FH测序文库的构建方法和引物组及试剂盒与流程

本发明属于基因测序领域，具体涉及一种fh测序文库的构建方法和引物组及试剂盒。

背景技术：

家族性高胆固醇血症(familialhypercholesterolemia,fh)，是一种代谢异常的遗传性疾病，临床表现为血清中低密度脂蛋白胆固醇(lowdensitylipoproteincholesterol,ldl-c)水平明显升高，成人fh患者的ldl-c水平可达190mg/dl～400mg/dl，甚至更高。高水平的ldl-c是动脉粥样硬化性心血管疾病(atheroscleroticcardiovasculardisease,ascvd)，如冠心病、心梗、缺血性脑卒中等发生和发展的核心决定因素。在引起ldl-c升高的几大因素中，不健康的饮食习惯及生活方式是两个重要因素，但同时遗传因素也起到了关键性作用。研究发现，fh患者的肝脏无法正常代谢过量的低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein,ldl)，恰恰是由与ldl代谢相关的基因发生致病性突变导致。目前在我国国内，fh在民众当中却普遍存在：“是普通慢性病”、“对健康影响不大”、“由饮食习惯决定而与遗传因素无关”等错误观念，对fh的临床基因检测并未引起相应的重视。加之国内fh的研究起步较晚，临床上没有适用于中国人群的统一诊断标准和优良的fh基因突变检测产品。据估计，中国人群家族性高胆固醇血症的检出率远低于实际发病率，而家族性高胆固醇血症，特别是杂合性的家族性高胆固醇血症，是一项能早发现、并能得到有效治疗的严重危害心血管健康的代谢异常遗传病。

常见的fh基因的突变有两种：包括杂合突变(heterozygotefamilialhypercholesterolemia,hefh)和纯合突变(homozygotefamilialhypercholesterolemia,hofh)。hefh在全世界范围内的发病率高达1/220，是世界上广泛存在的遗传性代谢疾病之一，若不采取任何防范及治疗措施，随着年龄的增加，hefh人群早发冠心病风险要明显高于正常人。而hofh的患者，绝大部分从出生起就存在ldl-c的代谢异常，ascvd发病时间远远早于正常人，且通常在20～30岁左右由于病情严重而死亡。

fh作为一种复杂遗传病，存在多基因致病的特点，目前已有研究明确，ldlr(ldlreceptorprotein)、apob(apolipoproteinb)、pcsk9(proproteinconvertasesubtilisin/kexin-type9)以及ldlrap1(lowdensitylipoproteinreceptoradaptorprotein1)四个基因的致病性突变是fh临床诊断的金标准。除此之外，cetp((cholesterolestertransferprotein)、lipa(lipasea)、lpl(lipoprteinlipase)、stap1(signal-transducingadaptorprotein1)等关键性基因突变也被证明与fh发病相关。而apoe(apolipoproteine)与slco1b1(solutecarrierorganicaniontransporterfamilymember1b1)基因的检测意义，则在于当检出这2种基因的特定位点突变后，可用于指导他汀类药物用药。具体而言，

1)ldlr基因，定位于19号常染色体p13.2区域，基因全长44469bp，共有18个外显子17个内含子，编码区域有5292bp。ldlreceptor是一种存在于细胞膜/细胞器膜表面的跨膜蛋白，肝脏中含量较高，它结合ldl并将ldl最终运输到溶酶体进行分解，是清除体内过量ldl的主力。ldlr基因突变属于常染色体显性遗传，欧美人群中80％～90％的fh均由ldlr基因突变引起；

2)apob基因，编码载脂蛋白b，主要用于转运血液中的低密度脂蛋白。该基因存在于2号常染色体p24.1区域，dna全长42645bp，29个外显子编码4563个氨基酸残基。大约5％～10％的fh病患是由该基因发生突变导致；

3)pcsk9基因，位于1号染色体的p32.3区域，共有13个外显子，在胆固醇和脂肪酸代谢过程中发挥重要作用，大约1％～3％的fh病患是由该基因发生突变导致；

4)ldlrap1基因，位于常染色体1p36.11区域，包含16个外显子，编码一种胞内蛋白，该蛋白具有磷酸酪氨酸结合区域(phosphotyrosinebindingdomain,ptd)，该区域与ldlr蛋白胞质区域的尾部相互作用，影响ldl的转运过程。该基因突变属于常染色体显性遗传，不到1％的fh病患是由该基因发生突变导致；

