本发明涉及种子处理技术领域，具体涉及一种脱除甜瓜种子中黄瓜花叶病毒方法。
背景技术：
甜瓜味甜色美，品质独特，素有“瓜中之王”的美称，是享誉国内外的名优特产。病毒病是当前甜瓜生产中的首要病害，发生普遍、流行严重，造成甜瓜含糖量降低，品质低劣，经济效益下降，很大程度上制约了甜瓜产业的发展。黄瓜花叶病毒（cucumbermosaicvirus，cmv）是雀麦花叶病毒科（bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（cucumovirus）的典型成员，其寄主广泛，能侵染85科、365属、1000种以上的单、双子叶植物，是目前世界范围内发生最普遍、分布最广、危害最严重的植物病毒之一。cmv是典型的种传病毒，携带病毒的种子不仅形成带毒幼苗作为病毒病发生的初侵染源，再经昆虫媒介的二次传播形成发病中心，引发病毒病大面积爆发；同时还随种质资源交流远距离传播扩散，对病毒病的发生、传播、危害影响极大。因此对种子进行脱毒和无害化处理，从源头上杜绝病原，是有效控制和预防甜瓜病毒病大发生，从而减少经济损失的重要环节。
研究表明，采用干热处理、温汤浸种、辐照、化学药剂等种子处理技术能在一定程度上脱除、钝化种子携带的病毒，有效降低种子带毒率。目前对辣椒等种子中的黄瓜花叶病毒（cmv）所研发的脱毒处理研究和应用有见报道，但未见针对甜瓜种子中cmv的脱毒方法。由于不同植物种子对高温、化学药剂等的耐受性均有较大差异，种子脱毒处理工艺直接影响脱毒效果、种子质量及寿命，操作稍有不慎，会导致种子发芽率和发芽势降低，或失去活力。因此在种子脱毒处理中，如何精确控制钝化病毒的技术指标，做到既能最大限度地保证种子脱毒效果彻底持久，同时又能使种子保持高活力，以降低风险、确保生产安全，是一个亟待解决的难题。建立高效、灵敏的病毒检测方法，制定安全高效的种子脱毒技术指标是解决这一难题的关键。
目前常用的种子脱毒效果的检测方法主要有苗期症状观察、指示植物法、酶联免疫法、免疫电镜法和rt-pcr技术，这些方法虽然能够对脱毒效果进行评价，但存在着稳定性差、只能定性检测、灵敏度有限等缺点，不能对病毒进行精确定量，难以确定种子脱毒处理措施对病毒数量和活性的影响，因此无法精确控制钝化病毒的技术指标，难以避免病毒脱除效果不佳，或种子中的病毒虽被脱除，但种子的品质却严重下降的现象。近年发展起来的实时荧光定量pcr技术，与上述检测方法相比，该法具有更加灵敏、简便、高效、稳定和定量化等优点。尤其是其可定量的特点应用于种子脱毒效果的检测中，能够精确掌握脱毒种子中病毒的含量，从而在保证种子高品质的前提下，准确控制钝化病毒的技术指标，做到最大限度地抑制病毒活性。目前尚未见利用实时荧光定量pcr技术进行甜瓜种子脱毒效果评价的报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有甜瓜种子脱毒方法的不足和缺陷，针对甜瓜种子中携带的主要病毒cmv，提供一种甜瓜种子高效、安全脱毒的方法，同时利用实时荧光定量pcr检测方法对脱毒效果进行评价，做到既能最大限度地抑制病毒活性，又不降低种子的发芽和活力，为甜瓜病毒病的防治和无毒种苗的繁育提供技术支持。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：针对甜瓜种子携带的主要病毒cmv，提供一种甜瓜种子脱毒方法，具体步骤如下。
1.干热处理：将甜瓜种子置于电热鼓风干燥箱网架上65℃条件下，热风处理48h。
2.药剂处理：待甜瓜种子自然冷却后，中加入5倍体积的10%na3po4溶液，浸泡40min。
