专利名称：一种同步检测多种烟草病毒的引物组和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于植物病毒学技术领域，特别是涉及一种同步检测多种烟草病毒的引物 组和试剂盒。
背景技术：
烟草是全世界最主要的经济作物之一，我国的种植面积居世界首位。然而，随着产 业的发展，种植面积的扩大与产业结构调整，20世纪70年代以后，烟草病毒病危害逐年加 重。由于病毒的侵染，烟草叶绿素的受到破坏，从而导致了光合作用的下降，严重影响烟叶 的产量和质量，造成重大的经济损失。危害我国烟草的主要病害有烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus，TMV)、黄瓜 花叶病毒(Cucumber Mosaic Virus, CMV)、马铃薯 Y 病毒(Potato Virus Y, PVY)、烟草蚀 纹病毒(Tobacco Etch Virus, TEV)禾口烟草脉带花叶病毒(Tobaccovein banding mosaic Virus, TVBMV)等。其中TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV是引起烟草病毒病的主要病毒。对危害烟草的病毒进行准确和快速检测诊断，在预防和控制烟草病毒病具有十分 重要的意义。然而，目前检测烟草病毒的主要方法有指示植物法、电镜法、血清学法以及普 通PCR技术。这些检测方法主要是针对单个病毒检测，费时费力。多重PCR(M-PCR)是在普通 PCR (polymerase chain reaction)的基础上加以改 进，于一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域 扩增多个目的片段的PCR技术。与常规的单一 PCR相比，多重PCR可以同时检测多种病害， 极大地提高检测效率，降低检测成本。目前国内仅有单重PCR检测TMV、CMV等的报道，而 在田间经常表现为多种病害复合侵染，利用单一 PCR对多种病毒进行系统检测的工作量较 大，因而多重PCR在烟草病毒病的检测中的优越性更为明显，目前正缺少能够同步检测多 种烟草病毒的试剂盒。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种同步检测多种烟草病毒的引物组，该引 物组包含5对引物SEQ ID NO :l-10o本发明提供了一种同步检测多种烟草病毒的试剂盒，该试剂盒由组分I和组分II 组成；组分I和组分II中的各试剂单独分装，组分I包含反转录酶、RNA酶抑制剂，dNTP 混合物，反向引物序列组，反转录反应缓冲液；组分II包含PCR反应缓冲液，dNTP混合物， MgCl2，Taq DNA聚合酶，PCR引物组，其特征在于反向引物序列组包含SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQID NO 8 和 SEQ ID NO 10 ；PCR 引物组包含 SEQ ID NO :1_10。其中烟草病毒选自烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒 (PVY)、烟草蚀纹病毒(TEV)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)5对引物SEQ ID NO :1_10的序列信息如下第1对引物
SEQ ID NO. 1 5' -TAGACCCGCTAGTCACAG-3‘(正向序列)SEQ ID NO. 2 5' -CAGAGGTCCAAACCAAAC-3‘(反向序列)第2对引物SEQ ID NO. 3 5' -GTGGGTGACAGTTCGTAAA-3‘(正向序列)SEQ ID NO. 4 5' -GTGGGAATGCGTTGGT-3‘(反向序列)第3对引物SEQ ID NO. 5 5' _T AG TGGATGGTGAGGAG-3'(正向序列)SEQ ID NO. 6:5' -GTGCCGTTCAGTGTCTT-3‘(反向序列)第4对引物SEQ ID NO. 7 5' -CCGAGAATCAAGGCTATC-3‘(正向序列)SEQ ID NO. 8 5' -CGCTAAACCTACATCCC-3‘(反向序列)第5对引物SEQ ID NO. 9 5' -GAGGTCGTGAACTTACAGC-3‘(正向序列)SEQ ID NO. 10 5' -GAGGTCGTGAACTTACAGC-3‘(反向序列)上述试剂盒，组分II的PCR引物组中五对引物浓度比例为第1对引物第2对引 物第3对引物第4对引物第5对引物=1. 2-1. 6 0. 8-1. 2 0. 8-1. 2 0. 8-1. 2 1. 3-1. 7，优选地，5对引物浓度比例为第1对引物第2对引物第3对引物第4对引物 第 5 对引物=1. 4 1 1 1 1. 5。上述试剂盒，组分II中dNTP浓度为0. 12-0. 32mmol/L ；Taq DNA聚合酶浓度为 0. 02-0. 12U/ u L ；MgCl2 浓度为 1. 2-3. 2mmol/L,优选地 dNTPs 浓度为 0. 28mmol/L, Taq DNA 聚合酶浓度为o. 10U/ u L，MgCl2浓度为2. 4mmol/L。