5)slco1b1基因，位于12号染色体p12.1区域，编码多存在于肝脏的有机阴离子转运多肽oatp1b1，是一种跨膜转运蛋白，这种蛋白可介导肝细胞膜转运内、外源性物质并对其进行代谢和消除的生理功能，当slco1b1基因发生突变时，其转运功能下降，会导致血液中的他汀类药物浓度上升，增加了降血脂药物的不良反应；

6)apoe基因，位于常染色体19q13.32区域，编码一种重要的乳糜微粒载脂蛋白，能特异性地结合肝脏及外围细胞的ldl及apoe受体，对高甘油三酯脂蛋白的分解起到关键作用。apoe基因的多态性影响脂质的吸收、转化与清除的过程，即会导致体内总胆固醇(tctotalcholesterol，tc)、ldl-c水平产生差异，对他汀类药物的疗效产生影响。

目前，临床对于fh基因突变的检测主要采用wes探针捕获建库测序法、荧光定量pcr法和单重聚合酶链式反应(pcr)技术结合sanger测序法3种方法。由于没有针对fh特定区域进行检测的试剂盒，基于ngs(nextgenerationsequencing)技术平台，常用wes(whole-exomesequencing)探针捕获建库测序技术，检测人外显子组区域是否存在致病突变；该技术利用核酸探针特异性地捕获人外显子区域的dna序列，经文库构建、高通量测序，能发现与蛋白质功能变异相关的遗传突变；该技术对外显子的覆盖程度高，但测序深度仅为50×～200×，且探针捕获建库耗时长，建库、测序费用高，不适合专用于检测fh相关基因。荧光定量pcr法即针对待测序列区域设计一对引物及一条探针，反应过程中根据不同基因型释放不同的荧光信号，对基因突变进行定性分析；荧光定量pcr法具有高灵敏度的特点，实验操作简便快捷，临床使用多年，具备坚实的技术基础，但受限于通量低，试剂成本昂贵，不适用于复杂疾病的多基因检测。而pcr技术结合sanger测序法，则是利用一对特异的扩增引物，经pcr反应获得扩增产物后，通过sanger测序法获取该区域的位点突变情况。sanger测序法是基因测序的金标准，但是sanger测序法的缺陷在于：1)只能检测已知突变区域；2)对于连续碱基缺失、插入等突变类型的检测准确性不高；3)样本消耗多，一个pcr反应需要提供一份样本，且最多只能对不超过1kb的基因序列进行测序；4)检测成本高，复杂疾病的多基因、多位点检测，通常需要针对分布在基因组中不同区域的位点设计引物、分别测序，耗费大量人力物力。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种fh测序文库的构建方法和引物组及试剂盒，旨在解决现有fh相关基因突变的检测成本高、检测通量低、难以适用于fh这类复杂疾病的多基因检测的技术问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明一方面提供一种fh测序文库的构建方法，包括如下步骤：

获得dna样本；

利用第一引物集和第二引物集分别对dna样本进行多重pcr扩增，得到第一扩增产物和第二扩增产物；

将所述第一扩增产物和所述第二扩增产物混合，得到混合产物；

利用测序接头引物对所述混合产物进行扩增，得到测序文库；

其中，所述第一引物集的序列如seqidno.1-130所示；所述第二引物集的序列如seqidno.131-260所示。

表1

表2

本发明提供的fh测序文库的构建方法，采用针对fh相关的基因(ldlr、apob、pcsk9、ldlrap1、apoe、cetp、lipa、lpl和stap1)设计的两个引物集(见表1和表2)的多重pcr引物进行扩增，根据扩增区域重叠的特征，引物集中，重叠目标区域的扩增引物不在同一个引物集中，在不采用探针捕获技术的条件下，利用多重pcr扩增实现待测区域的高度覆盖，即能对包括复杂结构区域在内的基因外显子及邻近内含子95％以上的区域进行检测；相较探针捕获建库的探针合成，本发明提供的fh测序文库的构建方法所用引物的合成难度明显降低，引物合成成本亦降低许多，更能满足临床应用的对成本和便捷性的需求。相较常规建库流程，本发明操作简便，pcr到文库构建完成全流程只需要4小时左右；而且引物之间的扩增效率无严重偏好，能够对待测区域进行较为均匀的扩增，最终各扩增区域获得的有效数据量相对均一，具有十分突出的扩增子均一性；综上所述，该fh测序文库的构建方法，具有高覆盖度和均一性，能明显减少样本消耗，大量节省检测成本，并为临床发现新发基因突变提供技术基础。

