一种用于秸秆沼气发酵预处理的生物菌剂生产方法及应用与流程

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种用于秸秆沼气发酵预处理的生物菌剂生产方法及应用。

背景技术：

我国是农业生产大国，各类农作物秸秆资源丰富。据不完全统计，2016年各类农作物秸秆产量达到7.9亿吨，主要有稻秸、玉米秸、麦秸等。目前我国秸秆处理处置技术主要采用直接还田、就地焚烧或与畜禽粪便堆沤等。这些处置方法不仅导致资源浪费、微生态环境遭到破坏、地力损伤和土地肥力下降等问题，更严重影响环境质量危害人体健康。堆积秸秆不仅侵占土地、滋生蚊蝇经雨水浇湿后被冲入河流还会污染水体；露天焚烧产生的烟尘严重污染大气质量环境，并且会出现消防安全问题。农作物秸秆作为生物质能中重要的一部分，其中蕴含大量的化学能，若能将农作物秸秆有效利用不仅可以减少资源浪费和环境污染，还可以缓解中国能源危机，因此厌氧消化技术。

秸秆中纤维素、半纤维素、木质素为主要化学成分，还含有一定量蛋白质和脂肪等组分。纤维素是由d-葡萄糖以β-1,4糖苷键组成的线状高分子化合物，半纤维素是由各种糖单元相互连接形成具有支链的高分子聚合物，木质素是由苯基丙烷结构单元（c6-c3）通过醚键、碳-碳键连接而成的芳香族的高分子聚合物。利用厌氧发酵技术将秸秆转化为高产热值的沼气，是解决我国日益严峻的能源和环境问题的有效途径之一。纤维素主要依靠微生物进行降解，先由水解菌将其降解为多糖，然后再由产酸菌将其进一步降解成有机酸，最终在产甲烷菌的作用下生成甲烷。

秸秆作为沼气原料时，因秸秆容重小、流动性差、木质纤维含量高、含有难以降解的木质素和植物蜡质，存在分解慢、产气速率低、周期长、容积产气率低、发酵过程管理不便等问题。对此，应在秸秆入池发酵前对其进行物理的、化学的和生物的预处理，预处理环节将直接影响到沼气产量和产气率。通过预处理破坏秸秆的木质纤维结构，可以提高其厌氧生物转化率和产气效率，国内外已有大量研究，预处理方法包括碱处理、酸处理、爆破、离子液体、有机溶剂、湿式氧化和生物处理等。生物法预处理是通过具有生物质降解能力的好氧微生物菌群，将秸秆中的木质素分解，从而使秸秆更利于厌氧消化菌群的分解和利用。生物法预处理是通过具有生物质降解能力的好氧微生物菌群，将秸秆中的木质素分解，从而使秸秆中的纤维素更利于厌氧消化菌群的分解和利用，并被水解为葡萄糖等物质，进一步发酵成单细胞蛋白、有机酸等能源物质。虽然生物预处理反应温和、能耗较小，设备简单，不会带来环境污染，但预处理周期长，占地面积大，并且需要高效的生物菌剂。

技术实现要素：

本发明提出了一种用于秸秆沼气发酵预处理的生物菌剂生产方法及应用，解决了现有生物菌剂不高效、处理周期长的技术问题。

本发明的技术方案是这样实现的：一种用于秸秆沼气发酵预处理的生物菌剂生产方法，包括以下步骤：

s1、种子液的培养：将微生物菌悬液接种到种子培养基中，接种体积比为5%~20%，培养温度为28~35℃，1~3天后得到种子液，所述种子液的培养液od600nm为0.6~1.2；

s2、发酵培养：将s1得到的种子液按照体积比为5%~20%加入到发酵培养基中，发酵温度为28℃~35℃，24~30h后得到发酵液，所述发酵液的od600nm为0.6~0.8；

s3、固液分离：将s2得到的发酵液进行固液分离，分别得到固体和液体；

s4、固体干燥：将s3得到的固体在湿的状态下磨碎，然后再35~45℃的温热空气中干燥，得到干燥粉末；

s5、液体雾化干燥：将s3得到的液体进行雾化干燥，得到雾化粉末；

s6、混配：将s4得到的干燥粉末和s5得到的雾化粉末进行混配，得到用于秸秆沼气发酵预处理的生物菌剂。

作为进一步技术方案，s1中微生物菌悬液中微生物具体为黑曲霉菌（aspergillusniger）。

作为进一步技术方案，s1中种子培养基具体为kh2po41.0g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，nh4cl2.0g/l，羧甲基纤维素钠(cmc-na)5.0g/l，naoh调节ph值至7.0。

