专利名称：：假单胞菌hn-72以及用其纯化2,6-萘二甲酸的方法
技术领域：
：本发明涉及一种新颖的微生物，该微生物能够将包含在粗萘二曱酸(cNDA)中的2-甲酰基-6-萘甲酸(FNA)(其为2,6-二曱基萘P,6-DMN)的氧化产物)杂质转化为^6-萘二曱酸(NDA),以及用此微生物高纯度纯化2，6-萘二曱酸的方法。
背景技术：
：萘二甲酸的二酯可用于制备各种聚合材料，如聚酯和聚酰胺。特别有用的二酯是2,6-萘二甲酸二甲酯(NDC)。NDC能与乙二醇缩合形成高性能聚酯材料聚2,6-萘二曱酸乙二酯(PEN)。由PEN制成的纤维和薄膜与由聚对苯二曱酸乙二醇酯(PET)制成的那些相比显示出高强度和优越的热性能。基于这些优势，PEN非常适用于商业制品(如能够用于制造磁性录音带和电子元件的薄膜)的生产。另外，由于PEN的高抗气体(特别是二氧化碳、氧气和水蒸气)扩散性，由PEN制成的薄膜能用于制造食品容器，特别是耐热食品容器。PEN还能用于生产可用于轮胎帘布的制造的增强纤维。NDC通常通过氧化2，6-DMN以得到粗萘二曱酸(cNDA)和使cNDA酯化来生产。目前，NDC用作合成PEN的主要原料。然而，当NDC用作合成PEN的原料时，相比于应用2,6-萘二曱酸(NDA)时，存在一些问题。首先，在NDA的缩合期间，形成副产物水，而在NDC的情况下形成副产物甲醇，因而有爆炸的风险。其次，由于纯NDC通过NDA的酯化和酯化产物的纯化生成，相比于应用NDA，包括一个额外的工序。第三，考虑到现有的PET生产诏:备的应用，NDC的应用是不适合的。尽管有这些与NDC的应用相关的问题，NDC还是优选用于生产PEN,因为生产具有合成PEN所需纯度的纯4匕的NDA仍旧困难。氧化2,6-二甲基萘(2,6-DMN)形成含有各种杂质(如2-甲酰基_6-萘甲酸(FNA)、2-萘曱酸和偏苯三酸)的cNDA。特别地，在cNDA中FNA的存在会使用于产生PEN的聚合终止，从而不利地影响最终聚合物(即PEN)的物理性质。因而去除存在于cNDA中的FNA是必要的，但是去除FNA存在困难。在这些情况下，已经进行了许多有关用于去除存在于cNDA中的FNA或纯化NDA的方法的研究。例如，通过以下步骤产生NDA:l)重结晶cNDA，2)多次氧化cNDA,或2)用曱醇处理cNDA以产生NDC并水解NDC。另夕卜，通过cNDA的氬化产生纯化的NDA。另一方面，如溶剂处理、熔融/结晶、高压结晶和超临界萃取等许多方法已被用于纯化NDA,但是这些都不能成功地生产具有令人满意纯度的NDA。这些方法可用于增加NDA的纯度，但L却导致了NDA的低产率，这使得该方法难于在工业上实施。
发明内容本发明考虑到现有技术的问题而产生，并且本发明的一个目的是提供一种用于通过用微生物的生物处理选择性地将FNA(其为含在cNDA中的杂质)转化为NDA的生产高纯度NDA的新颖的方法。依据本发明的一方面，提供了假单胞菌(Pseudomonassp.)HN-W(保藏编号KCTC1081犯P),其具有将2-甲酰基-6-萘甲酸转化成2，6-萘二甲酸的能力。依据本发明的另一方面，提供一种用假单胞菌(Pseudomonassp.)HN-72(保藏编号KCTC10819BP)高纯度纯化2，6-萘二甲酸的方法。本发明的假单胞菌(Pseudomonassp.)菌抹HN-72在将2-甲酰基-6-萘甲酸转化成2,6-萘二甲酸方面具有极好的效果。因此，本发明的假单胞菌(Pseudomonassp.)菌抹HN-72有助于以经济的和环境友好的方式生产高纯度的2，6-萘二甲酸，从而在用于工业应用中是非常重要的。通过以下的详细说明连同随附的附图将更清晰地理解本发明的上述以及其他目的、特征和其他优势，其中图l表示本发明的假单胞菌(Pseudomonassp.)菌抹HN-72的16SrDNA的部分序列。具体实施例方式以下将提供依据本发明的新颖菌抹的更详细的解释。本发明人已成功地从土壤中分离出具有将FNA转化成NDA的能力的新颖的菌抹。通过16srDNA的部分测序确定本发明的新颖的菌抹属于假单胞菌属的细菌，并且称其为假单胞菌(Pseudomonassp.)HN-72。假单胞菌(Pseudomonassp.)菌抹HN-72在2005年6月16日保藏于作为国际保藏单位的KoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology(KRIBB)的基因库中，保藏编号为KCTC-10819BP。本发明的假单胞菌(Pseudomonassp.)菌抹HN-72是一种微生物，其氧化具有与2-甲酰基-6-萘曱酸在相同位置上有曱酰基的2-萘曱醛而将2-萘曱醛的曱酰基转化成羧基。因此，本发明的菌抹能高度选择性地将包含在粗萘二曱酸中的2-曱酰基-6-萘曱酸(其为2,6-二曱基萘的氧化产物)转化为2,6-萘二甲酸。当与芽孢杆菌(Bacillussp.)菌抹F-3(其记载于已提交的专利申请(韩国专利申请No.10_2002-0087819)中)相比时，本发明的假单胞菌(Pseudomonassp.)菌抹HN-72有相当大的改善的转化能力。