一种从铁包金中制备萘吡喃酮粗提物的机械化学提取方法与流程

本发明涉及植物药活性成分提取技术领域，具体涉及一种从铁包金中制备萘吡喃酮粗提物的机械化学提取方法。

背景技术：

铁包金（berchemialineate(l.)dc.）为鼠李科（rhamnaceae）勾儿茶属植物细叶勾儿茶的干燥根或茎。因该植株根的栓毛呈褐色似铁，木质部色黄似金，故名铁包金。铁包金源植株主要分布于我国广东、广西及福建等省区，在韩国、越南、印度、日本等国家也有发现。

铁包金作为我国民间一重要民族药用资源，既可入药成方治疗患者疾病（cn102166275a），也可与蜂花粉、蜂蜜等共同制作保健食品提高人体免疫力（cn102302105a）。

铁包金味淡、微苦、性凉，具有祛风除湿、消炎消肿、凉血解毒、舒筋通络、去瘀活血、暖胃健脾等功效(曾晓君.瑶药铁包金中总黄酮含量的测定[j].广东化工,2017(16):240-241.)，是我国广西壮族自治区和西南少数民族地区常用民族药，最早记录于《岭南采药录》中，现已被收录于《广东省中药材质量标准》、《福建中药材质量标准》和《广西省中药材质量标准》。研究表明，铁包金中含有萘吡喃酮类、黄酮类、苯酚类、蒽醌类、萜类以及二聚体类等化合物（李聪.闽南铁包金化学成分及保肝活性研究[d].华侨大学,2015.沈玉霞,滕红丽,陈小龙等.细叶勾儿茶根的化学成分研究[j].中草药,2010(12):1955-1957.），其中萘吡喃酮类和黄酮类是主要的有效成分。现代药理学研究表明，萘吡喃酮类化合物具有抗菌、抗癌、抗突变、降血脂和抗氧化等作用（耿丹丹,刘灵娣,欧阳艳飞等.决明子中萘并-吡喃酮类化学成分及其生物活性研究进展[j].特产研究,2017(3):64-67.）。

文献研究发现，萘吡喃酮类化合物常用的提取方法包括：冷浸法、加热回流法以及超声提取法（徐义龙,唐力英,周喜丹等.hplc测定决明子中3种萘骈吡喃酮苷含量[j].中国实验方剂学杂志,2014(5):54-56.）。其中，冷浸法工艺简单、成本低，但耗费时间；加热回流法中提取溶剂在提取时可循环使用，但是溶剂用量较多且受热时间较长；超声提取法具有操作简单、可控、提取效率高等特点。目前，已报道的文献中关于铁包金提取工艺的研究较少，其中朱德华等人通过正交实验优化了铁包金的超声提取工艺（朱德华,谭旭明,陈永斌等.正交试验优选铁包金超声提取工艺[j].海峡药学,2018(30):43-45.），但是该工艺中并未述及铁包金中萘吡喃酮类化合物的提取策略。

近年来，机械化学辅助提取技术已被越来越多的研究者成功应用于各类植物有效成分的提取（cn103006724a、cn107684577a、cn101638407a）。该法不再单纯依赖溶剂的极性大小，改变了传统提取方法的原理，主要通过以下两种途径来辅助提取：一是通过机械力使植物细胞产生破壁效应，促进有效成分的释放；二是改变被提取物的结构并改变其溶解性，提取后通过逆反应还原被提取物。机械化学辅助提取时还可利用目标化合物物理化学性质选择性加入固体试剂，不同的助剂会使球磨时的理化条件不同，从而改变目标化合物在提取溶剂中的溶解率；但是，过酸、过碱的条件也可能使目标化合物结构发生改变，进而降低提取率，因此，在进行球磨提取时需要对助剂进行优化（吴菲菲,赵良忠,徐永平等.以氯化钠为助剂的微切变—助剂互作技术辅助提取柑橘皮香精油的研究[j].食品安全质量检测学报,2016(8):3246-3252.）。机械化学辅助提取法不仅提高了目标成分的提取率，还缩短了提取时间、降低了提取条件要求，是一种高效环保的提取方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于从铁包金中制备萘吡喃酮粗提物，提供一种高效的机械化学辅助超声提取方法，以乙醇和水混合溶剂作为提取溶剂，在短时间内获得较高的提取率。