本发明另一方面提供一种用于构建fh测序文库的引物组，所述引物组包括：第一引物集、第二引物集；其中，所述第一引物集的序列如seqidno.1-130所示，所述第二引物集的序列如seqidno.131-260所示。

以及，一种用于构建fh测序文库的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的上述引物组。

本发明提供的用于建库fh测序文库的引物组和试剂盒中，含有本发明特有的针对fh相关的基因设计的两个引物集的多重pcr引物，根据扩增区域重叠的特征，该两个引物集中相邻目标区域的扩增引物不在同一个引物集中，在不采用探针捕获技术的条件下，利用多重pcr扩增实现待测区域的高度覆盖，该引物组和试剂盒用于构建fh测序文库，具有高检测覆盖度和高均一性、样本消耗量少、样本要求低和大量节省检测成本的优点，并能为临床发现新发基因突变提供技术基础。

附图说明

图1为本发明实施例1的高通量测序文库构建流程示意图；

图2为本发明实施例1的高通量测序文库质控结果图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述发明目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”、“第三”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

一方面，本发明实施例提供了一种fh测序文库的构建方法，包括如下步骤：

s01：获得dna样本；

s02：利用第一引物集和第二引物集分别对dna样本进行多重pcr扩增，得到第一扩增产物和第二扩增产物；

s03：将所述第一扩增产物和所述第二扩增产物混合，得到混合产物；

s04：利用测序接头引物对所述混合产物进行扩增，得到测序文库；

其中，所述第一引物集的序列如seqidno.1-130所示；所述第二引物集的序列如seqidno.131-260所示。

本发明实施例提供的fh测序文库的构建方法，采用针对fh相关的基因设计的两个引物集的多重pcr引物进行扩增，根据扩增区域重叠的特征，该两个引物集中，重叠目标区域的扩增引物不在同一个引物集中，在不采用探针捕获技术的条件下，利用多重pcr扩增实现待测区域的高度覆盖，即能对包括复杂结构区域在内的基因外显子及邻近内含子95％以上的区域进行检测；相较探针捕获建库的探针合成，本发明实施例提供的fh测序文库的构建方法所用引物的合成难度明显降低，引物合成成本亦降低许多，更能满足临床应用的对成本和便捷性的需求。相较常规建库流程，本发明实施例操作简便，pcr到文库构建完成全流程只需要4小时左右；而且引物之间的扩增效率无严重偏好，能够对待测区域进行较为均匀的扩增，最终各扩增区域获得的有效数据量相对均一，具有十分突出的扩增子均一性；综上所述，该fh测序文库的构建方法，具有高覆盖度和均一性，能明显减少样本消耗，大量节省检测成本，并为临床发现新发基因突变提供技术基础。

进一步地，在上述步骤s01中，dna样本可以来自人的血液、唾液和组织等，本发明实施例中优选来自外周血dna。

进一步地，在上述步骤s02中，第一引物集的序列如表1中的seqidno.1-130所示；第二引物集的序列如表2中的seqidno.131-260所示。

fh作为一种复杂遗传病，存在多基因致病的特点，本发明实施例设计fh测序文库的构建方法，用于针对以下10个基因进行高通量测序检测：ldlr、apob、pcsk9、ldlrap1、apoe、cetp、lipa、lpl，stap1基因的特定外显子及邻近内含子区域，以及slco1b1基因的多态性位点(rs2306283、rs4149056、rs4363657)。

