芝麻抗旱与耐盐基因SiMYB75及其编码的蛋白与应用的制作方法

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及芝麻抗旱与耐盐基因simyb75及其编码的蛋白与应用。

背景技术：

在人类日常饮食中使用高质量的油是整体健康的重要组成部分。芝麻(sesamumindicuml.)是最古老的油料作物之一，广泛种植于热带和亚热带地区。芝麻油是一种富含重要矿物质和维生素的优质植物油，且富含植物甾醇、多不饱和脂肪酸、生育酚和木质素等独特种类物质，如芝麻素已经被鉴定为对人体健康有益的化合物。此外，在主要油料作物中，芝麻种子含油量最高(55％左右)，且还含有较高的蛋白质含量(约27％)。世界人口正在迅速增长，对植物油的需求量也在大量增加，高质量的植物油的供给是迫切需要的。植物油消耗预计到2040年将翻一番，因此，芝麻在满足这一需求方面可以发挥重要的作用。

芝麻与其他油籽相比，产量非常低，造成芝麻产量低的主要因素就是非生物逆境，这包括干旱、湿害以及盐碱等。芝麻在遭受非生物逆境胁迫后同时还会遭受病害的侵袭，这也是芝麻产量不高且不稳定的主要因素。由于芝麻主要种植在干旱和半干旱地区，容易遭受极端或间歇性的干旱胁迫，而我国黄淮和长江流域芝麻主产区，容易受到季节性干旱，同时我国西部、东北芝麻春播区和长江以南秋播区，常年遭受干旱威胁，对产量影响很大，同时对品质也有很大的影响。然而我国西部地区和沿海地区的芝麻生产则主要受到土壤盐碱化的影响，则耐盐育种是提高这些地区芝麻产量的决定性因素。因此，在非生物胁迫环境下获得高且稳的产量，需要对芝麻进行遗传改良，获得相关抗性的基因型，通过提高芝麻抵抗非生物逆境的能力，促进高产稳产，对促进我国芝麻产业发展、解决总量自给不足问题十分必要。芝麻非生物逆境的研究比较薄弱，分子相关研究较少。发掘芝麻非生物逆境抗性相关功能基因，是开展芝麻相关抗性分子育种，以提高芝麻抵御非生物逆境能力的重要基础和可靠途径。

因此，迫切需要发掘一种芝麻抗旱与耐盐基因，从而为开展芝麻抗旱与耐盐性分子育种，以作为提高芝麻抗旱与耐盐能力的重要基础和可靠途径之一。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了芝麻抗旱与耐盐基因simyb75及其编码的蛋白与应用，该基因simyb75可用来提高植物的抗旱与耐盐能力以便用于油料作物抗旱与耐盐品种的选育，由此来提高作物抗旱与耐盐性，保证作物高产稳产。

为实现上述目的，本发明是这样实现的：

在本发明的第一方面，提供了一种芝麻抗旱与耐盐基因simyb75，所述芝麻抗旱与耐盐基因simyb75为如seqidno:1所示的核苷酸序列；或者为seqidno:1所示的核苷酸序列经过添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而产生的具有抗旱性与耐盐性的核苷酸序列。

本发明的芝麻抗旱与耐盐基因simyb75是由申请人基于芝麻全基因组测序、进行大量生物信息学分析筛选获得的。申请人将其命名为芝麻抗旱与耐盐基因simyb75。

在本发明的第二方面，提供了所述的芝麻抗旱与耐盐基因simyb75所编码的芝麻simyb75蛋白，该蛋白为如seqidno：2所示的氨基酸序列；或者为与seqidno.2所示氨基酸序列具有至少90％同源性且具有抗旱性与耐盐性的氨基酸序列。

在本发明的第三方面，提供了所述的芝麻抗旱与耐盐基因simyb75的克隆方法，该方法包括：提取芝麻rna，将其反转录为cdna，以cdna为模板，以下述序列为引物，通过rt-pcr获得simyb75基因序列，引物序列为：simyb75-f：seqidno.3所示；simyb75-r：seqidno.4所示。