所述的一种从铁包金中制备萘吡喃酮粗提物的机械化学提取方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将铁包金原料干燥、粉碎、过筛，得到铁包金粉末备用；

2）将步骤1）所得铁包金粉末进行机械化学处理，处理过程为：将所述铁包金粉末置于球磨机中进行球磨，球磨转速为100~400rpm，球磨时间5~20min后，得到球磨后的铁包金粉末；

3）将步骤2）所得球磨后的铁包金粉末与提取溶剂以1:20~100的料液比混合，料液比的单位为g/ml，然后置于20~50℃的水浴中超声提取15~60min，超声提取结束后，冷却至室温，过滤，滤液经旋转蒸发除去溶剂后，得到黄褐色萘吡喃酮粗提物；

4）将步骤3）所得粗提物用甲醇复溶后，静置，取上清液过0.22µmptfe膜，然后用超高效液相色谱法进行分析，以萘吡喃酮粗提物的主要成分红镰霉素-6-o-α-l-鼠李糖基-(1-6)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的含量计算粗提物的得率。

所述的一种从铁包金中制备萘吡喃酮粗提物的机械化学提取方法，其特征在于步骤1）中，得到的铁包金粉末的目数在80目以上。

所述的一种从铁包金中制备萘吡喃酮粗提物的机械化学提取方法，其特征在于步骤2）中，球磨机内的球磨填充率在2%~16%，优选为5.36%。

所述的一种从铁包金中制备萘吡喃酮粗提物的机械化学提取方法，其特征在于步骤2）中，球磨转速为200rpm，球磨时间为15min。

所述的一种从铁包金中制备萘吡喃酮粗提物的机械化学提取方法，其特征在于步骤3）中，提取溶剂为石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、水中的任意一种，或者为乙醇和水的混合溶剂，优选为乙醇和水混合溶剂。

所述的一种从铁包金中制备萘吡喃酮粗提物的机械化学提取方法，其特征在于所述乙醇和水的混合溶剂中，乙醇和水的体积比为20~80:20~80，优选为60:40。

所述的一种从铁包金中制备萘吡喃酮粗提物的机械化学提取方法，其特征在于步骤3）中，铁包金粉末与提取溶剂的料液比在1：50；超声提取的温度为40℃，超声提取的时间为45min。

所述的一种从铁包金中制备萘吡喃酮粗提物的机械化学提取方法，其特征在于步骤4）中，采用超高效液相色谱法进行分析的过程为：色谱柱为watersacquitybehshieldrpc18（100×2.1mm，1.7μm）；流速0.2ml/min；进样量1.0μl；柱温40℃；检测波长280nm；流动相a为0.1%甲酸水溶液，流动相b为乙腈；梯度洗脱条件：0～2min，10%b；2～3min，10%～15%b；5～6min，15%～17%b；9～13min，17%～22%b；13～20min，22%～44%b；20～30min，44%～61%b；32～32.5min，61%～69%b；35～36min，10%b。

本发明具有以下优点：

（1）为了提升铁包金的应用价值，本发明采用机械化学辅助超声提取技术提取铁包金中活性成分，目的是优选出从铁包金中制备萘吡喃酮粗提物的较佳提取工艺。本发明首次采用了机械化学联合超声技术提取铁包金中萘吡喃酮类化合物，与传统超声法相比，明显提高了提取产率。

