一种检测CYP2C19基因多态性的方法及试剂盒与流程

本发明属于生物技术和检测领域，具体地说，本发明涉及一种检测cyp2c19基因多态性的方法及试剂盒

背景技术：

细胞色素p450(cytochromep450，简称为cyp450)为一类亚铁血红素-硫醇盐蛋白的超家族,它参与内源性物质和包括药物环境化合物在内的外源性物质的代谢。而cyp2c19是cyp450家族中最重要的药物代谢酶之一，其遗传多态性影响着氯吡格雷、奥美拉唑、苯妥英钠和地西泮等许多药物的代谢。cyp2c19基因定位于人10号染色体q24.1－24.3区带上，野生型为cyp2c19*1/*1型。中国人群中常有基因突变，常见突变类型是cyp2c19*2型(第5外显子g681a)和cyp2c19*3型(第4外显子g636a)。2006年sim等发现了一种新的cyp2c19等位基因cyp2c19*17，带有的突变位点是:c806t，cyp2c19*17等位基因在人群中也有较高的频率出现。

cyp2c19基因多态性主要由两类突变引起：一类是降低酶活性的突变，如cyp2c19*2、cyp2c19*3(具体突变可参考文献tantryus,blidenkp,weic,etal.firstanalysisoftherelationbetweencyp2c19genotypeandpharmacodynamicsinpatientstreatedwithticagrelorversusclopidogrel:theonset/offsetandrespondgenotypestudies.circulation:cardiovasculargenetics,2010,3(6):556-566.)；另一类是增强酶活性的突变，目前仅发现有cyp2c19*17(具体突变可参考文献frerec,cuissett,gaboritb,etal.thecyp2c19*17alleleisassoci-atedwithbetterplateletresponsetoclopidogrelinpatientsadmittedfornon-stacutecoronarysyndrome.jthrombhaemost,2009,7(8):1409-1411.)。cyp2c19遗传变异可导致酶活性的个体差异，可分为快代谢型(extensivemetabolizer,em)、中间代谢(intermediarymetabolizer,im)和慢代谢型(poormetabolizer,pm)。慢代谢型个体携带两个降低cyp2c19酶活性的突变位点，如cyp2c19*2/*2、cyp2c19*3/*3；快代谢型者则携带两个增强酶活性的突变位点，如cyp2c19*17/*17；中间代谢型者只携带一个降低或增强酶活性的突变位点，cyp2c19*1/*2、cyp2c19*1/*3、cyp2c19*1/*17。cyp2c19*2型和cyp2c19*3型可引起cyp2c19基因编码的酶活性丧失，代谢底物的能力减弱，使血药浓度增高，在常规治疗剂量时易引起蓄积中毒。中国人群中的弱代谢者99％为cyp2c19*2型和cyp2c19*3型等位基因，cyp2c19*17型则引起cyp2c19基因编码的酶活性增强，代谢底物的能力增强，因此需要增加药物剂量。

氯吡格雷是目前临床常用血小板受体p2y12抑制剂，属噻吩并吡啶类无活性前体药物，其经肝脏细胞色素酶p450系统代谢后，转化为活性产物，通过阻断二磷酸腺苷(adp)受体抑制血小板聚集，进而阻止病理性血栓形成。氯吡格雷在临床被广泛应用于急性冠状动脉综合征(acutecoronarysyndrome，acs)和经皮冠状动脉支架植入术(percutaneouscoronarystentimplantation，pci)后患者，可显著降低acs非血运重建患者的病死率及其他心血管事件发生率。氯吡格雷代谢相关基因多态性是抗血小板药物个体化差异的重要内在因素，尤其是cyp2c19功能缺失基因(lossoffunctionlof)的多态性。在植入支架后使用氯吡格雷的心血管疾病患者中，cyp2c19*2、*3基因携带者比cyp2c19*1基因携带者更易发生支架后血栓，但心血管事件和出血事件发生率相当。而服用氯吡格雷治疗的cyp2c19*17基因突变心血管疾病患者，其心血管事件发生风险相对较低，但出血性事件发生风险相对较高。接受常规剂量的氯吡格雷治疗的患者中，约4％-30％出现药物效应低下，此类事件被认为是氯吡格雷的反应性减低或无反应性，这种现象称之为氯吡格雷抵抗(clopidogrelresistance,cr)。相关研究表明,冠心病患者中cyp2c19*2、*3基因携带者更容易发生氯吡格雷抵抗。根据美国fda的要求，患者使用氯吡格雷等临床应用药物前，建议检测cyp2c19基因多态性，以确保用药安全。

目前常用的检测cyp2c19基因多态性的方法有：

(1)pcr-直接测序法，是检测基因点突变的金标准，该方法属于定性检测，优点是直接获取序列，可发现新的变异位点，但灵敏度不高，操作复杂，成本相对较高，速度慢、通量低。

(2)pcr-高分辨率熔解曲线(hrm)法，该方法操作简便、快速、通量大、使用成本低，但对仪器的灵敏度和分辨率有较高要求。

(3)pcr-基因芯片法，该方法通量高，可同时对多个待测snp位点进行检测，但成本高，需要特殊仪器和设备。

(4)实时荧光pcr法，通量较高，操作简单，仪器设备易普及，但探针较昂贵。

(5)pcr-限制性片段长度多态性方法，无需特殊的仪器设备，成本较低，实验过程简单，可操作性强，但通量低，只适用于部分snp分型。

(6)arms-pcr法，该方法可以用于检测各种类型的snp，其优势是灵敏度高，特别适合于对肿瘤组织中的体细胞突变进行检测；缺点是可能出现假阳性。

因此，本领域迫切需要开发高特异性、高灵敏度、高通量、操作简单的检测cyp2c19基因多态性的技术。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测cyp2c19基因多态性的方法及试剂盒。

