制备红景天苷的方法和试剂盒与流程

本发明涉及酶催化制备红景天苷的方法，更具体地，本发明涉及使用蔗糖磷酸化酶和纤维二糖磷酸化酶催化制备红景天苷的方法和试剂盒。

背景技术：

红景天苷是红景天的主要活性成分。野生红景天植物中红景天苷的含量约0.1％至1.0％。红景天属于珍贵的中药和藏药，具有抗疲劳、抗缺氧、抗辐射、提高人体机能等多种功效。

常规上，红景天苷可通过下述三种方法得到：红景天提取、化学合成和生物催化法。但是，红景天提取而言，首先，红景天属于高原植物，资源有限，且红景天中含红景天苷的含量低，仅为约0.1％至1.0％。其次，提取工艺复杂，提纯成本高。就化学合成而言，需要基团保护，并且需要高温高压、多种有机溶剂等条件。尤其，化学合成的产物不是单一的β-构型，需要进一步精制。就生物催化法而言，其具有反应温和、效率较高以及环境友好等优势，得到了更多的关注。

但是，目前所报道的生物催化法主要以葡萄糖和酪醇为底物，以葡萄糖苷酶，包括纯化酶、含葡萄糖苷酶的细胞破碎液，以及菌体细胞，或者糖基转移酶，包括纯化酶、含糖基转移酶的细胞破碎液，以及菌体细胞为生物催化剂，在一定的条件下进行生物催化合成红景天苷。魏胜华等报道了“β-葡萄糖苷酶纳米凝胶非水相合成红景天苷”(化工进展，2018，37(2)：694-701)，采用水相原位聚合的方法制备了杏仁β-葡萄糖苷酶纳米凝胶，并以其作为催化剂，以水-有机溶剂体系为反应介质，催化葡萄糖和酪醇合成红景天苷，收率达到23.7％。yuhl等(journalofbiotechnology，2008，133(4)：469-477)利用苹果籽粉作为生物催化剂合成红景天苷，在水-叔丁醇体积比为1:9的体系中反应120小时的收率可达到20.7％。hiroyukiakita等(journalofmolecularcatalysisb:enzymatic，2006，40(1-2):8-15)利用从杏仁中提取的β-葡萄糖苷酶催化合成红景天苷，收率为11％。tong等(bioorganicmedicinalchemistryletter，2004，14(9)：2095-2097)利用从苹果种子中提取的酶在二氧六环和水混合体系中催化合成红景天苷，收率为15.8％。zhang等(processbiochemistry，2005，40(9):3143-3147)利用从黑曲霉中提取的β-葡萄糖苷酶催化合成红景天苷，其产率大约为10％。王梦亮等(生物技术，2009，19(1)：68-70)利用海藻酸钠和壳聚糖固定β-葡萄糖苷酶，催化合成红景天苷，转化率可达到71.9％，产量7.8g/l。专利cn104774815公开了利用糖基转移酶制备红景天苷的方法，但产量为114mg/l。

上述所报道的生物催化法主要不足之处是催化剂制备工艺复杂，以及需要大量有机溶剂以达到微水相的条件。微水相溶解的底物浓度有限，因此产物浓度不高。另外，大多使用的是β-葡萄糖苷酶，它是一种水解酶，它们的水解作用往往大于合成作用，因此转化率不高，产量较低。因而需要探索工艺简单、成本低、收率高、适合于工业化生产红景天苷的生物催化法。

技术实现要素：

本发明克服了上述生物催化法的缺陷，提供了工艺简单、成本低、收率高的制备红景天苷的生物催化法。

在一个方面中，本发明提供了一种制备红景天苷的方法，其包括：

将蔗糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、蔗糖、酪醇和磷酸混合，得到反应混合物，然后，在40℃至55℃的温度下转化，而产生红景天苷。

本发明的制备红景天苷的方法使用廉价的蔗糖作为原料，大大降低了生产成本。与此同时，本发明使用蔗糖磷酸化酶和纤维二糖磷酸化酶联合催化的工艺流程节省了生产步骤，提高了生产效率。其中纤维二糖磷酸化酶催化产生的磷酸又可以作为反应物用于将蔗糖经蔗糖磷酸化酶催化产生葡萄糖-1-磷酸和果糖，进一步增加了生产效率。