（2）铁包金为我国重要药用资源，本发明为充分利用其药用价值提供了技术支持。本发明的方法成本低廉，提取过程快速、高效，可为铁包金药用资源的综合利用提供技术依据。

（3）本发明工艺简单，绿色环保，成本低廉。

（4）从铁包金中制备萘吡喃酮粗提物，其主要成分红镰霉素-6-o-α-l-鼠李糖基-(1-6)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷，可通过超高效液相色谱法对萘吡喃酮粗提物中的红镰霉素-6-o-α-l-鼠李糖基-(1-6)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷含量进行定量分析，以红镰霉素-6-o-α-l-鼠李糖基-(1-6)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的得率，对本发明从铁包金中制备萘吡喃酮粗提物的提取效率进行评价，所述红镰霉素-6-o-α-l-鼠李糖基-(1-6)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的分子结构式为：

。

附图说明

图1为实施例1从铁包金中制备萘吡喃酮粗提物的机械化学提取工艺流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。

1、本发明涉及到的各仪器及药品规格如下：

pm200行星式球磨机（retsch，德国）；watersacquityuplc超高效液相色谱仪（waters，美国）；xs205dualrange分析天平（mettlertoledo，瑞士）；kh5200de超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；r-215旋转蒸发仪（buchi，瑞士）；barnsteadtii超纯水系统（thermoscientific，美国）。

水为超纯水（实验室自制）；其余试剂均为分析级。

实验所用的样品铁包金来自广东广州，广西河池和福建三明。

2、以下实施例中所述铁包金中萘吡喃酮粗提物中红镰霉素-6-o-α-l-鼠李糖基-(1-6)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的测定，采用超高效液相色谱进行分析。

主要成分的得率是以实验室自制的红镰霉素-6-o-α-l-鼠李糖基-(1-6)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷（纯度≥99.0%）为对照品，采用外标法进行计算。以峰面积y为纵坐标，以上述对照品的质量浓度x（mg/ml）为横坐标，绘制标准曲线，回归方程如下：

y=8×10⁶x-29136，r²=0.9991

萘吡喃酮粗提物中红镰霉素-6-o-α-l-鼠李糖基-(1-6)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的得率的得率（y）计算公式为：

得率y=红镰霉素-6-o-α-l-鼠李糖基-(1-6)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷质量（mg）/铁包金原料质量（g）*100%。

实施例1

将产地为广东广州的铁包金粉碎并过80目筛，得到目数大于80目的铁包金粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述铁包金粉末0.30g，加入直径8mm的不锈钢球磨珠10个（球磨填充率5.4%），球磨时间为15min，球磨转速为200rpm。

称取球磨后的粉末0.10g与乙醇水溶液（v乙醇：v水=60/40）按照料液比1：50混合（料液比单位为g/ml），然后置于40℃的水浴中超声提取45min（超声频率为100hz），过滤，滤液经旋转蒸发除去溶剂后，得到萘吡喃酮粗提物11mg。

取上述所得萘吡喃酮粗提物10.59mg用1ml甲醇溶解，然后取上清液并用0.22µmptfe膜过滤后，进样超高效液相色谱分析，色谱条件如下：色谱柱为watersacquitybehshieldrpc18（100×2.1mm，1.7μm）；流速0.2ml/min；进样量1.0μl；柱温40℃；检测波长280nm；流动相a为0.1%甲酸水溶液，流动相b为乙腈，梯度洗脱条件：0～2min，10%b；2～3min，10%～15%b；5～6min，15%～17%b；9～13min，17%～22%b；13～20min，22%～44%b；20～30min，44%～61%b；32～32.5min，61%～69%b；35～36min，10%b。计算粗提物中红镰霉素-6-o-α-l-鼠李糖基-(1-6)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的得率为143.1%（mg/g）。

实施例1从铁包金中制备萘吡喃酮粗提物的机械化学提取工艺流程图如图1所示。

实施例2

将产地为广东广州的铁包金粉碎并过80目筛，得到目数大于80目的铁包金粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述铁包金粉末0.31g，加入直径8mm的不锈钢球磨珠15个（球磨填充率8.0%），球磨时间为15min，球磨转速为200rpm。