在本发明的第四方面，提供了所述的芝麻抗旱与耐盐基因simyb75的表达载体。

其中本发明具体提供一种表达载体，所述的表达载体通过pcambia1301s载体构建成pcambia1301s-simyb75载体。

在本发明的第五方面，提供了一种所述表达载体的转化体。

在一些实施例中，所述转化体为根癌农杆菌、和/或植物细胞(或生物体)；所述生物体为转基因抗旱植物，为水稻、玉米、小麦、大麦、烟草、大豆、高粱、棉花、麻类、花生、油菜、芝麻、甘蔗、或甜菜中之一，其中优选为芝麻。

在本发明的第六方面，提供了一种提高植物抗旱性与耐盐性的方法，所述的pcambia1301s-simyb75载体借助于基因工程手段介导植物遗传转化，获得的转基因植物。

在本发明的第七方面，提供了芝麻抗旱与耐盐基因simyb75在提高植物抗旱性与耐盐性中的应用。

在本发明的第八方面，提供了所述的表达载体在提高植物抗旱性与耐盐性中的应用。

在本发明的第九方面，提供了所述的转化体在提高植物抗旱性与耐盐性中的应用。

本发明将simyb75基因构建到表达pcambia1301s载体(pcambia1301s是在国际上常用的植物遗传转化载体pcambia1301基础上改建的，携带具有组成型和超量表达特征的花椰菜花叶病毒camv35s启动子的遗传转化载体)。通过农杆菌介导的转化方法，将pcambia1301s携带的simyb75基因转入拟南芥，获得拟南芥转化植株。实验结果表明，simyb75具有提高植物抗旱与耐盐能力的作用。

本发明具有的有益效果是：

本发明提供的芝麻抗旱与耐盐基因simyb75是国内外首次报道，过量表达芝麻抗旱与耐盐基因simyb75可提高植物抗旱及耐盐性的功能。通过抗旱及耐盐相关芝麻基因simyb75在拟南芥中的过量表达实验表明：转基因拟南芥中simyb75的表达与受体对照(非转基因植株)相比均有很大程度的提高，拟南芥植株抗旱及耐盐能力也因此得到提高。因此本发明提出可利用simyb75的过量表达来提高植物的抗旱及耐盐能力以便用于油料作物抗旱及耐盐品种的选育，由此来提高作物抗旱及耐盐性，保证作物高产稳产。

附图说明

图1为含simyb75基因的植物表达载体pcambia1301s-simyb75的构建；

图2为载体pcambia1301s-simyb75酶切图(m1：1kbdnaladder；m2：2000dnamarker；3-4：pcambia1301s-simyb75酶切片段)；

图3为转simyb75基因拟南芥t1代阳性植株的筛选结果示意图；

图4为转simyb75基因拟南芥t1代的pcr鉴定结果示意图(m：marker；1-9：转基因t1代植株)；

图5为转simyb75基因拟南芥t2代阳性植株的筛选结果示意图；

图6为转simyb75基因拟南芥t2代的pcr鉴定结果示意图(m：marker；1-12：转基因t2代植株)；

图7为转simyb75基因拟南芥t2代植株定量表达验证结果图；

图8为土壤干燥法测定转simyb75基因拟南芥t2代植物的抗旱性；

图9为nacl盐胁迫法测定转simyb75基因拟南芥t2代植物的耐盐性。

具体实施方式

实施例1芝麻抗旱与耐盐基因simyb75基因的获得

一、芝麻抗旱与耐盐基因simyb75的发现

1、选取一对芝麻抗旱材料zzm0635和干旱敏感材料zzm4728，盆栽种植于干旱棚中，于初花期(播种后47d)进行干旱胁迫处理。分别取d0(土壤含水量35％)、d1(土壤含水量15％)、d2(土壤含水量9％)、d3(土壤含水量6％)和d4(复水后土壤含水量35％)5个时间点2个材料的叶片用于抗旱转录组分析；

2、利用illuminahiseq4000测序平台，对30份样品进行转录组测序，每个样品平均产出6.86gb数据。将测序reads比对到芝麻参考基因组并重构转录本之后，最终一共检测出24218个新转录本，其中20236个属于已知蛋白编码基因的新的可变剪接亚型，1806个属于新的蛋白编码基因的转录本，剩下的2176个属于长链非编码rna；

