专利名称：一种快速检测多种甜瓜病毒的引物组和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于植物病毒学技术领域，特别是涉及一种快速检测多种甜瓜病毒的引物 组和试剂盒。
背景技术：
我国是西瓜的主要生产国之一，每年西瓜种植面积平均在1800万亩以上，种植面 积居世界第一位。其中西北地区为我国重要的西瓜优质产区。病毒病在西瓜生产上是一种 普遍发生且危害性很大的病害，一般年份发病比率为10% 30%，重发年份可高达50% 80%以上。西瓜病毒病的大面积发生，造成西瓜大量减产，品质下降，将会严重影响了西瓜 的高产、稳产、优质、高效益及瓜农的生产积极性。侵染西瓜的病毒主要有以下5种黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaicvirus, CMV)、 ItiliE口十__ (Squash mosaic virus, SqMV)(Tobaccomosaic virus, TMV) > 西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)禾口小西萌声黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)，而且在田间病毒会经常发生复合感染。目前，用于西瓜病毒的检测方法，有生物学、电镜观察、血清学、RT-PCR和核酸杂 交，但由于生物学检测法周期长，电镜操作需要一定技能，不易进行大量样本的集中处理， 同时仪器费用高，所以生物学方法和电镜检测在西瓜病毒检测中存在很大局限性。尽管血 清学方法得到了广泛应用，但商品化的抗血清价格较高，一种抗血清只能检测一种病毒，而 且还具有一定的假阳性反应等问题。单重RT-PCR(sRT-PCR)和核酸杂交检测方法一个反应 只能检测一种病毒，而田间西瓜病毒多是复合侵染，所以用这两种方法检测要耗费较多时 间和试剂。为了保证西瓜生产的产量和质量，准确鉴定西瓜病毒病，西瓜生产上急需一种较 为准确、灵敏和快速的病毒检测弓I物和试剂盒。
发明内容
本研究针对陕西省西瓜病害发生的现状，运用根据5种病毒核苷酸保守区序列设 计的特异性引物对，从影响多重RT-PCR(M-PCR)扩增的引物浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合 酶浓度、dNTPs浓度、退火温度等方面进行多重RT-PCR体系的优化，建立能从西瓜叶片组织 中同时检测CMV、SqMV, TMV, WMV和ZYMV 5种病毒复合侵染田间样品的引物组和试剂盒。为解决上述技术问题，本发明提供了一种同步检测2-5种甜瓜病毒的引物组，该 引物组包含如下5对引物中的2-5对引物第1 对引物=CMV-F(SEQ ID NO. 1)/CMV-R(SEQ ID NO. 2)SEQ ID Ν0· 1:5' -ATTGGTCGTCCCACTCTT-3'SEQ ID NO. 2:5' -TCGCCAAACATAGCAGAG-3'第2 对引物SqMV-F (SEQ ID NO. 3)/SqMV-R (SEQ ID NO. 4)SEQ ID NO. 3:5' -AGGCACATTTCGCAGTTC-3'SEQ ID NO. 4:5' -CGATGGTTGCCTTTATGT-3'
第3 对引物TMV-F(SEQ ID NO. 5)/TMV_R(SEQ ID NO. 6)SEQ ID NO. 5:5' -GCCGACCCAATAGAGTTA-3'SEQ ID NO. 6:5' -GAGGTCCAAACTAAACCAGAAG-3'第4 对引物WMV-F (SEQ ID NO. 7)/WMV-R(SEQ ID NO. 8)SEQ ID NO. 7:5' -CCAGTGGCAAAGGTGATA-3'SEQ ID NO. 8:5' -TGCTGCGTCTGAGAAATG-3'第5 对引物ZYMV-F(SEQ ID NO. 9)/ZYMV-R(SEQ ID NO. 10)SEQ ID NO. 9:5' -GGAGCGGAAACAAGTGAA-3'SEQ ID NO. 10 5' -ACCTGCTCATTCCCATCC-3'。