本发明的假单胞菌(Pseudomonassp.)菌抹HN"72(保藏编号KCTC-10819BP)能容易地在液体培养基中在25~37°C的宽的温度范围内培养。随后将对用本发明的假单胞菌(Pseudomonassp.)菌抹HN-72纯化2，6-萘二曱酸的方法作更详细地说明。特别地，本发明的方法包括步骤1)将假单胞菌(Pseudomonassp.)HN-72(保藏编号KCTC10819BP)接种在液体培养基上，振摇培养接种体，收集培养的细菌，并用生理盐水洗涤收集的细菌以使细菌活化，2)将作为基质的粗萘二曱酸与緩沖液混合，调节混合液的pH以制备用于随后纯化的反应液，和3)将在步骤l)中制备的活性细菌(假单胞菌(Pseudomonassp.)HN-72)与在步骤2)中制备的反应液反应以将含在粗萘二曱酸中的2-曱酰基-6-萘曱酸转化成2,6-萘二曱酸，从而提高2,6-萘二曱酸的纯度。对于在步骤1)中用于培养假单胞菌(Pseudomonassp.)菌抹HN-72的液体培养基，可以无限制地使用LB或M9培养基。假单胞菌(Pseudomonassp.)菌抹HN-72的振摇培养优选在25~37°C的温度范围内，更优选在3(TC下进行。振摇培养后收集的细菌(假单胞菌(Pseudomonassp.)HN-")优选储存在4°C的冷藏器中或冻干从而尽可能长地保持细菌的活性。在步骤2)中使用的緩冲液的类型不特别限制。作为緩沖液，可用水、磷酸钾(KH2P04)-KOH緩冲液、焦磷酸钠-HCl緩沖液、硼酸-NaOH緩冲液、硼酸钠-HCl緩冲液等。优选j吏用磷酸钾-KOH緩冲液或硼酸-NaOH緩冲液。与cNDA的反应降低了反应液的pH。特别地，当与cNDA在反应液中反应完毕后，反应液的pH在7.0~8.0的范围内。因此，pH为6.0-8.0的磷酸钾(KH2P04)-KOH緩冲液优选用作緩冲液。此时，优选缓沖液的浓度为0.01~100mM。另一方面，在随后的cNDA的纯化反应(步骤3)中的反应液的pH是非常重要的反应因素。在步骤2)中，混合液的pH优选调节至7.5~8.3。当反应液的起始pH低于7.5或高于8.3时，在步骤3)中没有反应进行。在步骤2)中，为了溶解cNDA,可以另外将有机溶剂添加至混合液中。优选的有机溶剂的实例包括二曱基亚砜(DMSO)、N,N-二曱基曱酰胺(DMF)、N,N-二曱基乙酰胺(DMA)和四氢呋喃(THF)。在这些物质中，考虑到酶的活性，二曱基亚砜是最优选的。有机溶剂优选以0.01~10%的浓度添加。更优选地，不添加有机溶剂。以超过10%的浓度添加有机溶剂导致微生物的细胞膜被溶解破坏，乂人而阻碍反应。在步骤3)中，反应优选在30~50°C下进行。当反应温度超出此温度范围时，会导致不期望的细菌活性的显著降低。在下文中，将参考下述实施例对本发明的构成和效果进行具体地解释。然而，这些实施例的目的是举例说明，不解释为对本发明的范围的限制。实施例实施例1:菌抹的分离土壤采样自韩国京畿道的废水处理厂、储油库和加油站。将每个土壤样品5g添加到50ml的0.85%生理盐水溶液中，振摇并过滤得到滤液。滤液稀释到适当的水平，涂在含有cNDA的LB固体培养基上，在30℃的培养箱中培养。培养结果，分离出200种微生物。依据如下工序，首先仅篩选出能分解与FNA在相同位置上有甲酰基的2-萘曱醛的微生物。首先，将200种微生物各自接种到lml的LB液体培养基上，在30℃下以200rpm振摇培养16小时。离心分离培养物收集相应的细菌。将收集到的细菌悬浮在lml的0.85%生理盐水溶液中。单独地，将0.2ml的2-萘甲醛溶液(50mg/ml于DMSO溶液中)加入到含有3ml的(3-NAD溶液(0.25mg/ml于100mMKH2P04-KOH(pH8,0)溶液中)的样品试管中，并将0.2ml的DMSO添加到含有3ml的β-NAD溶液(0.25mg/ml于100mMKH2P04-KOH(pH8.0)溶液中)的空白试管中。将试管分别置于分光光度计中，稳定3分钟。当分别添加0.05ml微生物悬浮液于样品试管中后5分钟，在340nm处测定混合物的吸收度。比较样品试管中的混合物的吸收度值与空白试管的吸收度值以确定2-萘曱醛的曱酰基到羧基的氧化。结果，分离出四种具有最小吸收度差异为0.1的微生物。将四种首先筛选出的微生物各自接种在LB液体培养基上，在30℃以200rpm振摇培养16小时。离心分离培养物收集相应的细菌，用0.85%生理盐水溶液洗涤，并与具有表1中所示组成的溶液在30。HPLC的反应浴中反应3小时。反应产物用高效液相色谱(HPLC)分析以最终筛选具有高的去除FNA能力的菌抹。HPLC分析在表2所示的条件下进行。HPLC分析显示称为HN-72的菌林具有高的分解FNA能力。