一种用于SCID遗传病筛查的引物、检测试剂盒及检测方法与流程

本发明属于新生儿遗传病基因筛查领域，具体涉及一种用于scid遗传病筛查的引物、检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
：重症联合免疫缺陷病(severecombinedimmunodeficiencydisease，scid)是由多种遗传因素引起的t淋巴细胞、b淋巴细胞、nk细胞数量缺乏和/或功能障碍，导致体液免疫、细胞免疫同时存在严重缺陷，这种原发性免疫缺陷常被定义为初始t细胞缺乏。scid的发生率约为1/10万活产新生儿，但因为scid患儿常在明确诊断前死亡，该数字可能被严重低估，不经治疗，scid的病死率为100％。95％患儿为男孩，多呈性连锁隐性遗传，偶有常染色体隐性遗传及散发病例。临床表现为患儿在出生最初数月发生一次或反复感染，严重威胁患儿生命和生活质量。chan和puck在2005年首先报道了采用定量pcr方法检测t细胞受体切除环(t－cellreceptorexcisioncircles,trecs)。trec是在胸腺发育成熟过程中，编码t细胞受体的基因进行重组，重组过程中生成了小片段的游离环状dna。t细胞分裂过程中trecs不复制，因此可作为判断胸腺输出初始t淋巴细胞功能的可靠指标。若trecs减少或缺失，则高度怀疑scid，进一步行流式细胞及基因诊断确诊。scid常用的治疗方法为造血干细胞移植，基因治疗在某些类型scid(如ada基因突变导致的腺苷脱氨酶缺陷)中也有成功应用。研究显示，在3.5月龄前接受hsct生存率为94％，而3.5月龄发生慢性腹泻、严重感染后进行hsct生存率仅为69％。如果出生时未能及时筛查出scid，患儿将面临反复感染，生存质量下降；另外，感染后的干细胞移植需要调整用药，降低移植成功率，说明早期诊断、早期治疗可以明显提高生存率，降低病死率。然而，由于scid患者在发生感染前缺少临床症状，如何在感染前早期识别成为关键。目前，美国等发达国家和我国台湾地区已经开展了新生儿scid筛查工作，美国疾病控制与预防中心也将此项目纳入了新生儿疾病筛查室间质量评价体系，但是国内scid新生儿筛查和相应基因诊断检测工作还在初步阶段。现国内尚未有开展新生儿人群大样本scid筛查的报道，也未建立明确的新生儿scid筛查技术体系，因此，建立快速、高效、敏感的scid筛查技术体系具有非常重要的意义。技术实现要素：针对现有技术中的技术空白，本发明的目的是提供一种用于scid遗传病筛查的引物、检测试剂盒及检测方法，基于荧光定量pcr技术，采用chelex100法处理干血片直接扩增的方法定性检测t细胞受体删除环，建立快速、高效、敏感的scid筛查技术体系。该方法操作方便，成本低廉，易于推广。本发明是通过以下技术方案实现的：本发明的第一目的在于提出用于scid遗传病筛查的引物，包括trec基因扩增的上、下游引物和探针，内参cα基因扩增的上、下游引物和探针，外控cα基因扩增的上、下游引物和探针；所述trec基因扩增的上、下游引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示，所述trec基因探针序列如seqidno.3所示；所述内参cα基因扩增的上、下游引物序列如seqidno.4和seqidno.5所示，所述内参cα基因探针序列如seqidno.6所示；所述外控cα基因扩增的上、下游引物序列如seqidno.4和seqidno.5所示，所述外控cα基因探针序列如seqidno.7所示。本发明的第二目的在于提出一种用于scid遗传病筛查的基因检测试剂盒，所述试剂盒包括dna提取液，trec基因扩增的上、下游引物和探针，内参cα基因扩增的上、下游引物和探针，外控cα基因扩增的上、下游引物和探针；所述trec基因扩增的上、下游引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示，所述trec基因探针序列如seqidno.3所示；所述内参cα基因扩增的上、下游引物序列如seqidno.4和seqidno.5所示，所述内参cα基因探针序列如seqidno.6所示；所述外控cα基因扩增的上、下游引物序列如seqidno.4和seqidno.5所示，所述外控cα基因探针序列如seqidno.7所示。进一步地，所述试剂盒还包括pcrmix反应液和去离子水。