优选地，引物组中包含5对引物SEQ ID NO. I-IO0其中甜瓜病毒为黄瓜花叶病毒(CMV)、南瓜花叶病毒(SqMV)、烟草花叶病毒 (TMV)、西瓜花叶病毒(WMV)和小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)。本发明还提供了一种同步检测2-5种甜瓜病毒的试剂盒，该试剂盒包含5对引物 SEQ ID N0. 1-10。上述试剂盒中的5对引物浓度比例为第1对引物第2对引物第3对引物第 4 对引物第 5 对引物=1. 2-1. 6 0.8-1.2 0.8-1.2 0.8-1.2 1.3-1. 7，优选地， 五对引物浓度比例为第1对引物第2对引物第3对引物第4对引物第5对引物= 1:1:1:1:1。上述试剂盒中，还包dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR缓冲液。其中dNTPs浓度为 0. 10-0. 6mmol/L ；Taq DNA 聚合酶浓度为 0. 05-0. 5U/ μ L ；Mg2+ 浓度为 1. 0-3. 5mmol/L,优选 地 dNTPs 浓度为 0. 4mmol/L,Taq DNA 聚合酶浓度为 0. 20U/μ L，Mg2+浓度为 3. Ommo 1/L, PCR 缓冲液浓度为0.8X至IX。上述同步检测2-5种甜瓜病毒的引物组和试剂盒的使用是按照包含如下步骤的 方法使用1)病毒总RNA的提取提取感染1-5种病毒的甜瓜叶中的病毒总RNA ；2)多重 RT-PCR 应用SEQ ID N0. 2、4、6、8、10(第1-5对引物中反向引物序列)对病毒总RNA进行 逆转录制备cDNA模板，然后应用SEQ ID NO. 1_10 (第1_5对引物中的正向和反向序列)对 cDNA模板进行多重PCR反应，得扩增产物；3)电泳检测对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得病毒基因扩增产物条带，判定烟草病毒种 类。上述方法还可以包含如下步骤4)结果分析将条带中的基因与质粒进行体外连接，挑取阳性克隆，提取质粒测序，与设计的 PCR产物大小比较，分析所得序列与参考序列的同源率，判定多重RT-PCR检测结果的可靠 性。该方法中所述的物质应用上述引物组和试剂盒。
上述方法中，多重PCR反应中，退火温度为46-51 °C，延伸时间为20s-90s，循环次 数为25-45次，优选地，扩增条件为退火温度51°C，延伸时间60s，循环次数35次。甜瓜病毒病常为复合侵染，本研究经过多次优化和摸索条件建立了同时检测五种 甜瓜病毒的多重PCR的引物组和试剂盒。应用这些引物组和试剂盒的技术在甜瓜复合感染 病毒的检测中，具有节省时间、降低成本、提高效率优点。在甜瓜栽培生产中，能够即快速、 准确又简便和经济的检测出幼苗带毒情况，以便尽早采取有效防治措施，对控制病害在田 间的发生、减少经济损失、抗病筛选和病害流行预测具有十分重要的意义。在国内同时检测 多种甜瓜病毒病害几乎没有报道。这项技术已成功的应用于田间甜瓜病害复合侵染的同步 检测。
图1实验室条件下用所建立的多重RT-PCR体系检测五种单一(样品1、样品2、样 品3、样品4、样品5)及混合的甜瓜病毒(样品6)；图2是检测陕西省杨凌、韩城、礼泉、扶风、周至、武功6个地区甜瓜样品上的甜瓜 病毒(样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、样品6)的电泳检测结果
具体实施例方式为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不限制本发明。引物的设计和制备根据GenBank上登录的CMV、SqMV、TMV、WMV和ZYMV病毒外壳蛋白基因序列 (EF202597. UDQ868881. UDQ352454. UDQ399708. UAY611022. 1)，应用 Primier 5. 0 引物 设计软件分别设计这5种病毒的特异引物。