表1:用于最终筛选的反应液<table><row><column>组成</column><column>体积(ml)</column><column>注释</column></row><row><column>50mMKH2P04-KOH(pH8.0)</column><column>37.5</column><column>-</column></row><row><column>cNDA溶液</column><column>4</column><column>*NDA溶液的浓度50mg/ml</column></row><row><column>DMSO</column><column>2.5</column><column>*反应液的最终浓度5%</column></row><row><column>微生物悬浮液</column><column>5</column><column>*微生物悬浮液的浓度0.5g(w.w)/ml</column></row><row><column>总计</column><column>50</column><column>-</column></row><table>表2:HPLC分析的条件<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例2(l)微生物的鉴别对实施例1中分离的菌抹的16SrDNA进行部分测序来鉴别菌抹。结果显示于图1。依据此结果，鉴定菌林属于假单胞菌属的细菌。菌株被称为假单胞菌(Pseudomonassp.)HN-72并于2005年6月16日寸呆藏在作为国际寸呆藏单4立的KoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology(KRIBB)基因库中，保藏编号为KCTC-10819BP。确定菌抹(假单胞菌HN-72)的形态学和生物化学特征，其结果概述于表3和4中。表3:假单胞菌(Pseudomonassp.)HN-72的特征实验特征革兰氏染色阴性细胞形态学杆状最佳生长温度25~30℃氧化酶阳性脱硝作用阴性明胶降解阴性淀粉降解阴性儿茶纷降解阴性表4:假单胞菌(Pseudomonassp.)HN-72对碳源的应用<table><row><column>碳水化合物</column><column>利用能力</column><column>碳水化合物</column><column>利用能力</column></row><row><column>葡萄糖</column><column>+</column><column>乳糖酶</column><column>+</column></row><row><column>果糖</column><column>+</column><column>柠檬酸酯</column><column>+</column></row><row><column>半乳糖</column><column>-</column><column>甘油</column><column>+</column></row><row><column>阿拉伯糖</column><column>-</column><column>邻苯二曱酸酯</column><column>-</column></row><row><column>鼠李糖</column><column>+</column><column>异丙醇</column><column>-</column></row><row><column>海藻糖</column><column>-</column><column>丁醇</column><column>+</column></row><row><column>麦芽糖</column><column>-</column><column>山梨醇</column><column>-</column></row><row><column>乳糖</column><column>-</column><column>甘露醇</column><column>-</column></row><row><column>蔗糖</column><column>-</column><column>核糖</column><column>-</column></row><row><column>淀粉</column><column>-</column><column>琥珀酸酯</column><column>+</column></row><table>(2)假单胞菌(Pseudomonassp.)HN-72与已知菌林的比较将假单胞菌(Pseudomonassp.)HN-72的反应效率与在已有专利申请(韩国专利申请No.10-2002-0087819)中记载的具有相同的去除FNA能力的芽孢杆菌(Bacillussp.)菌抹F-3的反应效率进行比较。当添加芽孢杆菌(Bacillussp.)菌抹F-3和假单胞菌(Pseudomonassp.)HN-72至具有表1中所示组成的反应液中时，在相同条件下各自的实验组进行反应。在图2中所示的条件下进行HPLC分析。将两个菌抹分别添加至含有浓度为1%和5%的cNDA的反应液中，在30'C下反应。分析所述反应液，结果见表5。由表5的结果，可以确认当与芽孢杆菌(Bacillussp.)菌抹F-3相比时，假单胞菌(Pseudomonassp.)HN-72也能与cNDA在较高的浓度下反应，并能够高度转化FNA为NDA，即显示出高的NDA产率和纯度。