优选地，组分I中，反转录酶为M-MLV反转录酶 优选地，组分I的组成如下 dNTP (各 2. 5mmol/L) 反向引物序列组(lOiimol/L) 5XRT buffer RNase 抑制剂(40U/ u L) M-MLV 反转录酶(200U/ u L)
depc-h2o
5 li L 1 u L 5 u L 0. 5u L 1 u L 7u L优选地，组分II 中 PCR 反应缓冲液为 750mmol/LTris-HCl (pH8. 8)，200mmol/ L(NH4)2S04，0. 1% Tween 20，优选地，组分11的组成如下dNTP 混合物(各 2. 5mmol/L) 2 u LMgCl2(25mmol/L)2 u LTaqDNA 聚合酶(5U/ u L) 0. 2 u LPCR 引物组liiL10 X PCR 反应缓冲液2.4iiLddH2014. 4u LPCR引物组中5对引物浓度比例为第1对引物第2对引物第3对引物第4对引物第5对引物=1.4 1 1 1 1.5。烟草病毒病常为复合侵染，使用本发明的检测试剂盒进行多重RT-PCR，就能够同 时检测中国五种主要烟草病毒，极大地提高检测效率，降低检测成本，该试剂盒已成功地应 用于室内和田间烟草病毒病害复合侵染的同步检测中，证明本发明的试剂盒应用于多重 RT-PCR有效地检测了植物病毒。
图1单重RT-PCR的检测5种单一烟草病毒样品的电泳检测结果M 标准核酸分子量Markerl ；泳道1 健康烟草样品；泳道2_6 依次为TMV、CMV、 TEV、PVY和TVBMV病毒样品图2多重RT-PCR检测5种烟草病毒混合样品的电泳检测结果M:标准核酸分子量Markerl ；泳道A:健康烟草样品；泳道B_F:依次为TMV、 TMV+CMV、TMV+CMV+TEV、TMV+CMV+TEV+PVY, TMV+CMV+TEV+PVY+TVBMV 病毒样品
具体实施例方式为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不限制本发明。本发明中所用到的引物通过如下方法设计根据TMV、CMV、TEV、PVY 和 TVBMV 的外壳蛋白基因序列，应用 PrimerPrimier 5. 0 引物设计软件，每种病毒设计出1对特异引物，TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV的特异引物依次 为 TMV cpF (SEQ ID NO. 1)/TMV cpR(SEQID NO. 2)、CMV cpF (SEQ ID NO. 3) /CMV cpR(SEQ ID NO. 4), TEV cpF (SEQ ID NO. 5) /TEV cpR(SEQ ID NO. 6)、PVY cpF (SEQ ID NO. 7)/PVYcpR (SEQ ID NO. 8)禾口 TVBMV cpF (SEQ ID NO. 9) /TBMV cpR(SEQ ID NO. 10)。每个引物的信息如下表 1所示表1引物序列SEQ ID NO. 1-10的信息 上述引物由北京赛百盛公司合成。本发明的实施例中所用到的实验材料如下烟草病毒病样品以病叶片为材料，分别采自陕西杨凌烟草田，用自封袋包装，采集 叶片冻存于-80°C冰箱中备用。Taq盒为优晶生物工程有限公司产品，克隆载体pMD18-Tsimple vector、分子生物学菌株材料购自TaKaRa(大连)生物有限公司。实施例1 单重RT-PCR病毒总RNA的提取分别称取感染TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV五种病毒的烟草的病叶(分别标记为 样品2、样品3、样品4、样品5、样品6)各0. lg于-80°C深冻研钵中，加液氮充分研磨，迅 速转入至IJ无 RNase 的无菌 1. 5mL 印pendof■管中，力口入 lmL BIOzol Extraction Reagent 混勻，放置15min。加入0.2mL氯仿和0.3ml苯酚溶液上下倒置混勻，4°C 12000Xg离心 15min。取上清液转入新印pendof管中，加入与上清液等体积的异丙醇，振荡混勻，-20°C放 置30min。4°C 12000Xg离心15min，弃上清液。用lmL 75%乙醇(DEPC水配制)洗涤沉 淀，4°C 12000Xg离心5min，弃上清液，自然干燥。加入30 y L DEPC水溶解沉淀。-80°C保 存备用，获得5种烟草病毒的总RNA，同时以健康烟草(标记为样品1)总RNA为阴性对照， 提取方法同上。反转录(RT)反应分别对每种病毒的总RNA进行反转录反应。用M-MLV反转录酶反转录合成各病毒 cDNA第一链25 u LRT反应体系如下2 y L总RNA，1 u L病毒特异下游引物(10 u mol/L)， 7iiLDEPC-H20，70°C变性 5min，迅速置冰上 5min ；再加入 5yL 5XRT buffer，5 ii LdNTP (各 2. 5mmol/L) ,0. 5u LRNase 抑制剂(40U/ ii L)禾口 1 ii L M-MLV 反转录酶(200U/ u L)，短暂离 心后，42°C水浴lh，95°C灭活5min，置冰上待用，获得5种病毒的cDNA。PCR 反应分别对每种病毒的cDNA进行PCR反应。25 u LPCR标准反应体系14. 4 ii LddH20， 2. 4u L 10 XPCR buffer [750mmol/LTris-HCl (pH8. 8), 200mmol/L, (NH4)2S04,0. 