3.滤种：药剂处理结束后，过滤种子，滤去10%na3po4溶液。
4.漂洗：用无菌水清洗甜瓜种子3-5次，滤干无菌水。
5.烘干：及时将步骤4中得到的种子均匀摊开，置于电热鼓风干燥箱网架上，35 ℃干燥至种子含水量低于10%。
6.病毒检测：利用实时荧光定量pcr检测方法对步骤5获得的种子进行病毒检测，并根据pcr扩增曲线ct值和标准曲线方程即可对甜瓜种子中的病毒含量进行精确定量，计算脱毒率，具体包括如下步骤。
（1）提取甜瓜种子总rna
随机选取10粒脱毒处理的种子和10粒未脱毒处理的种子，每粒为1份，分别在液氮中研磨至粉末，采用植物总rna提取试剂盒提取样品总rna。抽提rna产物加入depc-ddh2o溶解，-70 ℃保存备用。
（2）cdna的合成
以提取的待测甜瓜种子总rna为模板，反转录制备cdna模板。反转录体系为20µl包括：rna模板2µl，2.5mmol/l的dntps2µl，10µmol/l的随机引物2 µl，10×rtmix2µl，quantreversetranscriptase2µl，rnase-freeddh2o10 µl。反应条件：37 ℃，60min。
（3）实时荧光定量pcr检测
以合成的cdna为模板，分别设阳性对照、阴性对照及无菌双蒸水空白对照，利用cmv特异性引物对：cmv-cp1：agtccgtaaagttcctgc；cmv-cp2：tcatgtcgccaatatcag进行实时荧光定量pcr检测。实时荧光定量pcr检测体系为20µl：包括maximasybrgreen/roxqpcrmastermix(2x)10µl，10 µmol/l的上游引物cmv-cp10.4 µl、10 µmol/l的下游引物cmv-cp20.4 µl，模板1µl，补足灭菌ddh2o至20 µl。荧光定量pcr检测反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火、延伸30s，循环40次；60℃收集荧光。
（4）带毒量检测
反应结束后记录各检测样品的pcr扩增曲线ct值，按照cmv实时荧光定量pcr检测结果的阳性判定标准判定待检样本中是否存在cmv：如果样品荧光pcr扩增曲线的ct值≤40，而且同时阴性对照及空白对照无扩增曲线，则判定待检样品中含有cmv，否则该样本不含cmv；并通过建立的cmv实时荧光定量pcr反应的标准曲线方程：y=-3.9872x＋54.128（x为所测样品中cmv目标基因片段拷贝数的对数，y为ct值）计算出检测样品中cmv的基因片段拷贝浓度，从而对甜瓜种子中cmv含量进行定量检测。
（5）计算种子脱毒率
种子脱毒率（%）=（1-处理后种子的带毒量/未处理种子带毒量）×100。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明提供的甜瓜种子脱毒方法与现有方法相比，本发明解决了既能最大限度地抑制病毒活性，又不降低种子的发芽和活力这一难题。利用本发明提供的方法不仅提高了甜瓜种子的发芽率及发芽势，而且对甜瓜种子中cmv的脱除更为彻底，种子和种苗脱除率分别达到98.07%和100%。
2、与传统的田间指示植物检测相比，本发明提供的实时荧光定量pcr检测方法大大缩短了检测时间，传统的方法需要几个月甚至1年的时间才能完成，而本发明只需要几个小时即可完成脱毒效果检测。
3、与目前常用的血清学技术、rt-pcr检测方法相比，本发明提供的实时荧光定量pcr检测方法，不仅灵敏度更高、特异性更强、检测效率更快，而且可以对脱毒种子中的病毒含量进行精确定量，大大提高了脱毒效果评价的准确性和真实性。