表5:由假单胞菌(Pseudomonassp.)HN-72和芽孢杆菌(Bacillussp.)F-3引起的cNDA反应液中NDA含量的变化<table>complextableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例3:反应温度的影响具有表6中所示组成的cNDA反应液在30、35、45和50°C下反应以确定cNDA反应液的最佳反应温度。此时，酶溶液通过如下方式制备在LB液体培养基上接种假单胞菌(Pseudomonassp.)HN-72,在30。C下振摇培养接种体16小时，并离心培养物以收集培养的细菌，用0.85%的生理盐水溶液洗涤收集的细菌，并且在0.85%的生理盐水溶液中悬浮洗涤后的细菌。调节反应液中细菌的最终浓度至0.05g/ml。由表7的结果明显看出，较高的反应温度对反应是有利的，40°C或更高的温度不会导致反应的任何实质的改变。表6<table><row><column>组成</column><column>含量</column><column>注释</column></row><row><column>50mMKH2P04-KOH(pH8.0)</column><column>42.5ml</column><column></column></row><row><column>cNDA溶液</column><column>2.5g</column><column>*反应液的最终浓度5%</column></row><row><column>DMSO</column><column>2.5ml</column><column>*反应液的最终浓度5%</column></row><row><column>微生物悬浮液</column><column>5ml</column><column>*微生物悬浮液的浓度0.5g(w.w)/ml</column></row><row><column>总计</column><column>50ml</column><column></column></row><table>表7:在不同反应温度下的cNDA反应液中NDA含量/FNA含量的变化<table><row><column></column><column>30°C</column><column>35°C</column><column>40°C</column><column>50°C</column></row><row><column>0</column><column>90.82%/5.66%</column><column>90.35%/6.08%</column><column>89.51%/6.05%</column><column>89.73%/5.95%</column></row><row><column>30分钟</column><column>93.16%/3.16%</column><column>94.72%/1.55%</column><column>95.09%/0.44%</column><column>95.01%/0.45%</column></row><row><column>1小时</column><column>94.63%/1.06%</column><column>95.39%/0.19%</column><column>95.55%/0.06%</column><column>95.49%/0.05%</column></row><table>实施例4:二甲基亚砜(DMSO)的影响由于作为基质的cNDA不溶于水溶液，将二曱基亚砜(DMSO)作为溶剂进行反应。为了评价DMSO对反应的影响，通过改变如表8所示的DMSO的浓度比较具有表6中所示组成的cNDA反应液中含量比(NDA含量/FNA含量)的改变。即，含有50mM磷酸钾(KH2P04)-KOH緩冲液(pH8.0)和浓度为0%、5%和10%的DMSO的5%的cNDA反应液在40°C下反应。结果示于表8。由表8所示的数据可见，不含DMSO的cNDA反应液显示最好的结果。表8:随着DMSO浓度的改变cNDA反应液中NDA含量/FNA含量的变化<table></column></row><row><column>0%</column><column>5%</column><column>10%</column></row><row><column>0</column><column>91.09%/2.54%</column><column>90.39%/2.86%</column><column>90.51%/2.75%</column></row><row><column>30分钟</column><column>92.68%/0.31%</column><column>92.16%/1.19%</column><column>91.09%/2.44%</column></row><row><column>1小时</column><column>93.23%/0%</column><column>92.76%/0.46%</column><column>91.55%/1.36%</column></row><table>实施例5:緩沖液的影响在此实验中，依据緩冲液的类型，评估每个具有类似的pH范围的不同的緩冲液的效果。