进一步地，所述pcrmix反应液包括taqdna聚合酶、buffer、dntps和mgcl2；所述taqdna聚合酶的浓度为0.2～2u/reaction；所述dntps包括datp、dgtp、dctp、dttp，它们的浓度均为2.5mm；所述mgcl2的浓度为250mm。进一步地，所述taqdna聚合酶为化学修饰热启动taq酶，浓度为5u/μl。本发明的第三个目的在于提出一种scid遗传病筛查方法，包括如下步骤：(1)配制两组pcr反应液，包括trec检测液和外控检测液；所述trec检测液包括pcrmix反应液，去离子水，trec基因扩增的上、下游引物和探针，内参cα基因扩增的上、下游引物和探针；所述外控cα检测液包括pcrmix反应液，去离子水，外控基因扩增的上、下游引物和探针；所述trec基因扩增的上、下游引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示，所述trec基因探针序列如seqidno.3所示；所述内参cα基因扩增的上、下游引物序列如seqidno.4和seqidno.5所示，所述内参cα基因探针序列如seqidno.6所示；所述外控cα基因扩增的上、下游引物序列如seqidno.4和seqidno.5所示，所述外控cα基因探针序列如seqidno.7所示；(2)提取样本基因组dna；(3)采用步骤(1)中的两组pcr反应液对所述步骤(2)中得到的模板dna分别进行pcr扩增，得到两组pcr扩增产物；(4)对步骤(4)中得到的两组pcr扩增产物进行分析，根据待检测的样本基因组dna中的靶标扩增ct值来判断患儿患scid的可能性。进一步地，提取样本基因组dna的具体方法为：(1)使用打孔器从血卡上打片血卡放入1.5mlep管；(2)向装有血卡的ep管中加入1000μlddh2o，涡旋震荡后静置15min，12000rpm离心2min，弃上清；(3)向步骤(2)ep管中加入200μl5％chelex100溶液，震荡离心后放56℃孵育30min，拿出震荡1min后离心，放100℃处理8min，拿出剧烈震荡后12000rpm离心2min，拿出放4℃备用。进一步地，所述步骤(1)中pcrmix反应液包括taqdna聚合酶、buffer、dntps和mgcl2；所述taqdna聚合酶为化学修饰热启动taq酶，浓度为5u/μl；所述dntps包括datp、dgtp、dctp、dttp，它们的浓度均为2.5mm；所述mgcl2的浓度为250mm。进一步地，trec检测液的总体积为12.5μl(2×mix)，扩增体系包括5μl5×buffer(trisph8.0，kcl)，0.25μlmgcl2，2μldntpmix(10mm)，1μltrec基因扩增上游引物seqidno1，1μltrec基因扩增下游引物seqidno2，0.5μltrec基因探针seqidno3，0.125μl内参cα基因扩增上游引物seqidno4，0.125μl内参cα基因扩增下游引物seqidno5，0.25μl内参cα基因探针seqidno6，0.2μl化学修饰热启动taq酶和2.05μl去离子水。进一步地，外控检测液的总体积为12.5μl(2×mix)，扩增体系包括5μl5×buffer(trisph8.0，kcl)，0.25μlmgcl2，2μldntpmix(10mm)，1μl外控cα基因扩增上游引物seqidno4，1μl外控cα基因扩增下游引物seqidno5，0.5μl外控cα基因探针seqidno7，0.2μl化学修饰热启动taq酶和2.05μl去离子水。与现有技术相比，本发明的优点和有益效果如下：(1)本发明的技术方案基于荧光定量pcr技术，通过设计特异性高的靶标引物、内参引物和外控引物，再配置成使用方便、检测结果可靠的试剂盒，设计出科学合理的pcr反应体系；采用chelex100法处理干血片直接扩增的方法定性检测t细胞受体删除环，建立快速、高效、敏感的scid筛查技术体系。使得本发明用于新生儿scid遗传病谱筛准确性高，特异性强，快速，简便，性价比高，特别适合在临床检验工作中普及应用。(2)本发明的试剂盒及检测方法设置了外控对照，能有效评估本次pcr扩增体系建立是否合理性，同时在检测反应液中添加了内参cα基因引物，通过内参基因的扩增能有效避免假阳性结果的出现，从而保证数据的可靠性，最终确保试剂盒检测结果准确无误。(3)本发明的检测方法中样本获取、储存方便，dna提取简单，用血量很少，非常适合不宜大量取血的新生儿筛查。同时，血卡样本性质稳定利于较长时间的运输以及长期保存，极大地减少了样本在获取、储存及运输诸环节中问题的出现，为最后检查结果的准确性及稳定性奠定了良好基础。