本发明实施例设计的针对上述10个基因的多重pcr引物，根据扩增区域重叠的特征，在不采用探针捕获技术的条件下，利用多重pcr方法实现待测区域的高度覆盖，同时由于重叠的特性，相邻区域的扩增引物不能放置在同一个引物集中，故将全部引物分为2个引物集混合。具体地，针对ldlr基因，设计引物seqidno.85-124以及seqidno.213-252；针对apob基因，设计引物seqidno.23-58以及seqidno.153-188；针对pcsk9基因，设计引物seqidno.9-22以及seqidno.137-152；针对ldlrap1基因，设计引物seqidno.1-8以及seqidno.131-136；针对apoe基因，设计引物seqidno.125-130以及seqidno.253-260；针对cetp基因，设计引物seqidno.83-84；针对lipa基因，设计引物seqidno.73-80以及seqidno.203-208；针对lpl基因，设计引物seqidno.61-72以及seqidno.189-202；针对stap1基因的外显子及邻近内含子区域，设计引物seqidno.59-60；针对slco1b1基因的多态性位点(rs2306283、rs4149056、rs4363657)，设计引物seqidno.81-82以及seqidno.209-212；其中，引物seqidno.1-130和引物seqidno.131-260中扩增子由于扩增区域相邻，分开放在两个不同引物集中。

进一步地，在上述步骤s03中：在得到所述混合产物之后，还包括将所述混合产物进行第一磁珠纯化处理。具体地，使用第一引物集和第二引物集分别对dna样本的目标区域进行多重pcr扩增，获得目标区域扩增产物。即：第一扩增产物和第二扩增产物，将同一个样本的第一扩增产物和第二扩增产物混合，再用磁珠纯化，去除酶及引物二聚体。

进一步地，在上述步骤s03中：在得到所述混合产物之后，还包括将所述混合产物进行非目标区域底物消化处理。具体地，所述非目标区域底物消化处理包括：将消化试剂和消化缓冲液加入所述混合产物中，进行孵育处理。此步骤用于消除由于多重pcr反应带来的具有特殊结构的非特异产物，通过对非特异产物的处理，有效减少了多重pcr过程中常见且难以避免的非特异产物，提高引物对了目标区域的扩增效率，也减少了非特异序列对下游测序数据量的消耗。优选地，消化试剂为消化酶；孵育处理的温度为36-38℃；孵育处理的时间为8-12min，孵育结束后加入反应终止液终止消化反应。更进一步地，所述非目标区域底物消化处理的步骤之后，还包括第二磁珠纯化处理。

进一步地，在上述步骤s04中：在利用接头引物对所述混合产物进行扩增包括：向混合产物中加入测序文库构建所需要的文库扩增引物和文库标签引物(即接头引物)、pcr聚合酶以及无核酸酶水，进行文库扩增，此步骤给各样本加上用于区分样本的文库标签(8bp的特异性核酸片段)，可以得到具有样本识别标签的、可用于高通量测序的dna文库；优选地，本发明实施例的测序接头引物为illumina公司的i5接头和i7接头。更进一步地，用测序接头引物对所述混合产物进行扩增的步骤之后，还包括第三磁珠纯化步骤。

更进一步地，在得到所述测序文库之后，还包括对所述测序文库进行质检的步骤。最终，文库片段大小应集中分布在250～420bp之间，采用荧光定量pcr仪对纯化产物进行定量，文库浓度可达21.6nmol/l。

总而言之，本发明实施例旨在解决我国国内尚无有效检测手段全面测定家族性高胆固醇血症基因突变的困局，采用多重pcr技术结合高通量测序文库建库技术，能对同fh疾病相关的10个基因的特定区域同时进行检测。操作简便步骤简单，有效减少了样本消耗，明显降低检测成本。

另一方面，本发明实施例提供一种用于构建fh测序文库的引物组，所述引物组包括：第一引物集、第二引物集；其中，所述第一引物集的序列如seqidno.1-130所示，所述第二引物集的序列如seqidno.131-260所示。

以及，一种用于构建fh测序文库的试剂盒，所述试剂盒包括本发明实施例的上述引物组。

本发明实施例提供的用于建库fh测序文库的引物组和试剂盒中，含有本发明实施例特有的针对fh相关的基因设计的两个引物集的多重pcr引物，根据扩增区域重叠的特征，该两个引物集中相邻目标区域的扩增引物不在同一个引物集中，在不采用探针捕获技术的条件下，利用多重pcr扩增实现待测区域的高度覆盖，该引物组和试剂盒用于构建fh测序文库，具有高检测覆盖度和高均一性、样本消耗量少、样本要求低和大量节省检测成本的优点，并能为临床发现新发基因突变提供技术基础。