4、本发明提供的甜瓜种子脱毒方法不受时间限制、环境的影响，可常年在实验室或基层单位使用，非常实用，可用于脱毒甜瓜种子的规模化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。
试验药品：植物总rna提取试剂盒(rnapreppureplantkit)、反转录试剂盒（tianscriptrtkit）、三磷酸脱氧核苷酸（dntps）、taqdna聚合酶、na3po4购自北京天根生化科技有限公司；maximasybrgreen/roxqpcrmastermix(2x)购自thermo公司；cmv特异性引物对cmv-cp1/cmv-cp2由上海生工生物工程股份有限公司合成。
仪器设备：实时荧光pcr仪（abi7500fast），电热鼓风干燥箱（上海一恒dhg-9013a）。
试验材料：采集于新疆南、北疆甜瓜主要生产区，经das-elisa和rt-pcr扩增、测序鉴定为cmv感染的甜瓜种子样品为阳性材料，健康甜瓜种子样品为阴性材料，品种为春潇2号。
本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例1.几种脱毒方法的脱毒效果比较
本实施例设计5种脱毒方法对甜瓜种子进行脱毒处理，以未脱毒甜瓜种子作为对照，每种处理的种子量约为100粒饱满带毒甜瓜种子。种子脱毒处理后利用rt-qpcr检测方法对甜瓜种子及幼苗中cmv进行定性和定量检测，比较各脱毒方法的脱毒效果。
1.脱毒方法设计如下：
（1）干热处理法：将待脱毒处理的甜瓜种子置于电热鼓风干燥箱网架上，在65℃条件下，热风处理48h后静置冷却。
（2）湿热处理法：将待脱毒处理的甜瓜种子浸泡于5倍体积的沸水中，并迅速震荡冷却至40-45 ℃，滤干水溶液后及时将处理种子置于电热鼓风干燥箱网架上，35 ℃干燥至种子含水量低于10%，防止种子霉变及发芽。
（3）温汤处理法：将待脱毒处理的甜瓜种子置于5倍体积的55℃温水中浸种40min；滤干水溶液后及时将处理种子置于电热鼓风干燥箱网架上，35 ℃干燥至种子含水量低于10%，防止种子霉变及发芽。
（4）干热+湿热处理法：先将待脱毒处理的甜瓜种子置于电热鼓风干燥箱网架上，在65℃条件下，热风处理48h；之后将种子浸于5倍体积的沸水中，并迅速震荡冷却至40-45 ℃；滤干水溶液后及时将处理种子置于电热鼓风干燥箱网架上，35 ℃干燥至种子含水量低于10%，防止种子霉变及发芽。
（5）干热+10%na3po4处理法：先将待脱毒处理的甜瓜种子置于电热鼓风干燥箱网架上，在65℃条件下，热风处理48h；之后用10%的na3po4溶液浸种40min；药剂处理结束后，滤去10%na3po4溶液，用无菌水清洗甜瓜种子3-5次；滤干水溶液后及时将处理种子置于电热鼓风干燥箱网架上，35 ℃干燥至种子含水量低于10%，防止种子霉变及发芽。
（6）对照：以未脱毒处理的带毒甜瓜种子作为对照。
2.种子脱毒检测：各脱毒处理及对照随机选取10粒甜瓜种子，每粒为1份，采用rt-qpcr检测方法对种子中的cmv进行定量检测，计算种子脱毒率，种子脱毒率（%）=（1-处理后种子的带毒量/未处理种子带毒量）×100。
3.种子幼苗脱毒检测：随机选取30粒干热处理和干热+na3po4处理后的种子进行催芽，待出芽后分别播种于塑料育苗钵中，育苗基质为灭菌土，人工气候箱中常规培养。幼苗生长至3叶1心时利用rt-qpcr检测种苗带毒量。
4.rt-qpcr检测：
（1）总rna提取
采用植物总rna提取试剂盒提取样品总rna。抽提rna产物加入depc-ddh2o溶解，-70 ℃保存备用。
（2）cdna的合成