附图说明图1为实施例3中sy01709088样本扩增曲线。图2为实施例3中sy01801001样本扩增曲线。图3为实施例3中sy01803012样本扩增曲线。图4为实施例3中sy01806056样本扩增曲线。具体实施方式下面申请人结合具体实施例对本发明技术方案做进一步详细说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为本发明请求保护范围的限定。实施例1：用于scid遗传病筛查的的特异性引物、基因检测试剂盒一、引物与探针的设计与合成该：根据ucsc网站上ucschumangenesorter查询trecs和内参cα基因序列(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgnear)，利用primer3.0在trecs和cα基因上设计荧光定量pcr上下游引物和探针。所选引物对于基因的结合有很好的特异性，有较高的pcr扩增效率。trecs探针的5’端为fam荧光基团，3’端为tamra荧光基团；cα基因探针的5’端为vic荧光基团，3’端为tamra荧光基团。同时，本发明还设置了外控对照的引物和探针。引物序列如下所示。trecs靶标扩增上游引物seqidno.1：5`-gtttttgtaaaggtgcccactcc-3`trecs靶标扩增下游引物seqidno.2：5`-acggtgaatgaagagcagacag-3`trecs靶标探针seqidno.3：5`-fam-cacctgcaccccgtgcctaaacc-tamra-3`内参cα扩增上游引物seqidno.4：5`-aaatgagatcatgtcctaaccctg-3`内参cα扩增下游引物seqidno.5：5`-tggatttagagtctctcagctggt-3`内参cα探针seqidno.6：5`-vic-acagatatccagaaccctgaccctgcc-tamra-3`外控cα扩增上游引物seqidno.45`-aaatgagatcatgtcctaaccctg-3`外控cα扩增下游引物seqidno.55`-tggatttagagtctctcagctggt-3`外控cα特异性探针seqidno7：5`-fam-acagatatccagaaccctgaccctgcc-tamra-3`二、配制两组pcr反应液本实施例中pcr反应液包括trec检测液和外控检测液。1、trec检测液包括pcrmix反应液，去离子水，trec基因扩增的上、下游引物和探针，cα基因扩增的上、下游引物和探针trec检测液体系的总体积为12.5μl(2×mix)，扩增体系的组分、浓度或含量如下：trec检测液：其中扩增引物、探针混合液包括1μltrec基因扩增上游引物seqidno1，1μltrec基因扩增下游引物seqidno2，0.5μltrec基因探针seqidno3，0.125μlcα基因扩增上游引物seqidno4，0.125μlcα基因扩增下游引物seqidno5，0.25μlcα基因探针seqidno6。2、外控检测液包括pcrmix反应液，去离子水，外控基因扩增的上、下游引物和探针。外控检测液体系的总体积为12.5μl(2×mix)，扩增体系的组分、浓度或含量如下：外控检测液：其中扩增引物、探针混合液包括1μl外控基因扩增上游引物seqidno4，1μl外控基因扩增下游引物seqidno5，0.5μl外控基因探针seqidno7。实施例2：实施例1中试剂盒的使用1、提取样本基因组dna(1)使用孔径3.0mm打孔器从血卡上打3片血卡放入1.5mlep管。(2)向上述装有血卡的ep管中加入1000μlddh2o，涡旋震荡后静置15min，12000rpm离心2min，弃上清，若血片颜色依然很深，可重复洗涤一次。(3)向上述ep管中加入200μl5％chelex100(sigma)溶液，震荡离心后放56℃孵育30min，拿出震荡1min后离心，放100℃处理8min，拿出剧烈震荡后12000rpm离心2min，拿出放4℃备用。2、pcr扩增采用实施例1中的两组pcr反应液对所述步骤1中得到的模板dna分别进行pcr扩增，得到两组pcr扩增产物。荧光检测通道选择fam，tamra检测通道。pcr程序为：95℃10min，(95℃15s，60℃40s)×45cycles，60℃同时收集2种荧光信号。