏份，浓缩得到异鼠李素-3-o-新橙皮苷精品；步骤四：将步骤三所述异鼠李素-3-o-新橙皮苷精品经甲醇溶解、过滤、减压蒸干，然后用甲醇加热溶解放置至室温，最后经过滤、烘干得到高纯度异鼠李素-3-o-新橙皮苷单体。实施例二一种异鼠李素-3-o-新橙皮苷制备液相色谱分离方法，该方法包括以下步骤：步骤一：醇提浓缩将10kg干燥的蒲黄粉碎后置于100l提取罐中，与体积百分浓度为80％乙醇混合，其中蒲黄与醇溶液的固液比为1：6，提取三次，每次180min，待提取完全后将提取液采用离心机进行离心处理，然后将离心后的溶液在55℃下进行真空旋转蒸发除醇，得到蒲黄提取液；步骤二：大孔树脂柱层析将步骤一所述的蒲黄提取液液注入已经处理好的d101大孔吸附树脂柱中层析，先用5倍柱体积的去离子水洗脱，再用体积百分浓度为40％的乙醇溶液洗脱，再用体积百分浓度为60％的乙醇溶液洗脱，再用体积百分浓度为80％的乙醇溶液洗脱，然后收集体积百分浓度为80％的乙醇溶液洗脱液，再在温度75℃下真空旋转蒸发除醇，得到异鼠李素-3-o-新橙皮苷粗品；步骤三：制备液相色谱纯化将步骤二所述的异鼠李素-3-o-新橙皮苷粗品用去离子水复溶后，注入制备液相色谱仪中进行纯化，所述反相c18色谱柱规格为250*200mm，硅胶粒径为15μm，流速为600ml/min，所述流动相由a相与b相混合而成，其中a相为乙腈，b相为体积百分浓度为0.6％乙酸-水体系，所述等度洗脱比例为20％a相，洗脱比例为：时间(min)乙腈(％)水(％)乙酸(％)02079.40.61002079.40.6然后收集13-15min馏份，浓缩得到异鼠李素-3-o-新橙皮苷精品；步骤四：将步骤三所述异鼠李素-3-o-新橙皮苷精品经甲醇溶解、过滤、减压蒸干，然后用乙腈加热溶解放置至室温，最后经过滤、烘干得到高纯度异鼠李素-3-o-新橙皮苷单体。实施例三一种异鼠李素-3-o-新橙皮苷制备液相色谱分离方法，该方法包括以下步骤：步骤一：醇提浓缩将10kg干燥的蒲黄粉碎后置于100l提取罐中，与体积百分浓度为100％甲醇混合，其中蒲黄与甲醇溶液的固液比为1：8，提取三次，每次180min，待提取完全后将提取液采用离心机进行离心处理，然后将离心后的溶液在60℃下进行真空旋转蒸发除醇，得到蒲黄提取液；步骤二：大孔树脂柱层析将步骤一所述的蒲黄提取液液注入已经处理好的ab-8大孔吸附树脂柱中层析，先用5倍柱体积的去离子水洗脱，再用体积百分浓度为50％的甲醇溶液洗脱，再用体积百分浓度为60％的甲醇溶液洗脱，再用体积百分浓度为70％的甲醇溶液洗脱，然后收集体积百分浓度为70％的甲醇溶液洗脱液，再在温度80℃下真空旋转蒸发除醇，得到异鼠李素-3-o-新橙皮苷粗品；步骤三：制备液相色谱纯化将步骤二所述的异鼠李素-3-o-新橙皮苷粗品用去离子水复溶后，注入制备液相色谱仪中进行纯化，所述反相c18色谱柱规格为250*200mm，硅胶粒径为20μm，流速为700ml/min，所述流动相由a相与b相混合而成，其中a相为乙腈，b相为体积百分浓度为0.9％的磷酸-水体系，所述等度洗脱比例为20％a相，洗脱比例为：时间(min)乙腈(％)水(％)磷酸(％)02079.10.91002079.10.9然后收集13-15min馏份，浓缩得到异鼠李素-3-o-新橙皮苷精品；步骤四：将步骤三所述异鼠李素-3-o-新橙皮苷精品经甲醇溶解、过滤、减压蒸干，然后用乙醇加热溶解放置至室温，最后经过滤、烘干得到高纯度异鼠李素-3-o-新橙皮苷单体。上述实施例，只是本发明的较佳实施例，并非用来限制本发明的实施范围，故凡以本发明权利要求所述内容所做的等同变化，均应包括在本发明权利要求范围之内。当前第1页12