优选地，所述蔗糖磷酸化酶为重组耐热蔗糖磷酸化酶，其dna序列和氨基酸序列分别为seqidno:1和seqidno:2所显示；并且所述纤维二糖磷酸化酶为重组耐热纤维二糖磷酸化酶，其dna序列和氨基酸序列分别为seqidno:3和seqidno:4所显示。

因为所使用的蔗糖磷酸化酶和纤维二糖磷酸化酶都为重组耐热酶，所以，在生产这些酶时不需要精细纯化，仅仅通过简单的加热即可除去反应体系中存在的大量杂蛋白，而不影响蔗糖磷酸化酶和纤维二糖磷酸化酶的活性。为此，大大降低了蔗糖磷酸化酶和纤维二糖磷酸化酶的生产成本，从原料方面降低了红景天苷的生产成本。

进一步，反应混合物中，重组耐热蔗糖磷酸化酶的酶活性浓度为250u/l至600u/l，并且重组耐热纤维二糖磷酸化酶的酶活性浓度为1200u/l至1600u/l。

当重组耐热蔗糖磷酸化酶和重组耐热纤维二糖磷酸化酶的酶活性浓度在上述范围内时，提高了反应效率，缩短了反应时间，优化了红景天苷的生产效率。

优选地，重组耐热蔗糖磷酸化酶的酶活性浓度为500u/l，并且重组耐热纤维二糖磷酸化酶的酶活性浓度为1500u/l。

进一步，反应混合物中，蔗糖的浓度为20g/l至150g/l，优选110g/l，反应混合物中，酪醇的浓度为20g/l至50g/l，优选42g/l，并且磷酸的浓度为20mmol/l至60mmol/l，优选50mmol/l。

当蔗糖、酪醇和磷酸的浓度在上述范围内时，优化了红景天苷的生产效率。使用上述浓度的蔗糖、酪醇和磷酸，结合上述重组耐热述蔗糖磷酸化酶和重组耐热纤维二糖磷酸化酶，使得产物红景天苷的产量最大化。

进一步，反应混合物进一步包括20mmol/l至100mmol/l，优选40mmol/l，ph值为6.0至9.0，优选7.0的柠檬酸缓冲液。

使用缓冲液，加速了反应进程，缩短了工艺时间。

进一步，转化温度为40℃至55℃，优选50℃。

在该范围内的温度下，大大缩短了将原料转化成产物红景天苷所需要的时间，转化时间仅为10小时至36小时，优选24小时。

在另一方面中，本发明提供了一种制备红景天苷的试剂盒，其包括蔗糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、蔗糖、酪醇和磷酸。

所述蔗糖磷酸化酶为重组耐热蔗糖磷酸化酶，其dna序列和氨基酸序列分别为seqidno:1和seqidno:2所显示，并且所述纤维二糖磷酸化酶为重组耐热纤维二糖磷酸化酶，其dna序列和氨基酸序列分别为seqidno:3和seqidno:4所显示。

通过本发明制备红景天苷的生物催化方法和试剂盒，实现了由廉价的蔗糖作为原料、在温和的条件下，以高收率合成红景天苷。

附图说明

下面将参考附图详细阐释本发明的具体实施方案，其中：

图1为显示根据本发明实施方式，合成红景天苷的示意性方法的流程图。

具体实施方式

本发明为了克服了现有技术中生物催化法的缺陷，提供了一种制备红景天苷的方法，其包括：将蔗糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、蔗糖、酪醇和磷酸混合，得到反应混合物，然后，在40℃至55℃的温度下转化，而产生红景天苷。

如图1中所示，在同一反应体系中，蔗糖磷酸化酶将蔗糖磷酸化，产生果糖和葡萄糖-1-磷酸，接着，葡萄糖-1-磷酸和酪醇被纤维二糖磷酸化酶催化产生红景天苷和磷酸。与此同时，在同一反应体系中，葡萄糖-1-磷酸和酪醇被纤维二糖磷酸化酶催化产生的磷酸可用于磷酸化酶将蔗糖磷酸化的原料。由此，大大降低了原料的成本。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明有更深入的了解。