3、通过差异表达基因分析，在抗旱材料中发现682个差异表达基因(degs)，这些基因包括与白细胞介素相关功能受体相关的激酶、细胞色素p450、hsp20家族蛋白、谷胱甘肽s转移酶以及超氧化物歧化酶等功能。通过对参与转录调控的基因进行分析，发现共有属于46个家族的2164个转录因子参与干旱应答，其中myb家族成员是最丰富和活跃的转录因子，其次是ap2-erebp、bhlh、wrky、c2h2、bzip、gras和nac等转录因子；

4、通过芝麻参考基因组(http://ocri-genomics.org/sinbase/index.html)比对和基因注释分析，以及定量表达验证(抗旱以及耐盐)，发现1个myb转录因子基因sin_1015311在干旱和盐胁迫逆境条件下都具有很高的表达量，该基因的拟南芥同源基因为atmyb79，是一种参与植物生长发育相关的转录因子基因，与植物逆境胁迫调节有关，因此，推测该基因可能与芝麻抗旱以及耐盐相关，命名为simyb75。

二、芝麻根系rna的提取和芝麻抗旱与耐盐基因simyb75的克隆

1、根系rna提取采用改进的ctab法，cdna的合成按照takara公司反转录合成试剂盒说明书步骤进行。根据simyb75基因的cds序列，利用primer5.0设计可以扩增其完整cds序列的引物，引物序列(包含修饰碱基)及名称如下：simyb75-f：5’-gctttcgcgagctcggtaccatgtcttggggagtaatggg-3’(如seqidno.3所示)

simyb75-r：5’-cgactctagaggatcctcaatagaaagttgcagcta-3’(如seqidno.4所示)；

2、取初花期抗旱种质zzm1805干旱胁迫5天后的叶片，提取根系总rna，逆转录生成cdna，以反转后的cdna为模板，利用步骤(5)中的引物simyb75-f/r进行rt-pcr扩增，将扩增得到的片段进行测序，获得提高芝麻抗旱及耐盐能力的simyb75基因序列，如seqidno.1所示。

实施例2simyb75基因表达载体的构建与遗传转化

一、过表达载体的构建

将实施例1克隆得到的抗旱及耐盐相关的芝麻基因simyb75利用同源重组的方法与pcambia1301s(本实验室提供)质粒连接构建植物表达载体，命名为pcambia1301s-simyb75(图1)，具体操作如下：

1、首先利用双酶切(bamhi和kpni)(takara)方法获得线性化载体，然后通过琼脂糖凝胶电泳和胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)纯化获得高纯度线性化载体。

2、将目的片段dna和线性化载体以3:1的摩尔比加到1.5ml的离心管中进行重组反应，混匀后在37℃放置约30min，加入10μl的反应液到50μl的dh5a感受态细胞中，用移液器轻轻混匀，于冰上孵育20min，42℃水浴中热激45秒后快速置冰上冷却2min。

3、加入300μllb液体培养基，37℃孵育45-60min。5,000rpm离心2min收集菌体，弃掉部分上清，用剩余的培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有kan抗性的lb固体培养基上轻轻涂匀，37℃培养箱中倒置培养16-24h。

4、挑取重组反应转化平板上若干个克隆进行菌落pcr鉴定，鉴定为阳性的菌落，挑取相应单菌落于含有kan抗生素的液体lb培养基中37℃、200rpm培养箱中培养过夜，提取质粒或将菌液直接测序以及通过酶切电泳(图2)鉴定载体准确性。

二、遗传转化

将步骤1)中制备的载体pcambia1301s-simyb75转入根癌农杆菌lba4404(上海唯地生物技术有限公司)，再导入拟南芥植株中，具体操作如下：

1、重组载体转入农杆菌lba4404：

(1)每100μllba4404农杆菌感受态细胞中加入2μg质粒dna，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min。

(2)加入700μl无抗生素的lb液体培养基，于28℃振荡培养5h。6000rpm离心1min收集菌体，留取100μl左右上清，轻轻吹打重悬菌体，将其均匀地涂布于含有kan和rif的lb固体培养基上，倒置放于28℃培养箱培养2天，挑取若干个阳性克隆利用菌落pcr简单验证结果。