作为进一步技术方案，s2中发酵罐在使用前进行高温蒸汽灭菌处理，发酵过程需要搅拌并且通入无菌空气，控制溶解氧(do)为0.1~0.2。

作为进一步技术方案，s2中发酵培养基具体为蔗糖20g/l，微晶纤维素5g/l，玉米油2g/l，(nh4)2so423g/l，kh2po41g/l，mgso4•7h2o0.5g/l，kcl0.5g/l，柠檬酸缓冲液调节ph为5.4。

作为进一步技术方案，s5中雾化时采用通过水力旋流器，细小的颗粒从空气流中分离出来；液体部分喷雾到150-250°c热蒸汽上面，由于其很大的表面积，液体中很短时间内变成细粉末。

作为进一步技术方案，s6中干燥粉末和雾化粉末混配质量比为4:1~5:1，最得到的生物菌剂的滤纸酶活性为40~60u/g。

一种生物菌剂应用方法，包括以下步骤：

f1、发酵料液制备：将玉米秸秆粉碎至0.3mm以下，加水，使总固体量(ts)为6~12%，玉米秸秆有机干物质占总固体量(vs)不小于75%，得到发酵料液；

f2、生物水解预处理：将f1中得到的发酵料液和接种物加入到水解反应器中，接种物的体积占比为40~60%，再将权利要求1~8任意一项所制备的生物菌剂加入其中，生物菌剂投加量为5~15mg/gts，进行曝气，搅拌，得到水解料液；

f3、厌氧消化：将接种物和f2得到的水解料液加入至消化罐中，接种物的体积占比为30~50%,；

作为进一步技术方案，f2中接种物为消化的禽畜粪便、消化污泥、消化沼液、食草动物瘤胃胃液、曝气控制do为0.1~0.2mg/l，水解温度为28~35℃，ph为5.2~6.6，3天后每日连续进出料或每天进料1次，进料量0.25~0.75l/l·d；水解料液挥发性脂肪酸含量为1~3g/l，乙酸含量0.4~1g/l。

作为进一步技术方案，f3中接种物为消化的禽畜粪污或厌氧消化的沼液，厌氧罐每天补入f2制备的水解料液，且每日进料量为50~100ml/l，温度为35-38℃，均匀搅拌。

与现有技术相比，本发明工作原理和有益效果为：

本发明提供的生物菌剂生产方法发酵步骤少，工艺改进容易，并且制备的生物菌剂更加高效，含有纤维素酶与微生物的菌剂能有效提高水解效率，将秸秆水解为葡萄糖，并进一步生成挥发性脂肪酸。本发明最终得到的生物菌剂的滤纸酶活性为40~80u/g，提供的生物菌剂用于物料浓度为6~12%的玉米秸秆，停留时间短只需要2天，在生物预处理方法中生物菌剂只需要一次投加，便能够实现将秸秆的处理，应用方法简便易控制，经预处理后秸秆可以实现原料ts产气率为400ml/g，为秸秆沼气发酵的预处理过程，提供了一种有效的生物菌剂生产与应用方法。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为本发明工艺流程示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

一种用于秸秆沼气发酵预处理的生物菌剂生产方法，包括以下步骤：

s1、种子液的培养：将黑曲霉菌（aspergillusniger）悬液接种到200ml种子培养基中，接种量为10ml，在恒温相中培养1天，培养温度为28℃，得到种子液，种子液的培养液od600nm为0.687；

种子培养基具体为kh2po41.0g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，nh4cl2.0g/l，羧甲基纤维素钠(cmc-na)5.0g/l，naoh调节ph值至7.0；

s2、发酵培养：将s1得到的种子液取50ml，接种到效容积1l的发酵罐中，发酵罐在使用前进行高温蒸汽灭菌2h，28℃恒温水浴培养24h，通入无菌空气，控制溶解氧(do)为0.1，制备得到的发酵液的od600nm为0.685；