1% Tween 20], 2 u L25mmol/L, MgCl2，2 u LdNTP (各 2. 5m mol/L) ,luL 上游和下游引物混合物(各 10iimol/L)，0. 2iiLTaqDNA 聚合酶(5U/ii L)禾口 2 ii LcDNA 模板。PCR 反应循环参数94°C 预变性3min ；94°C变性30s，48°C退火30s，72°C延伸lmin，循环30次；72°C终止补偿延伸 lOmin。取5 u LPCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析比较。电泳检测取5 ii L PCR反应产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，在0. 5XTAE缓冲液环境中，110V 稳压电泳40min，然后用凝胶成像系统观察并记录结果，分别得到5条特异性条带，得到每 种病毒的扩增引物条带位置，参见说明书附图中的图1。实施例2 多重RT-PCR病毒总RNA的提取分别采取6 个样品健康烟草，TMV、TMV+CMV、TMV+CMV+TEV、TMV+CMV+TEV+PVY、 TMV+CMV+TEV+PVY+TVBMV感染的烟草叶各0. 1克，6个样品标号为样品A、样品B、样品C、样
品D、样品E、样品Fo分别将样品置于于-80°C深冻研钵中，加液氮充分研磨，迅速转入到无RNase的无 菌 1. 5mL 印pendof■管中，力口入 lmL BIOzol Extraction Reagent 混勾，放置 15min。力口入 0. 2mL氯仿和0. 3ml苯酚溶液上下倒置混勻，4°C 12000Xg离心15min。取上清液转入新 印pendof管中，加入与上清液等体积的异丙醇，振荡混勻，-20°C放置30min。4°C 12000Xg 离心15min，弃上清液。用lmL 75%乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀，4°C 12000 X g离心5min，弃上清液，自然干燥。加入30PL DEPC水溶解沉淀。-80°C保存备用，获得6个样品总RNA。反转录(RT)反应分别对每个样品的总RNA进行反转录反应。用M-MLV反转录酶反转录合成各病毒 cDNA第一链25 u LRT反应体系如下2 y L总RNA，1 u L病毒特异下游引物(10 u mol/L)， 7iiLDEPC-H20，70°C变性 5min，迅速置冰上 5min ；再加入 5yL 5XRT buffer，5 ii LdNTP (各 2. 5mmol/L) ,0. 5u LRNase 抑制剂(40U/ ii L)禾口 1 ii L M-MLV 反转录酶(200U/ u L)，短暂离 心后，42°C水浴lh，95°C灭活5min，置冰上待用，获得5个样品的cDNA。PCR 反应分别对每个样品的cDNA进行PCR反应。25 u LPCR标准反应体系14. 4 ii LddH20， 2. 3u L10XPCR buffer [750mmol/LTris-HCl (pH8. 8), 200mmol/L, (NH4)2S04,0. 1 % Tween 20] ,2. 4u LMgCl2 (25mmol/L), 2. 8 u LdNTP (各 2. 5mmol/L)，1 P L 引物对混合物(其中各 引物对的比例为第1对引物第2对引物第3对引物第4对引物第5对引物= 1.4 1 1 1 1.5)(正向和反向序列的浓度均为10 ii mol/L)，0.5 iiLTaq DNA聚合 酶(5U/ ii L)和4 ii LcDNA模板。PCR反应循环参数94°C预变性3min ；94°C变性30s, 51°C 退火30s，72°C延伸lmin，循环35次；72°C终止补偿延伸lOmin。电泳检测取5 ii L PCR反应产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，在0. 5XTAE缓冲液环境中，110V 稳压电泳40min，然后用凝胶成像系统观察并记录结果，分别得到5个样品的特异性条带， 得到每个样品中病毒的扩增引物条带位置，参见说明书附图中的图2。割胶回收经多重RT-PCR扩增的TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV条带，与pMD18_T simple vector进行体外连接，挑取阳性克隆，提取质粒测序。测序结果表明，TMV、CMV、 TEV、PVY和TVBMV的扩增产物分别由237、273、347、456和547个核苷酸组成，与设计的PCR 产物大小相同，都为外壳蛋白基因的部分序列，序列同源性分析结果表明所得序列与参考 序列的同源率分别达到98. 60%,99. 20%, 100%,99. 00%和100%，保守区同源率都达到 100%，证明了多重RT-PCR检测结果的可靠性。本发明的方法已经通过具体的实施例进行了描述。本领域技术人员可以借鉴本发 明的内容适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离 本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为 包括在本发明的范围之内。
权利要求