2、拟南芥的平板培养：

(1)根据实验需要数出一定数量的拟南芥种子装于无菌的1.5ml离心管中。

(2)加入1ml75％乙醇，上下颠倒混匀，弃上清，重复1次。放入37℃200rpm摇床中摇10min表面灭菌。

(3)弃75％乙醇，加入1ml95％乙醇，上下颠倒混匀，弃上清，并重复1次。在超净工作台中，向各管种子加入300-500μl无水乙醇，用1ml移液器将种子和乙醇一同喷洒到无菌滤纸上。

(4)待乙醇挥发完，用牙签将拟南芥种子点种于准备好的平板上。

(5)将平板封口，黑暗条件下倒置于4℃春化48h，春化结束后，将平板置于光照培养箱中竖直培养，出苗一周后即可移栽。

(6)用镊子将幼苗栽入小盆的土中，先用保鲜膜保湿24h，置于植物生长间中培养直至拟南芥生长抽薹时(约一个月)，用于转化实验。

3、遗传转化：

(1)农杆菌活化：在20ml的lb液体培养基中分别加入20μlrif和kan，摇匀并接菌，28℃220rpm震荡活化8-10h。

(2)农杆菌扩大培养：在200ml的lb液体培养基中分别加入200μlrif和kan，再加入5-10ml的活化菌液，28℃220rpm震荡培养14-16h，至od值1.6-2.0，4500rpm离心10min，沉淀菌体弃上清，自然晾干。

(3)在沉淀菌体中加入100ml5％蔗糖溶液重悬菌体，移液器吹打均匀、重悬菌体。

(4)将离心瓶中菌液加到平皿中，再加入100ml5％蔗糖溶液，转化前加入40μlsilwet-l-77(0.02％)，晃动平皿混匀。

(5)将拟南芥花序合拢，浸入平皿，轻轻晃动15s。转化完后搅匀菌液。

(6)用黑袋子将植株套好，避光保湿24h。

(7)一周后再重复转化一次。

三、超表达植株的筛选与鉴定

1、筛选t1代阳性植株。

种植拟南芥t0代所收获的种子，将t0代种子消毒，接种含30mg/l潮霉素的ms筛选培养基(添加25mg/l头孢霉素抑菌)上22℃光照培养7-10天，筛选获得阳性植株(幼苗和根系都正常生长的植株)(图3)，本实验获得9个阳性株系，将阳性苗移栽到土壤中，用保鲜膜盖上2-3天后揭膜，然后正常生长。筛选出的阳性植株的叶片dna提取后，利用pcr方法鉴定simyb75基因，进行转基因植株的目的基因的分子验证(图4)，最终确认基因已经转入t1代阳性植株。

2、转基因植株t2代阳性检测

将t1代阳性植株进行单株收种获得t1代种子，继续进行潮霉素筛选获得t2代阳性植株(图5)，获得的阳性植株移栽生长，提取叶片基因组dna进行pcr分子鉴定(图6)，确定t2代阳性植株。

3、转基因植株t2代阳性植株定量表达验证

取转基因植株t2代阳性植株和野生型拟南芥植株生长时期的幼嫩叶片，用rna提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取叶片总rna，然后用反转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)获得cdna，以各自cdna为模板，以拟南芥β-actin为内参，进行qrt-pcr表达验证(qrt-pcrmix：南京诺唯赞生物科技有限公司；仪器：rochelightcyclerr480)。

其中拟南芥β-actin内参的qrt-pcr引物对为：

af：5’-cccgctatgtatgtcgcca-3’(如seqidno.5所示)；

ar：5’-aaccctcgtagattggcacag-3’(如seqidno.6所示)，

目标基因定量qrt-pcr引物对为：

mybf：5’-ggctgtcggacgaggatt-3’(如seqidno.7所示)；

mybr：5’-agacgggtggagaaaggg-3’(如seqidno.8所示)。

结果表明以未转基因的野生型拟南芥为对照，芝麻simyb75基因在检测的3个拟南芥转基因株系的叶片中表达量显著提高，而在未转基因对照拟南芥的叶片中，没有检测到芝麻simyb75基因的表达(图7)。表明芝麻的simyb75基因均转化并插入到了相应拟南芥基因组中并得到了表达。