发酵培养基具体为蔗糖20g/l，微晶纤维素5g/l，玉米油2g/l，(nh4)2so423g/l，kh2po41g/l，mgso4•7h2o0.5g/l，kcl0.5g/l，柠檬酸缓冲液调节ph为5.4。

s3、固液分离：将s2得到的发酵液通过离心机在4000rad/min进行固液分离固液分离，分别得到固体和液体；

固体部分主要包含菌丝、纤维素酶和其他底物，含有较高的酶活性，液体部分含有纤维素酶、培养基、水解产物。

s4、固体干燥：将s3得到的固体在湿的状态下磨碎，然后再35~45℃的温热空气中干燥，得到干燥粉末；

s5、液体雾化干燥：将s3得到的液体喷雾干燥器，进风口温度为150℃，得到雾化粉末；

雾化时细小的颗粒从空气流中分离出来；液体部分喷雾到热蒸汽上面，由于其很大的表面积，液体中很短时间内变成细粉末。

s6、混配：将s4得到的干燥粉末和s5得到的雾化粉末进行混配，干燥粉末和雾化粉末混配质量比为5:1，得到用于秸秆沼气发酵预处理的生物菌剂，通过dns分光光度法检测生物菌剂的葡萄糖含量为0.45g/g，通过dns分光光度法检测滤纸酶活性为54.84u/g。

一种生物菌剂应用方法，包括以下步骤：

f1、发酵料液制备：将玉米秸秆粉碎至为丝状小段，加水调配，使总固体量(ts)为6%，玉米秸秆有机干物质占总固体量(vs)为84.2%，得到发酵料液；

f2、生物水解预处理：将f1中得到的发酵料液和接种物加入到5000ml的水解反应器中，带有搅拌，保温夹层和曝气装置，发酵料液为3000ml，接种物为2000ml的牛瘤胃胃液，再将生物菌剂4.5g加入其中，进行曝气，搅拌，曝气控制do为0.1mg/l，水解温度为28℃，ph为5.2，3天后每日先从水解装置中用泵一直进出料或者每天分一次或者多次进料，每天进料量为总液量的25%。水解料液挥发性脂肪酸含量为2.2/l，乙酸含量0.9g/l。

f3、厌氧消化：有效容积5000ml的消化罐中加入2500ml牛粪发酵沼液与2500ml经步骤f2处理的料液，之后每天一次排出250ml消化液，补充250ml经步骤f2预处理料液。连续运行60天，21天后ts产气率都达到400ml/g以上。

实施例二：

一种用于秸秆沼气发酵预处理的生物菌剂生产方法，包括以下步骤：

s1、种子液的培养：将黑曲霉菌悬液接种到200ml种子培养基中，接种量为40ml，在恒温相中培养3天，培养温度为35℃，得到种子液，种子液的培养液od600nm为1.115；

种子培养基具体为kh2po41.0g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，nh4cl2.0g/l，羧甲基纤维素钠(cmc-na)5.0g/l，naoh调节ph值至7.0；

s2、发酵培养：将s1得到的种子液取200ml，接种到效容积1l的发酵罐中，发酵罐在使用前进行高温蒸汽灭菌2h，35℃恒温水浴培养30h，通入无菌空气，控制溶解氧(do)为0.3，制备得到的发酵液的od600nm为0.756；

发酵培养基具体为蔗糖20g/l，微晶纤维素5g/l，玉米油2g/l，(nh4)2so423g/l，kh2po41g/l，mgso4•7h2o0.5g/l，kcl0.5g/l，柠檬酸缓冲液调节ph为5.4。

s3、固液分离：将s2得到的发酵液通过离心机在4000rad/min进行固液分离固液分离，分别得到固体和液体；

固体部分主要包含菌丝、纤维素酶和其他底物，含有较高的酶活性，液体部分含有纤维素酶、培养基、水解产物。

s4、固体干燥：将s3得到的固体在湿的状态下磨碎，然后再35~45℃的温热空气中干燥，得到干燥粉末；

s5、液体雾化干燥：将s3得到的液体喷雾干燥器，进风口温度为250℃，得到雾化粉末；

雾化时细小的颗粒从空气流中分离出来；液体部分喷雾到热蒸汽上面，由于其很大的表面积，液体中很短时间内变成细粉末。

s6、混配：将s4得到的干燥粉末和s5得到的雾化粉末进行混配，干燥粉末和雾化粉末混配质量比为4:1，得到用于秸秆沼气发酵预处理的生物菌剂，通过dns分光光度法检测生物菌剂的葡萄糖含量为0.49g/g，最终得到的生物菌剂的滤纸酶活性为59.6u/g。