称取球磨后的粉末0.10g，其余后续超声提取条件和超高效液相色谱条件同实施例1，得到萘吡喃酮粗提物11mg。计算粗提物中红镰霉素-6-o-α-l-鼠李糖基-(1-6)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的得率为141.9%（mg/g）。

对比实施例2和实施例1可知，当加入不锈钢球磨珠15个（球磨填充率达到8.0%）的时候，得率不再提高反而呈现略下降的趋势。主要原因在于过高的填充率降低了球磨罐内空间，限制了球磨珠的运动，减小了机械作用力，导致得率下降。

实施例3

将产地为广东广州的铁包金粉碎并过80目筛，得到目数大于80目的铁包金粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述铁包金粉末0.30g，加入直径8mm的不锈钢球磨珠20个（球磨填充率10.7%），球磨时间为15min，球磨转速为200rpm。

称取球磨后的粉末0.10g，其余后续超声提取条件和超高效液相色谱条件同实施例1，得到萘吡喃酮粗提物10mg。计算粗提物中红镰霉素-6-o-α-l-鼠李糖基-(1-6)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的得率为138.5%（mg/g）。

实施例4

将产地为广东广州的铁包金粉碎并过80目筛，得到目数大于80目的铁包金粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述铁包金粉末0.30g，加入直径8mm的不锈钢球磨珠5个（球磨填充率2.7%），球磨时间为15min，球磨转速为200rpm。

称取球磨后的粉末0.10g，其余后续超声提取条件和超高效液相色谱条件同实施例1，得到萘吡喃酮粗提物10mg。计算粗提物中红镰霉素-6-o-α-l-鼠李糖基-(1-6)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的得率为115.8%（mg/g）。

实施例5

将产地为广东广州的铁包金粉碎并过80目筛，得到目数大于80目的铁包金粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述铁包金粉末0.31g，加入直径8mm的不锈钢球磨珠10个（球磨填充率5.4%），球磨时间为20min，球磨转速为200rpm。

称取球磨后的粉末0.10g，其余后续超声提取条件和超高效液相色谱条件同实施例1，得到萘吡喃酮粗提物10mg。计算粗提物中红镰霉素-6-o-α-l-鼠李糖基-(1-6)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的得率为125.4%（mg/g）。

对比实施例5和实施例1可知，当增加球磨时间至20min的时候，得率不再提高反而呈现下降的趋势。主要原因在于球磨机械力作用过长，球磨罐内热量聚集，导致有效成分破坏，得率下降。

实施例6

将产地为广东广州的铁包金粉碎并过80目筛，得到目数大于80目的铁包金粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述铁包金粉末0.31g，加入直径8mm的不锈钢球磨珠10个（球磨填充率5.4%），球磨时间为5min，球磨转速为200rpm。

称取球磨后的粉末0.10g，其余后续超声提取条件和超高效液相色谱条件同实施例1，得到萘吡喃酮粗提物10mg。计算粗提物中红镰霉素-6-o-α-l-鼠李糖基-(1-6)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的得率为118.5%（mg/g）。

实施例7

将产地为广东广州的铁包金粉碎并过80目筛，得到目数大于80目的铁包金粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述铁包金粉末0.30g，加入直径8mm的不锈钢球磨珠10个（球磨填充率5.4%），球磨时间为15min，球磨转速为300rpm。

称取球磨后的粉末0.10g，其余后续超声提取条件和超高效液相色谱条件同实施例1，得到萘吡喃酮粗提物10mg。计算粗提物中红镰霉素-6-o-α-l-鼠李糖基-(1-6)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的得率为131.1%（mg/g）。

对比实施例7和实施例1可知，当转速达到300rpm的时候，得率不再提高反而呈现略下降的趋势。主要原因在于过高的转速产生高能量，导致有效成分破坏，得率下降。

实施例8

将产地为广西河池的铁包金粉碎并过80目筛，得到目数大于80目的铁包金粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述铁包金粉末0.30g，加入直径8mm的不锈钢球磨珠10个（球磨填充率5.4%），球磨时间为15min，球磨转速为200rpm。