实施例1、重组耐热蔗糖磷酸化酶和重组耐热纤维二糖磷酸化酶的制备

如无特殊说明，下述实施例中所用的方法均为常规方法，所用的试剂均可从商业途径获得。

a、蔗糖磷酸化酶大肠杆菌重组菌的构建

从嗜热解糖杆菌(thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum)提取基因组作为模板，进行pcr扩增，得到pcr产物。pcr条件为94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟，30个循环；72℃保温10分钟。

上游引物：cgcggatccatggctctgaaaaataaagtgcaactg，下划线为酶切位点bamhi。

下游引物：ccgctcgagcaccaggtatttcacttcttcgccgt，下划线为酶切位点xhoi。

然后将上述pcr产物和质粒pet-28a使用内切酶bamhi和xhoi进行双酶切并使用dna纯化试剂盒纯化，再用t4连接酶将pcr产物和质粒pet-28a连接，得到连接产物。将连接产物转入到大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)中，得到重组菌e.colibl21/pet-spase。

b、纤维二糖磷酸化酶大肠杆菌重组菌的构建

从嗜热纤维梭菌(clostridiumthermocellum)提取基因组作为模板，进行pcr扩增，得到pcr产物，得到pcr产物。pcr条件为94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2.5分钟，30个循环；72℃保温10分钟。

上游引物：cgcggatccatgaagttcggtttttttgatgatgc，下划线为酶切位点bamhi。

下游引物：ccgctcgagtcccataattacttcaactttgtgag，下划线为酶切位点xhoi。

然后将上述pcr产物和质粒pet-28a使用内切酶bamhi和xhoi进行双酶切并使用dna纯化试剂盒纯化，再用t4连接酶将pcr产物和质粒pet-28a连接，得到连接产物。将连接产物转入到大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)中，得到重组菌e.colibl21/pet-cpase。

c、蔗糖磷酸化酶的重组菌e.colibl21/pet-spase的诱导表达

将蔗糖磷酸化酶的重组菌e.colibl21/pet-spase接种于含5mg/l卡那霉素的lb培养基(lb培养基组成：胰蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，氯化钠5g/l，ph值7.0，)中，在37℃，转速200转/分钟的条件下，培养8小时。然后，以2％的接种量接种到自诱导培养基中。自诱导培养基为包括下述的去离子水溶液：酵母浸粉30g/l、蛋白胨20g/l、磷酸氢二钾2g/l、氯化钠4.0g/l、硫酸镁2.5g/l、乳糖4.0g/l、甘油5g/l，ph为7.0。在32℃，转速为200转/分钟的条件下，培养24小时，进行诱导表达，得到各自的培养物。将含重组耐热蔗糖磷酸化酶的菌体培养物在转速为4000转/分下，离心5分钟，获取菌体，用去离子水洗涤再离心，重复三次。离心所获得菌体，再用50mmol/l柠檬酸缓冲液(ph7.0)将菌体重新悬浮成菌悬液，然后经细胞超声破碎仪处理5分钟，再经6000转/分离心5分钟，弃除下层离心菌体碎片固形物，收集离心上清液。所得离心上清液即含有重组耐热蔗糖磷酸化酶的酶液，经商用蔗糖磷酸化酶试剂盒测定，该酶液酶活为5000u/l。

d、纤维二糖磷酸化酶的重组菌e.colibl21/pet-cpase的诱导表达

将纤维二糖磷酸化酶的重组菌e.colibl21/pet-cpase接种于含卡那霉素的lb培养基(同c中所述lb培养基)中，在37℃，转速200转/分钟的条件下，培养8小时。然后，以2％的接种量接种到自诱导培养基中。自诱导培养基为包括下述的去离子水溶液：酵母浸粉30g/l、蛋白胨20g/l、磷酸氢二钾2g/l、氯化钠4.0g/l、硫酸镁2.5g/l、乳糖4.0g/l、甘油5g/l，ph为7.0。在32℃，转速为200转/分钟的条件下，培养24小时，进行诱导表达，得到各自的培养物。将含重组耐热纤维二糖磷酸化酶的菌体培养物在转速为4000转/分下，离心5分钟，获取菌体，用去离子水洗涤再离心，重复三次。离心所获得菌体，再用50mmol/l柠檬酸缓冲液(ph7.0)将菌体重新悬浮成菌悬液，然后经细胞超声破碎仪处理5分钟，再经6000转/分离心5分钟，弃除下层离心菌体碎片固形物，收集离心上清液。所得离心上清液即含有重组耐热纤维二糖磷酸化酶的酶液，经商用纤维二糖磷酸化酶试剂盒测定，该酶液酶活为12000u/l。