由于多重PCR要求在同一个退火温度下同时扩 增多个目的片段，因此利用软件DNAMAN计算引物Tm值，对设计的大量引物进行筛选，选择 Tm值较一致的各条引物，保证在同一个退火温度下同时检测到WMV、CMV、SqMV, TMV和ZYMV 5 种病原 CMV-F (SEQ ID NO. 1)/CMV-R (SEQ ID NO. 2)、SqMV-F (SEQ ID NO. 3)/SqMV-R (SEQ ID NO. 4)、TMV-F (SEQ ID NO. 5)/TMV-R(SEQ ID NO. 6),WMV-F(SEQ ID NO. 7)WMV-R(SEQ ID NO. 8)和 ZYMV-F (SEQ ID NO. 9)/ZYMV-R (SEQ ID NO. 10)。每个引物的信息如下表 1 所示表1引物序列SEQ ID N0. 1-10的信息 上述引物由北京赛百盛公司合成。本发明的实施例中所用到的实验材料如下ZYMV, WMV, TMV、SqMV和CMV 5种毒原分别在甜瓜上接种繁殖，保存于_80°C冰箱 中。Taq盒为优晶生物工程有限公司产品，克隆载体pMDIS-T simple vector、分子生物学 菌株材料购自TaKaRa (大连)生物有限公司。实施例1单重RT-PCR检测陕西杨凌5种单一甜瓜病毒样品 分别采取6个样品ZYMV、WMV, TMV、SqMV, CMV及5种病毒混合感染的甜瓜叶，样 品标号为样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、样品6。病毒总RNA的提取分别称取ZYMV、WMV, TMV、SqMV, CMV及5种病毒混合感染的甜瓜叶(分别标记为 样品2、样品3、样品4、样品5、样品6)各0. 5g放入-80°C深冻研钵中加液氮充分研磨，迅速 转入到无RNase的无菌1. 5mL印pendorf管中，加入500 μ L苯酚/氯仿(1 1)和500 μ L RNA 抽提缓冲液(Tris-HC120mmol/L，SDSl %, NaCl 200mmol/L, EDTA50mmol/L)，充分振荡 2min，4°C，12，OOOg离心5min。上清用等体积苯酚/氯仿再抽提一次，4°C，12，OOOg离心 5min。上清加入等体积4M LiCl，4°C沉淀4h以上，于4°C，12，OOOg离心15min。弃上清液， 沉淀用70%预冷的乙醇洗涤两次，充分干燥后溶于30 μ L DEPC处理的ddH20中_20°C保存 备用。同时以健康烟草(标记为样品1)总RNA为阴性对照，提取方法同上。逆转录(RT)反应分别对每种病毒的总RNA进行逆转录反应。用M-MLV反转录酶反转录合成各病 毒cDNA第一链。25yLRT反应体系如下2yL总RNA，lyL病毒特异反向引物(IOymol/ L)，7 μ LDEPC-H2O, 70 "C 变性 5min，迅速置冰上 5min ；再加入 5yL 5 X RT buffer, 5 μ LdNTP (2. 5mmol/L each)，0. 5 μ LRNase 抑制剂(40U/ μ L)禾口 1 μ L M-MLV 反转录酶 (200U/ μ L)，离心后，42°C水浴lh, 95°C灭活5min,置冰上待用。PCR 反应25 μ L PCR 标准反应体系12· 3μ L ddH20, 2. 5 μ L 10XPCR buffer [750mmol/ LTris-HCl (pH 8. 8) , 200mmol/L (NH4) 2S04, 0. 1 % Tween 20]，2 μ L25mmol/LMgCl2， 2 μ LdNTP(2. 5m mol/L each)，2 μ L正向和反向引物混合物(各 10 μ mol/L)，0. 2 μ LTaq DNA 聚合酶(5U/y L)和2μ L RT产物。PCR反应循环参数94°C预变性3min ；94°C变性45s， 46°C退火45s，72°C延伸lmin，循环30次；最后72°C终止补偿延伸lOmin。取5μ LPCR产物 经2%琼脂糖凝胶电泳分析比较。电泳检测取5 μ L PCR反应产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，在0. 5 X TAE缓冲液环境中，110V 稳压电泳40min，然后用凝胶成像系统观察并记录结果，分别得到5条特异性条带，得到每 种病毒的扩增引物条带位置，参见说明书附图中的图1。