以提取的总rna为模板，反转录制备cdna模板。反转录体系为20µl包括：rna模板2µl，2.5mmol/l的dntps2µl，10µmol/l的随机引物2 µl，10×rtmix2µl，quantreversetranscriptase2µl，rnase-freeddh2o10 µl。反应条件：37 ℃，60min。
（3）实时荧光定量pcr检测
以合成的cdna为模板，分别设阳性对照、阴性对照及无菌双蒸水空白对照，利用cmv特异性引物对：cmv-cp1：agtccgtaaagttcctgc；cmv-cp2：tcatgtcgccaatatcag进行实时荧光定量pcr检测。实时荧光定量pcr检测体系为20µl：包括maximasybrgreen/roxqpcrmastermix(2x)10µl，10µmol/l的上游引物cmv-cp10.4µl、10µmol/l的下游引物cmv-cp20.4µl，模板1µl，补足灭菌ddh2o至20µl。荧光定量pcr检测反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火、延伸30s，循环40次；60℃收集荧光。
（4）定性及定量检测
反应结束后记录各检测样品的pcr扩增曲线ct值，按照cmv实时荧光定量pcr检测结果的阳性判定标准判定待检样本中是否存在cmv：如果样品荧光pcr扩增曲线的ct值≤40，而且同时阴性对照及空白对照无扩增曲线，则判定待检样品中含有cmv，否则该样本不含cmv；并通过建立的cmv实时荧光定量pcr反应的标准曲线方程：y=-3.9872x＋54.128（x为所测样品中cmv目标基因片段拷贝数的对数，y为ct值）计算出检测样品中cmv的基因片段拷贝浓度，从而对甜瓜种子中cmv含量进行定量检测。
5.结果与分析
实时荧光定量pcr检测结果显示，不同脱毒方法处理的甜瓜种子cmv检测结果均为阳性。根据各处理的反应ct值利用cmv标准曲线方程对甜瓜种子中的病毒含量进行精确定量，进而计算各处理脱毒率，结果（见表1）显示不同脱毒方法处理的种子中所含cmv的量较对照都有显著减少。其中干热处理和干热+10%na3po4处理法的脱毒效果最为理想，脱毒率达到98.93%和98.07%，进一步检测其种子处理后对种苗的脱毒率。结果（见表2），未经处理的种苗带毒率为6.66%，带毒量为4.59x104copies/g鲜重；干热处理其幼苗带毒率可达3.33%，带毒量为4.57x103copies/g鲜重，而种子经干热+10%na3po4处理后，其幼苗中检测不出cmv，可100%脱除病毒。
表1不同脱毒方法对甜瓜种子中cmv的脱毒效果
表2不同处理对种苗中cmv病毒的脱除结果
实施例2.几种脱毒方法对甜瓜种子发芽率及发芽势的影响
随机选取实施例1中各脱毒处理及未脱毒处理的甜瓜种子各60粒，分为3组，用冷水浸泡4h后采用培养皿滤纸恒温发芽法，在28 ℃恒温培养箱中进行种子萌发试验，处理后第3天记录发芽数，计算发芽势；第7天统计发芽数，计算发芽率，种子发芽的标准为种子露白。发芽率（%）=（发芽的种子数/供试种子数）×100；发芽势（%）=（规定时间内的种子发芽数/供试种子数）×100。
种子萌发试验结果表明（见表3），对照种子的发芽势及发芽率分别为63.33%和86.67%，其中对发芽势、发芽率影响最大的是温汤处理法，处理后的甜瓜种子的发芽势、发芽率分别下降为53.33%和73.33%。但除温汤处理法外，其它脱毒法处理的甜瓜种子较对照的发芽势、发芽率均有所提高，其中干热+10%na3po4处理法的发芽势及发芽率最高分别为73.33%、100%。
表3不同脱毒方法对甜瓜种子发芽率及发芽势的影响