实施例2、合成红景天苷

按蔗糖110g/l、酪醇42g/l和磷酸50mmol/l的浓度，将1.10g蔗糖、0.42g酪醇和57μl磷酸(浓度85％)依次加入到含有6ml柠檬酸缓冲液(50mmol/l，ph值7.0)的反应瓶(体积规格25ml)中，搅拌使反应原料溶解，然后按250u/l的浓度，加入0.5ml实施例1中所制备的重组耐热蔗糖磷酸酶酶液，再按1200u/l的浓度，加入1ml实施例1中所制备重组耐热纤维二糖磷酸酶酶液，最后将反应液体积用同一柠檬酸缓冲液定容至10ml，并将反应体液ph至调至7.0。然后置于恒温振荡器中进行生物反应制备红景天苷，反应条件为温度50℃、转速50转/分、反应时间24小时。反应完毕后，采用hplc法测得反应液中红景天苷的浓度。红景天苷hplc方法为：色谱柱：diamonsilc18，5um，150x4.6mm；流动相：甲醇:水＝35:65；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；检测波长：280nm。

下面使用与上述实施例2相同的方式制备红景天苷，完成实施例3-18，不同之处是使用与实施例2不同的蔗糖磷酸化酶的浓度、纤维二糖磷酸化酶的浓度、蔗糖的浓度、酪醇的浓度、磷酸的浓度、缓冲液的浓度、ph值、温度和转化时间。

实施例2-18中，各自使用的原料的浓度、转化条件，以及红景天苷的产量见下面表1。

表1

对比例1、合成红景天苷

下面使用与上述实施例2相同的方式制备红景天苷，完成对比例1和2，不同之处是使用与实施例2不同的蔗糖磷酸化酶的浓度、纤维二糖磷酸化酶的浓度、蔗糖的浓度、酪醇的浓度、磷酸的浓度、缓冲液的浓度、ph值、温度和转化时间。

对比例1和2中，各自使用的原料的浓度、转化条件，以及红景天苷的产量见下面表2。

表2

由表1可见，当使用的蔗糖磷酸化酶的浓度在250u/l至600u/l范围内，纤维二糖磷酸化酶的浓度在1200u/l至1600u/l范围内，蔗糖的浓度在20g/l至150g/l范围内，酪醇的浓度在20g/l至50g/l范围内，并且所述磷酸的浓度在20mmol/l至60mmol/l范围内，温度在40℃至55℃范围内，柠檬酸缓冲液在20mmol/l至100mmol/l范围内，ph值为6.0至9.0时，红景天苷的产量较高，转化所需的时间较短。

从表2可见，当使用的蔗糖磷酸化酶的浓度、纤维二糖磷酸化酶的浓度、蔗糖、酪醇、磷酸以及反应的ph、温度不在上述范围内时，反应产物红景天苷的产量较低。

使用本发明的蔗糖磷酸化酶和纤维二糖磷酸化酶合成红景天苷，其反应过程在全水相中实现，获得了较高的转化率。此外，全水相体系可溶解更多的底物，从而有效提高了产物浓度，即，产量。反应体系不使用有机溶剂，避免了对酶的抑制作用，并且两种酶都是耐热酶，通过加热可使杂蛋白失活，而不影响酶的活性。为此，大大简化了获取酶的工艺步骤，并且降低了生产成本。

序列表

<110>北京工商大学

清华大学

<120>制备红景天苷的方法和试剂盒

<130>df10-181147

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

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<213>嗜热解糖杆菌(thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum)

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<213>嗜热纤维梭菌(clostridiumthermocellum)

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