实施例2多重RT-PCR检测陕西杨凌多种病毒感染的甜瓜病毒样品病毒总RNA的提取分别对来自陕西杨凌、韩城、礼泉、扶风、周至和武功六个地方的甜瓜花叶病样品 (分别标记为样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、样品6)各0. 5g放入-80°C深冻研钵中 加液氮充分研磨，迅速转入到无RNase的无菌1. 5mL印pendorf管中，加入500 μ L苯酚/氯仿(1 1)和 500 μ LRNA 抽提缓冲液(Tris-HCl 20mmol/L, SDSl %, NaCl 200mmol/L, EDTA50mmol/L)，充分振荡2min，4°C，12，OOOg离心5min。上清用等体积苯酚/氯仿再抽提 一次，4°C，12，OOOg离心5min。上清加入等体积4M LiCl，4°C沉淀4h以上，于4°C，12，OOOg 离心15min。弃上清液，沉淀用70%预冷的乙醇洗涤两次，充分干燥后溶于30 μ L DEPC处 理的ddH20中_20°C保存备用。多重逆转录(RT)反应分别对每个病毒样品的总RNA进行逆转录反应。用M-MLV反转录酶反转录合成各 病毒cDNA第一链。25 μ L RT反应体系如下15yL总RNA，2yL 5种病毒特异反向引物混 合物(各1(^11101/1)，7口1^ DEPC-H2O, 70°C 变性 5min，迅速置冰上 5min ；再加入5 μ L 5 X RT buffer, 5 μ LdNTP (2. 5mmol/L each)，0. 5 μ LRNase 抑制剂(40U/ μ L)禾口 1 μ L M-MLV 反转录 酶(20(^/1^)，离心后，421水浴lh，95°C灭活5min，置冰上待用。多重PCR反应25 μ L PCR 标准反应体系12· 3μ L ddH20, 2. 5 μ L 10XPCR buffer [750mmol/ LTris-HCl (pH 8. 8), 200mmol/L (NH4) 2S O4,0. 1 % Tween 20]，3 μ LMgCl2 (25mmol/L)， 4 μ LdNTP (各 2. 5m mol/L)，5 对特异性引物各 0· 4 μ L (各 10 μ mol/L)，0. 2 μ L Taq DNA 聚 合酶(5U/y L)和2μ L RT产物。PCR反应循环参数94°C预变性3min ；94°C变性45s，46°C 退火45s，72°C延伸lmin，循环30次；最后72°C终止补偿延伸lOmin。取5μ LPCR产物经 2%琼脂糖凝胶电泳分析比较。电泳检测取5 μ L PCR反应产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，在0. 5 X TAE缓冲液环境中，IlOV 稳压电泳40min，然后用凝胶成像系统观察并记录结果，分别得到5条特异性条带，得到每 种病毒的扩增引物条带位置，参见说明书附图中的图2。PCR产物序列分析割胶回收经多重PCR 扩增的 ZYMV、WMV、TMV、SqMV 和 CMV 条带，与 pMD18_T simple vector进行体外连接，挑取阳性克隆，提取质粒测序。测序结果表明，ZYMV、WMV, TMV、SqMV 和CMV的扩增产物分别由542、485、410、354、293个核苷酸组成，与设计的PCR产物大小相 同，分别为ZYMV、WMV, TMV、SqMV和CMVCP基因的部分序列。序列同源性分析结果表明，所 得序列与参考序列的同源率分别达到98. 63%,99. 24%,99. 91%,98. 32和99. 02%.证明 了多重PCR检测结果的可靠性。本发明的方法已经通过具体的实施例进行了描述。本领域技术人员可以借鉴本发 明的内容适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离 本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为 包括在本发明的范围之内。
权利要求