此时，用緩冲液维持微生物细菌的体内稳态。此实验通过改变具有表6中所示组成的反应液中的緩沖液来进行。在本实验中使用磷酸钾(KH2P04)-KOH緩冲液、焦磷酸钠-HC1缓冲液,硼酸-NaOH缓冲液和硼酸钠-HCl缓冲液.将缓冲液的浓度和pH分别调节到50mM和8.0.实验结果见表9。结果显示当使用磷酸钾(KH2P04)-KOH緩沖液和硼酸-NaOH緩沖液时得到较好结果。与cNDA的反应降低了反应液的pH。特别地，在与反应液中cNDA反应完毕后反应液的pH值为7.0~8.0。因此判断pH为6.0-8.0的石辟酸钾(KH2P04)-KOH緩冲液的应用最适合。另外，通过从0到100mM改变磷酸钾-KOH緩冲液的浓度来评估磷酸钾(KH2P04)-KOH緩冲液对反应液的组成的影响。结果见表10。结果显示，尽管緩冲液的浓度发生变化，但没有观察到反应液组成的差别。表9:依据缓沖液的类型在cNDA反应液中NDA含量/FNA含量的变化<table></column><column>磷酸钾(KH2P04)-KOH緩冲液</column><column>硼酸-NaOH</column><column>焦磷酸钠-HCl</column><column>硼酸钠-HCl</column></row><row><column>0</column><column>91.09%/2.54%</column><column>90.79%/2.69%</column><column>90.81%/2.75%</column><column>90.99%/2.65%</column></row><row><column>15分钟</column><column>92.68%/0.31%</column><column>92.56%/0.39%</column><column>92.29%/0.67%</column><column>92.49%/0.44%</column></row><row><column>30分钟</column><column>93.23%/0%</column><column>93.16%/0.02%</column><column>93.04%/0.36%</column><column>93.05%/0.16%</column></row><table>表10:改变磷酸钾-KOH緩冲液的浓度时cNDA反应液中NDA含量/FNA含量的变化<table></column><column>0mM(D.W)</column><column>20mM</column><column>50mM</column><column>100mM</column></row><row><column>0</column><column>91.12%/2.47%</column><column>91.15%/2.62%</column><column>91.09%/2.54%</column><column>90.91%/2.65%</column></row><row><column>15分钟</column><column>92.65%/0.30%</column><column>92.65%/0.37%</column><column>92.68%/0.31%</column><column>92.59%/0.34%</column></row><row><column>30分钟</column><column>93.20%/0%</column><column>93.26%/0%</column><column>93.23%/0%</column><column>93.25%/0%</column></row><table>实施例6:反应液的起始pH由于随着pH的增加，cNDA的溶解度增加，反应液的pH在cNDA纯化反应中是重要的反应因素。在此实验中，具有表1所示组成的反应液的起始pH在7.0~9,0的范围内变化。结果，没有反应在不高于7.5和不低于8.3的pH下进行，这表示反应液的最佳pH范围为7.5~8.3。而且，发现用于cNDA纯化反应的最佳pH范围为7.8~8.1。在此pH范围内，反应后没有观察到cNDA反应液的组成的差别。实施例7:cNDA中FNA的含量、cNDA的浓度和细菌的量的影响在此实验中，进4亍具有1%~10%的不同FNA含量的cNDA的纯化反应。实验结果显示，在cNDA中FNA的含量、反应液中cNDA的浓度和完成去除FNA所需的细菌的量之间有密切的关系。即，当cNDA中FNA的含量和反应液中cNDA的浓度增加时，需要大量的细菌(假单胞菌(Pseudomonassp.)HN-72)来处理FNA。表11和12显示在不同cNDA中FNA的含量和不同cNDA的浓度下需要的细菌(假单胞菌(Pseudomonassp.)HN-72)的量。