一种同步检测多种烟草病毒的试剂盒，该试剂盒由组分I和组分II组成；组分I和组分II中的各试剂单独分装，组分I包含反转录酶、RNA酶抑制剂，dNTP混合物，反向引物序列组，反转录反应缓冲液；组分II包含PCR反应缓冲液，dNTP混合物，MgCl2，Taq DNA聚合酶，PCR引物组，其特征在于反向引物序列组包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8和SEQ ID NO10；PCR引物组包含5对引物SEQ ID NO1-10，序列信息如下第1对引物正向序列SEQ ID NO.15′-TAGACCCGCTAGTCACAG-3′反向序列SEQ ID NO.25′-CAGAGGTCCAAACCAAAC-3′第2对引物正向序列SEQ ID NO.35′-GTGGGTGACAGTTCGTAAA-3′反向序列SEQ ID NO.45′-GTGGGAATGCGTTGGT-3′第3对引物正向序列SEQ ID NO.55′-TGATGGATGGTGAGGAG-3′反向序列SEQ ID NO.65′-GTGCCGTTCAGTGTCTT-3′第4对引物正向序列SEQ ID NO.75′-CCGAGAATCAAGGCTATC-3′反向序列SEQ ID NO.85′-CGCTAAACCTACATCCC-3′第5对引物正向序列SEQ ID NO.95′-GAGGTCGTGAACTTACAGC-3′反向序列SEQ ID NO.105′-GAGGTCGTGAACTTACAGC-3′。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中烟草病毒选自烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病 毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、烟草蚀纹病毒(TEV)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中PCR引物组中5对引物浓度比例为第1对引物 第2对引物第3对引物第4对引物第5对引物=1. 2-1. 6 0. 8-1. 2 0. 8-1. 2 0. 8-1. 2 1. 3-1. 7。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中PCR引物组中5对引物浓度比例为第1对引物 第2对引物第3对引物第4对引物第5对引物=1.4 1 1 1 1.5。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中组分II中dNTP浓度为0.12-0. 32mmol/L ；Taq DNA 聚合酶浓度为 0. 02-0. 12U/ u L ；MgCl2 浓度为 1. 2-3. 2mmol/L。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中dNTPs浓度为0.28mmol/L, Taq DNA聚合酶浓 度为 0. 10U/ u L, MgCl2 浓度为 2. 4mmol/Lo
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其中组分I中，反转录酶为M-MLV反转录酶。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其中组分I的组成如下 各 2. 5mmol/L 的 dNTP5 u L10iimol/L的反向引物序列组 liiL 5XRT buffer5 u L40U/ ii L 的 RNase 抑制剂0. 5 ii L200U/ ii L 的 M-MLV 反转录酶 1 y LDEPC-H207 iiL。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其中组分II的组成如下 各 2. 5m mol/L 的 dNTP 混合物 2 ii L25mmol/L 的 MgCl22 u L5U/ ii L 的 TaqDNA 聚合酶0. 2 ii LPCR引物组liiL10XPCR反应缓冲液 2. 4iiL ddH2014. 4u L其中PCR引物组中5对引物浓度比例为第1对引物第2对引物第3对引物第 4对引物第5对引物=1.4 1 1 1 1. 5，PCR反应缓冲液为pH8. 8的750mmol/L Tris-HCl, 200mmol/L (NH4) 2S04,0. 1% Tween 20。
10.一种同步检测多种烟草病毒的引物组，该引物组包含5对引物SEQ IDN0:1-10。
全文摘要
本发明涉及一种同步检测多种烟草病毒的引物组和试剂盒，该试剂盒由组分I和组分II组成，组分I和组分II中的各试剂单独分装，组分I包含反转录酶、RNA酶抑制剂，dNTP混合物，反向引物序列组，反转录反应缓冲液；组分II包含PCR反应缓冲液，dNTP混合物，MgCl2，Taq DNA聚合酶，PCR引物组，其特征在于反向引物序列组包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8和SEQ ID NO10；PCR引物组包含SEQ ID NO1-10。
文档编号C12Q1/70GK101875981SQ201010232748
公开日2010年11月3日 申请日期2010年7月21日 优先权日2010年7月21日
发明者吴云锋, 成巨龙 申请人:陕西省烟草研究所;西北农林科技大学