实施3simyb75超量表达转基因t2代家系阳性植株抗旱、耐盐性能的测定

一、t2代阳性拟南芥植物抗旱性测定

待t2代转基因植物生长至3对叶时期，分别对拟南芥转基因植株和未转基因野生型拟南芥植株进行干旱胁迫处理17天。结果表明与野生型拟南芥对照相比，本研究所获得的转simyb75基因拟南芥株系抗旱能力明显高于野生型拟南芥对照(图8)，表明芝麻simyb75基因的过量表达可以提高植物的抗旱能力。

二、t2代阳性拟南芥植物耐盐性测定

待t2代转基因植物生长至3对叶时期，分别对拟南芥转基因植株和未转基因野生型拟南芥植株进行盐胁迫(每盆每2天浇1次30ml200mm盐水)处理7天。结果表明与野生型拟南芥对照相比，本研究所获得的转simyb75基因拟南芥株系耐盐能力明显高于野生型拟南芥对照(图9)，表明芝麻simyb75基因的过量表达可以提高植物的耐盐能力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中国农业科学院油料作物研究所

<120>芝麻抗旱与耐盐基因simyb75及其编码的蛋白与应用

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>762

<212>dna

<213>芝麻(sesamumindicum)

<400>1

atgtcttggggagtaatgggagagcacatgatgggaatgtggggggccatggaagacggg60

tggagaaaggggccttggactgctgaagaagacagactgctcattcagtatgtcgaattg120

catggtgaagggagatggaacaatgtggctaagcttgctgggctgaaaaggaatggcaaa180

agctgcagattgagatgggtaaattacttgaggccagacctcaagaggggccaaataact240

cctcatgaagagagaataattcttgaactgcatgccagatggggaaacagatggtcaaca300

attgcaagaagccttcccggaagaacagacaacgaaatcaagaactactggaggactcac360

ttcaagaaaaagacaaaatcctcgtccgacagccctgaaaagacacgggcccgactactc420

cggaggcaacagtttcatttgcaacaacagctgcaacagcagcagcagcagcagcagcaa480

caacaacaacaacatcagcaagatcaaatcatagacatgaccaggatcatgtcattgctc540

gacgacagtgagaacagatcagcgccgggttttgagtatccaagcggagcagacgagcac600

ggagtacttcttcattcgatgatgaacgagtacgcagctgtcgcggaggcctcaaacgag660

ggtattttgtgggacagtttgtggaacttggatgatctccatggaaattacatgacagaa720

agagctaattaccagcacaatttagctgcaactttctattga762

<210>2

<211>253

<212>prt

<213>芝麻(sesamumindicum)

<400>2

metsertrpglyvalmetglygluhismetmetglymettrpglyala

151015

metgluaspglytrparglysglyprotrpthralaglugluasparg

202530

leuleuileglntyrvalgluleuhisglygluglyargtrpasnasn

354045

valalalysleualaglyleulysargasnglylyssercysargleu

505560

argtrpvalasntyrleuargproaspleulysargglyglnilethr

65707580

prohisglugluargileileleugluleuhisalaargtrpglyasn

859095

argtrpserthrilealaargserleuproglyargthraspasnglu

100105110

ilelysasntyrtrpargthrhisphelyslyslysthrlysserser

115120125

seraspserproglulysthrargalaargleuleuargargglngln

130135140

phehisleuglnglnglnleuglnglnglnglnglnglnglnglngln

145150155160

glnglnglnglnhisglnglnaspglnileileaspmetthrargile

165170175

metserleuleuaspaspsergluasnargseralaproglypheglu

180185190

tyrproserglyalaaspgluhisglyvalleuleuhissermetmet

195200205

asnglutyralaalavalalaglualaserasngluglyileleutrp

210215220

aspserleutrpasnleuaspaspleuhisglyasntyrmetthrglu

225230235240

argalaasntyrglnhisasnleualaalathrphetyr

245250

<210>3

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gctttcgcgagctcggtaccatgtcttggggagtaatggg40

<210>4

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

cgactctagaggatcctcaatagaaagttgcagcta36

<210>5

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cccgctatgtatgtcgcca19

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

aaccctcgtagattggcacag21

<210>7

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

ggctgtcggacgaggatt18

<210>8

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

agacgggtggagaaaggg18