3、实时荧光pcr检测对步骤2中得到的两组pcr扩增产物进行分析，根据待检测的样本基因组dna中的靶标扩增ct值来判断患儿患scid的可能性。实施例3：样本检测1、选取临床上已知诊断结果的4例婴幼儿干血片，提取样本dna，操作如下：(1)使用孔径3.0mm打孔器从4例干血片上各打3片血卡放入4支对应的1.5mlep管内。(2)向上述装有血卡的ep管中加入1000μlddh2o，涡旋震荡后静置15min，12000rpm离心2min，弃上清，若血卡颜色依然很深，可重复洗涤一次。(3)向上述各ep管中加入200μl5％chelex100(sigma)溶液，震荡离心后放56℃孵育30min，拿出震荡1min后离心，放100℃处理8min，拿出剧烈震荡后12000rpm离心2min，拿出放4℃备用。表1样本信息受检者编号年龄性别临床诊断sy017090888个月男正常sy018010014个月男scidsy018030125个月男正常sy018060563个月女正常2、pcr检测从-20℃冰箱拿出已制备好的两种检测液预混mix(2×)，放室温溶解，等待完全溶解后轻微颠倒混匀离心，每种模板同时用两种检测液分别检测，两种检测液各配制16个反应mix，每孔分装23μlmix，然后分别加入4种已制备好的模板上清液各2μl，每种模板重复3孔，ntc孔加入2μlddh2o。反应体系配制如下：表2反应体系热循环条件：95℃10min，(95℃15s，60℃40s)×45cycles，60℃同时收集2种荧光信号3、扩增结果分析检测结果判读标准：(1)ntc靶标检测液fam通道及tamra通道均无扩增ct值或无s形曲线；ntc外控检测液fam通道亦无扩增ct值或无s形曲线。(2)样本外控检测液ct值≤28，则样本模板量满足要求，可进一步分析；样本外控检测液ct值＞30，则样本模板量不足应重新处理样本；样本外控检测液ct值28＜ct值≤30，只有trec含量高的样本可以检出。(3)样本内控ct值满足ct值≤36，有正常s形扩增曲线。满足以上条件时，根据样本靶标扩增ct值判断患儿患scid的可能性。表3备注：△ct＝cttrec-ct外控(4)4个待测样本的扩增曲线如图1、图2、图3、图4所示，扩增曲线导出ct值结果如表4所示：表4samplecttrecct外控cttrec-ct外控结果判定sy0170908836.4327.788.65正常sy01801001-27.13-异常sy0180301233.9728.015.96正常sy0180605633.1627.086.08正常因此，本实施例中通过该荧光pcr检测试剂盒扩增trec曲线及结果判定标准得出的样本结果信息和待测样本已知结果一致。本检测试剂盒仅用于scid筛查用，意在说明新生儿患scid的可能性，不能作为最终临床诊断结果。结果正常说明受检者患scid的可能性不大，结果异常说明患scid的可能性比较大，需进一步作流式细胞及基因诊断确诊。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。序列表<110>良培基因生物科技（武汉）有限公司<120>一种用于scid遗传病筛查的引物、检测试剂盒及检测方法<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gtttttgtaaaggtgcccactcc23<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2acggtgaatgaagagcagacag22<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cacctgcaccccgtgcctaaacc23<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4aaatgagatcatgtcctaaccctg24<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tggatttagagtctctcagctggt24<210>6<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6acagatatccagaaccctgaccctgcc27<210>7<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7acagatatccagaaccctgaccctgcc27当前第1页12