一种生物菌剂应用方法，包括以下步骤：

f1、发酵料液制备：将玉米秸秆粉碎至为丝状小段，加水调配，使总固体量(ts)为12%，玉米秸秆有机干物质占总固体量(vs)为91.3%，得到发酵料液；

f2、生物水解预处理：将f1中得到的发酵料液和接种物加入到5000ml的水解反应器中，带有搅拌，保温夹层和曝气装置，发酵料液为3000ml，接种物为3000ml的牛瘤胃胃液，再将生物菌剂13.5g加入其中，进行曝气，搅拌，曝气控制do为0.2mg/l，水解温度为35℃，ph为6.6，3天后每日先从水解装置中用泵一直进出料或者每天分一次或者多次进料，每天进料量为总液量的75%。水解料液挥发性脂肪酸含量为2.8g/l，乙酸含量1.0g/l。

f3、厌氧消化：有效容积5000ml的消化罐中加入1500ml牛粪发酵沼液与3500ml经步骤f2处理的料液，之后每天一次排出250ml消化液，补充250ml经步骤f2预处理料液。连续运行60天，21天后ts产气率都达到400ml/g。

对比例1

(1)利用粉碎机将玉米秸秆粉碎为丝状小段，加水调配ts为10%作为料液备用，vs含量为84.8%。

(2)有效容积5000ml的水解反应装置，带有搅拌，保温夹层和曝气装置。在上述反应装置中加入2500ml猪粪发酵沼液、2500ml料液，启动阶段3天内不添加料液，水解温度38℃，持续曝气控制do为0.2。3天后每日先从水解装置中排出料液2500ml用于厌氧消化，再加入料液2500ml。排出料液经检测挥发酸总量为0.6g/l，乙酸含量0.2g/l。(3)5000ml的消化罐中加入2500ml牛粪发酵沼液和经步骤(2)预处理的料液记录累计产气量。之后每天排出200ml消化液，并补充200ml步骤(2)未经预处理料液。记录40天产气量，ts产气率均低于280ml/g。

对比例2

(1)利用粉碎机将玉米秸秆粉碎为丝状小段，加水调配ts为10%作为料液备用，vs含量为84.8%。

(2)有效容积5000ml的水解反应装置，带有搅拌，保温夹层和曝气装置。在上述反应装置中加入2500ml牛瘤胃胃液、2500ml料液、市场购买的纤维素酶制剂4.5g，启动阶段3天内不添加料液，温度38℃，持续曝气控制do为0.2。3天后每日先从水解装置中排出料液2000ml用于厌氧消化，再加入料液2000ml。排出料液经检测挥发酸总量为0.5~2.5g/l。排出料液经检测挥发酸总量为为0.4g/l，乙酸含量0g/l。

(3)5000ml的消化罐中加入2500ml牛粪发酵沼液和经步骤(2)处理的料液记录累计产气量。之后每天进料4次，每次排出500ml消化液，并补充2500ml经步骤(2)预处理料液。记录40天产气量，4天后ts产气率均低于280ml/g。

通过上述实施例和对比例可以看出，利用发明制备的生物菌剂及预处理方法，水解后料液有较高的挥发性脂肪酸浓度，厌氧消化ts产气率高于400ml/g，制备的菌剂有很高的酶活性，最终得到的生物菌剂的滤纸酶活性为40~60u/g，只需一次投加连续运行稳定性良好。因此通过该方法生产的纤维素菌剂并用于秸秆预处理与沼气发酵，分解效率更高，步骤简单，反应调节温和，设备简单能耗低，不会带来环境污染的同时，处理周期短，占地面积小并且更加高效，所产纤维素菌剂用于其他类秸秆也有相同或相近水解效果，经本发明方法预处理秸秆通过其他厌氧发酵工艺也有相同或相近产气效率。在这里不再一一赘述。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。