表11:cNDA中恒定FNA含量(4%)下改变cNDA浓度所需的细菌的量<table><row><column>cNDA浓度(％)</column><column>5</column><column>6</column><column>7</column><column>10</column></row><row><column>细菌的量(g/L)</column><column>40</column><column>50</column><column>50</column><column>87.5</column></row><table>表12:cNDA中恒定FNA含量(1%)下改变cNDA浓度所需的细菌的量<table><row><column>cNDA浓度(％)</column><column>5</column><column>6</column><column>7</column><column>8</column><column>9</column><column>10</column></row><row><column>细菌的量(g/L)</column><column>10</column><column>10</column><column>20</column><column>37.5</column><column>50</column><column>75</column></row><table>实施例8:收集的细菌(假单胞菌(Pseudomonassp.)HN-72)的储存通常，在培养后，微生物的活性随着时间流逝而降低。因此，尽可能长地保持细菌的活性对本发明的纯化方法是有利的。为了长时间保持培养的细菌(假单胞菌(Pseudomonassp.)HN-72)的活性，将实施例1所述条件下培养的细菌离心、收集、并储存在4'C的冷藏器中或冻干。结果，细菌的活性甚至在4'C的冷藏器中储存4天后还能保持。当冻干时，细菌可储存更长时间。工业应用由上述说明可明显看出，使用本发明-暇单胞菌(Pseudomonassp.)HN-72的纯化方法是经济的和环境友好的，能够产生高纯度的2,6-萘二甲酸。因此，本发明的假单胞菌(Pseudomonassp.)HN-72对用于工业应用非常重要。权利要求1.假单胞菌HN-72(保藏编号KCTC10819BP)，其能将2-甲酰基-6-萘甲酸转化为2，6-萘二甲酸。2.—种用假单胞菌HN-72(保藏编号KCTC10819BP)纯化2,6-萘二曱酸的方法。3.依据权利要求2的方法，其中所述方法包括步骤1)将假单胞菌HN-72(保藏编号KCTC10819BP)接种在液体培养基上，振摇培养接种体，收集培养的细菌，并用生理盐水洗涤收集的细菌以使细菌活化；2)将作为基质的粗萘二曱酸与緩冲液混合，调节混合液的pH以制备用于随后純化的反应液；和3)将在步骤l)中制备的活性细菌(假单胞菌HN-7"与在步骤2)中制备的反应液反应以将含在粗萘二曱酸中的2-曱酰基-6-萘曱酸转化成2,6-萘二甲酸，从而提高2，6-萘二甲酸的纯度。4.依据权利要求3的方法，其中所述液体培养基是LB或M9培养基。5.依据权利要求3的方法，其中振摇培养在25~37°C下进行。6.依据权利要求3的方法，其中将在振摇培养后收集的细菌(假单胞菌HN-72)储存在4。C的冷藏器中或冻干。7.依据权利要求3的方法，其中所述緩冲液从由水、磷酸钾(KH2P04)-KOH緩沖液、焦磷酸钠-HCl緩冲液、硼酸-NaOH緩沖液和硼酸钠-HCl緩冲液组成的组中选出。8.依据权利要求3的方法，其中所述緩沖液是磷酸钾-KOH緩冲液或硼酸-NaOH緩沖液。9.依据权利要求3的方法，其中所述緩冲液的浓度为0.01~100mM。10.依据权利要求3的方法，其中将所述混合液的pH调节到7.5-8.0。11.依据权利要求3的方法，其中所述混合液还含有有机溶剂。12.依据权利要求ll的方法，其中所述有机溶剂从由二曱基亚砜、N,N-二曱基曱酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、四氢呋喃(THF)、及其混合物组成的组中选出。13.依据权利要求11的方法，其中以0.01~10%的浓度添加所述有机溶剂。14.依据权利要求3的方法，其中在步骤3)中，所述反应在30~50°C下进行。全文摘要本发明涉及假单胞菌HN-72以及用其纯化2，6-萘二甲酸的方法。本发明提供了一种新颖的微生物和用所述微生物高纯度纯化2，6-萘二甲酸的方法。所述微生物是从土壤中分离的假单胞菌菌株HN-72，其能够将包含在粗萘二甲酸中的2，6-二甲基萘的氧化产物2-甲酰基-6-萘甲酸杂质转化为2，6-萘二甲酸。假单胞菌菌株HN-72在以高产率生产高纯度2，6-萘二甲酸方面具有极好效果。文档编号C12P7/44GK101346461SQ200680043965公开日2009年1月14日申请日期2006年1月16日优先权日2005年11月24日发明者崔龙福,李钟桓,金东诚,金成均,金苏颖申请人:株式会社晓星