一种同步检测2 5种甜瓜病毒的引物组，该引物组包含如下5对引物中的2 5对引物第1对引物CMV F(SEQ ID NO.1)/CMV R(SEQ ID NO.2)SEQ ID NO.15′ ATTGGTCGTCCCACTCTT 3′SEQ ID NO.25′ TCGCCAAACATAGCAGAG 3′第2对引物SqMV F(SEQ ID NO.3)/SqMV R(SEQ ID NO.4)SEQ ID NO.35′ AGGCACATTTCGCAGTTC 3′SEQ ID NO.45′ CGATGGTTGCCTTTATGT 3′第3对引物TMV F(SEQ ID NO.5)/TMV R(SEQ ID NO.6)SEQ ID NO.55′ GCCGACCCAATAGAGTTA 3′SEQ ID NO.65′ GAGGTCCAAACTAAACCAGAAG 3′第4对引物WMV F(SEQ ID NO.7)/WMV R(SEQ ID NO.8)SEQ ID NO.75′ CCAGTGGCAAAGGTGATA 3′SEQ ID NO.85′ TGCTGCGTCTGAGAAATG 3′第5对引物ZYMV F(SEQ ID NO.9)/ZYMV R(SEQ ID NO.10)SEQ ID NO.95′ GGAGCGGAAACAAGTGAA 3′SEQ ID NO.105′ ACCTGCTCATTCCCATCC 3′。
2.根据权利要求1所述的引物组，该引物组中包含5对引物SEQIDNO. I-IO0
3.根据权利要求1或2所述的引物组，其中甜瓜病毒为黄瓜花叶病毒(CMV)、南瓜花叶 病毒(SqMV)、烟草花叶病毒(TMV)、西瓜花叶病毒(WMV)和小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)。
4.一种同步检测2-5种甜瓜病毒的试剂盒，该试剂盒包含5对引物SEQ IDN0. 1_10。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中5对引物浓度比例为第1对引物第2对引物 第 3对引物第4对引物第 5对引物=1. 2-1. 6 0. 8-1. 2 0. 8-1. 2 0. 8-1. 2 1. 3-1 .7。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中5对引物浓度比例为第1对引物第2对引物 第3对引物第4对引物第5对引物=1 1 1 1 1。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其中还包dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR缓冲液。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中dNTPs浓度为0.10-0. 6mmol/L TaqDNA聚合酶 浓度为 0. 05-0. 5U/ μ L ；Mg2+ 浓度为 1. 0-3. 5mmol/L。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其中dNTPs浓度为0.4mmol/L, Taq DNA聚合酶 浓度为0. 20U/ μ L，Mg2+浓度为3. Ommol/L, PCR缓冲液浓度为0. 8Χ至1 X。
全文摘要
本发明涉及一种快速检测多种甜瓜病毒的引物组和试剂盒，运用根据5种病毒核苷酸保守区序列设计的特异性引物对SEQ ID NO.1-10，从影响多重RT-PCR(M-PCR)扩增的引物浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、退火温度等方面进行多重RT-PCR体系的优化，建立能从西瓜叶片组织中同时检测CMV、SqMV、TMV、WMV和ZYMV 5种病毒复合侵染田间样品的引物组和试剂盒。应用这些引物组和试剂盒的技术在甜瓜复合感染病毒的检测中，具有节省时间、降低成本、提高效率优点。
文档编号C12Q1/70GK101906485SQ20101023275
公开日2010年12月8日 申请日期2010年7月21日 优先权日2010年7月21日
发明者吴云锋 申请人:西北农林科技大学