称取球磨后的粉末0.10g，其余后续超声提取条件和超高效液相色谱条件同实施例1，得到萘吡喃酮粗提物15mg。计算粗提物中红镰霉素-6-o-α-l-鼠李糖基-(1-6)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的得率为416.9%（mg/g）。

实施例9

将产地为福建三明的铁包金粉碎并过80目筛，得到目数大于80目的铁包金粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述铁包金粉末0.30g，加入直径8mm的不锈钢球磨珠10个（球磨填充率5.4%），球磨时间为15min，球磨转速为200rpm。

称取球磨后的粉末0.10g，其余后续超声提取条件和超高效液相色谱条件同实施例1，得到萘吡喃酮粗提物13mg。计算粗提物中红镰霉素-6-o-α-l-鼠李糖基-(1-6)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的得率为280.8%（mg/g）。

对比实施例1、实施例8和实施例9可以看出，不同产地的铁包金原料中的萘吡喃酮物质含量的差异性很大。

实施例10

将产地为广东广州的铁包金粉碎并过80目筛，得到目数大于80目的铁包金粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述铁包金粉末0.32g，加入直径8mm的不锈钢球磨珠10个（球磨填充率5.4%）和助剂450mg（助剂为氢氧化钠），球磨时间为15min，球磨转速为200rpm。

称取球磨后的粉末0.10g，其余后续超声提取条件和超高效液相色谱条件同实施例1，得到萘吡喃酮粗提物10mg。计算粗提物中红镰霉素-6-o-α-l-鼠李糖基-(1-6)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的得率为42.2%（mg/g）。

实施例11

将产地为广东广州的铁包金粉碎并过80目筛，得到目数大于80目的铁包金粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述铁包金粉末0.31g，加入直径8mm的不锈钢球磨珠10个（球磨填充率5.4%）和助剂450mg（助剂为无水碳酸钠），球磨时间为15min，球磨转速为200rpm。

称取球磨后的粉末0.10g，其余后续超声提取条件和超高效液相色谱条件同实施例1，得到萘吡喃酮粗提物10mg。计算粗提物中红镰霉素-6-o-α-l-鼠李糖基-(1-6)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的得率为49.4%（mg/g）。

实施例12

将产地为广东广州的铁包金粉碎并过80目筛，得到目数大于80目的铁包金粉末。向不锈钢球磨罐中加入所述铁包金粉末0.32g，加入直径8mm的不锈钢球磨珠10个（球磨填充率5.4%）和助剂450mg（助剂为碳酸氢钠），球磨时间为15min，球磨转速为200rpm。

称取球磨后的粉末0.10g，其余后续超声提取条件和超高效液相色谱条件同实施例1，得到萘吡喃酮粗提物10mg。计算粗提物中红镰霉素-6-o-α-l-鼠李糖基-(1-6)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的得率为76.8%（mg/g）。

实施例13~22

重复实施例12的操作步骤，不同之处在于：是否添加助剂、添加的助剂的类型、球磨时间、球磨转速、球磨填充率，具体条件的改变及红镰霉素-6-o-α-l-鼠李糖基-(1-6)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的得率结果参见表1所示。

表1机械化学参数对红镰霉素-6-o-α-l-鼠李糖基-(1-6)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷得率的影响

从实施例1-22可以看出，铁包金原料的产地和球磨的条件参数均对红镰霉素-6-o-α-l-鼠李糖基-(1-6)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的提取率有影响。在加入碱性和强酸性助剂的条件下，对红镰霉素-6-o-α-l-鼠李糖基-(1-6)-o-β-d-吡喃葡萄糖苷的提取率却大大降低，主要原因在于碱性或强酸性环境中的机械力作用对其结构稳定性产生了影响。、

本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。