进一步地，所述试剂盒还包括消化试剂、消化缓冲液、终止反应液、dna聚合酶和多重pcrdna聚合酶；其中，第一引物集和第二引物集，用于对目标区域进行特异性扩增；多重pcrdna聚合酶，以dna为模板，在包含多重特异性引物的反应体系中，对目标区域进行特异性扩增；消化试剂和消化缓冲液，用于消化多重pcr反应中非目标区域底物(常见的非特异性且具有特殊结构的序列)；终止反应液，用于终止消化反应；dna聚合酶，以消化产物为模板，在包含测序接头引物的反应体系中进行特异性扩增；

本发明实施例提供的fh测序文库的构建方法和引物组及试剂盒，可以用于ldlr、apob、pcsk9、ldlrap1、apoe、cetp、lipa、lpl、stap1以及slco1b1基因测序检测，其可以帮助临床医生快速查找家族性高胆固醇血症的致病原因，从分子生物学角度辅助fh诊断，为fh患者寻找确切的病因，同时可以指导患者用药，预防和减缓fh的发展等。

本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。

实施例1

已知临床诊断为家族性高胆固醇血症患者的样本s1，经全外显子高通量测序及sanger测序金标准验证为ldlr基因突变，采用本发明实施例进行检测。

主要仪器：eppendorf离心机5424，上海一恒恒温金属浴tus-200p，abi热循环仪veritidx，abi荧光定量仪7500，illumina高通量测序仪miseq等。

1.高通量测序文库构建，如图1所示，包括如下步骤：

1)核酸dna提取

人的全血样本核酸dna的提取，按照北京天根的血液基因组dna提取试剂盒进行外周血核酸提取，得到dna样本备用。

2)1^stpcr扩增(多重pcr扩增)及纯化

反应体系一共10μl，投入dna样本10ng，pcrmix2μl，每例样本各做2管pcr反应，分别加入本第一引物集和第二引物集各2μl，补水到10μl；反应程序如表3：

表3

pcr反应结束后，将产物混合，再用1.3倍xp磁珠纯化，10μltebuffer洗脱磁珠。

3)非目标区域底物消化及纯化

消化反应体系一共20μl，将6μl无核酸酶水、2μl消化酶、2μl消化缓冲液混合后加到步骤2)的纯化产物中，37℃孵育10分钟，加入2μl终止反应液混匀。反应结束后用1.3倍xp磁珠纯化，10μltebuffer洗脱磁珠。

4)2^ndpcr扩增(加接头)及纯化

文库扩增反应体系为40μl，将18μl无核酸酶水、8μlpcrmix、i5接头2μl、i7接头2μl混合后加到步骤3)的纯化产物中；反应程序如表4：

表4

pcr反应结束后用1.0倍xp磁珠纯化，10μltebuffer洗脱磁珠。

5)文库质控

使用生物分析仪及荧光定量pcr仪对文库进行质控，结果如图2所示；文库片段大小集中分布在250～420bp，文库浓度为21.6nmol/l；文库质控合格。

2.高通量测序及结果分析

使用illumina高通量测序仪对合格文库进行测序，并使用生物信息分析流程对原始下机数据进行质控过滤、分析。检测结果为，在ldlr基因6号外显子区域发现一个致病杂合突变c.939c>a(p.cys313ter)，其余基因的热点突变位点均为阴性，检测结果与全外显子测序、sanger验证结果一致。

实施例2

已知临床诊断为家族性高胆固醇血症患者的样本s2，经全外显子高通量测序及sanger测序金标准验证为ldlr及apoe基因突变，采用本发明进行检测。检测方法同实施例1。

检测结果发现在ldlr基因的13号外显子区域发现一个可能致病的杂合突变1879g>a(p.ala627thr)，在apoe基因的4号外显子区域发现一个增加患病风险的杂合突变c.388t>c(p.cys130arg)，其余基因的热点突变位点均为阴性，检测结果与全外显子测序、sanger验证结果一致。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>安吉康尔（深圳）科技有限公司

<120>fh测序文库的构建方法和引物组及试剂盒

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