在本发明的第一方面，提供了一种检测cyp2c19基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括：第一组分，所述第一组分包括靶向cyp2c19*2基因的引物对和靶向cyp2c19*2基因的探针；其中，所述靶向cyp2c19*2基因的引物对包括seqidno.:1所示的正向引物，所述靶向cyp2c19*2基因的探针包括seqidno.:2所示的共用探针。

在另一优选例中，所述靶向cyp2c19*2基因的引物对还包括：seqidno.:3所示的野生型arms反向引物。

在另一优选例中，所述靶向cyp2c19*2基因的引物对还包括：seqidno.:4所示的突变型arms反向引物。

在另一优选例中，所述第一组分还包括靶向cyp2c19*2基因的seqidno.:5所示的野生型pcr扩增阻断剂。

在另一优选例中，所述第一组分还包括靶向cyp2c19*2基因的seqidno.:6所示的突变型pcr扩增阻断剂。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括：第二组分，所述第二组分包括靶向cyp2c19*3基因的引物对和靶向cyp2c19*3基因的探针；其中，所述靶向cyp2c19*3基因的引物对包括seqidno.:7所示的正向引物，所述靶向cyp2c19*3基因的探针包括seqidno.:8所示的共用探针。

在另一优选例中，所述靶向cyp2c19*3基因的引物对还包括：seqidno.:9所示的野生型arms反向引物。

在另一优选例中，所述靶向cyp2c19*3基因的引物对还包括：seqidno.:10所示的突变型arms反向引物。

在另一优选例中，所述第一组分还包括靶向cyp2c19*3基因的seqidno.:11所示的野生型pcr扩增阻断剂。

在另一优选例中，所述第一组分还包括靶向cyp2c19*3基因的seqidno.:12所示的突变型pcr扩增阻断剂。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括：第三组分，所述第三组分包括靶向cyp2c19*17基因的引物对和靶向cyp2c19*17基因的探针；其中，所述靶向cyp2c19*17基因的引物对包括seqidno.:13所示的正向引物，所述靶向cyp2c19*17基因的探针包括seqidno.:14所示的共用探针。

在另一优选例中，所述靶向cyp2c19*17基因的引物对还包括：seqidno.:15所示的野生型arms反向引物。

在另一优选例中，所述靶向cyp2c19*17基因的引物对还包括：seqidno.:16所示的突变型arms反向引物。

在另一优选例中，所述第一组分还包括靶向cyp2c19*17基因的seqidno.:17所示的野生型pcr扩增阻断剂。

在另一优选例中，所述第一组分还包括靶向cyp2c19*17基因的seqidno.:18所示的突变型pcr扩增阻断剂。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括内标引物对和内标探针。

在另一优选例中，所述内标引物对包括seqidno.:19所示的内标正向引物和seqidno.:20的内标反向引物。

在另一优选例中，所述内标探针如seqidno.:21所示。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括热启动taq酶、ung酶、和dutps。

在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含：

靶向cyp2c19*2基因的seqidno.:1所示的正向引物、靶向cyp2c19*2基因的seqidno.:2所示的共用探针、靶向cyp2c19*2基因的seqidno.:3所示的野生型arms反向引物、靶向cyp2c19*2基因的seqidno.:6所示的突变型pcr扩增阻断剂；和/或

靶向cyp2c19*3基因的seqidno.:7所示的正向引物、靶向cyp2c19*3基因的seqidno.:8所示的共用探针、靶向cyp2c19*3基因的seqidno.:9所示的野生型arms反向引物、靶向cyp2c19*3基因的seqidno.:12所示的突变型pcr扩增阻断剂；和/或

靶向cyp2c19*17基因的seqidno.:13所示的正向引物、靶向cyp2c19*17基因的seqidno.:14所示的共用探针、靶向cyp2c19*17基因的seqidno.:15所示的野生型arms反向引物、靶向cyp2c19*17基因的seqidno.:18所示的突变型pcr扩增阻断剂。

在另一优选例中，所述第一容器内还包含内标引物和内标探针；优选地，所述内标引物包括seqidno.:19所示的正向引物，和seqidno.:20所示的反向引物；优选地，所述内标探针如seqidno.:21所示。

在另一优选例中，所述试剂盒包括第二容器，所述第二容器内包含：

靶向cyp2c19*2基因的seqidno.:1所示的正向引物、靶向cyp2c19*2基因的seqidno.:2所示的共用探针、靶向cyp2c19*2基因的seqidno.:4所示的突变型arms反向引物、靶向cyp2c19*2基因的seqidno.:5所示的野生型pcr扩增阻断剂；和/或

靶向cyp2c19*3基因的seqidno.:7所示的正向引物、靶向cyp2c19*3基因的seqidno.:8所示的共用探针、靶向cyp2c19*3基因的seqidno.:10所示的突变型arms反向引物、靶向cyp2c19*3基因的seqidno.:11所示的野生型pcr扩增阻断剂；和/或

靶向cyp2c19*17基因的seqidno.:13所示的正向引物、靶向cyp2c19*17基因的seqidno.:14所示的共用探针、靶向cyp2c19*17基因的seqidno.:16所示的突变型arms反向引物、靶向cyp2c19*17基因的seqidno.:17所示的野生型pcr扩增阻断剂。

在另一优选例中，所述第二容器内还包含内标引物和内标探针；优选地，所述内标引物包括seqidno.:19所示的正向引物，和seqidno.:20所示的反向引物；优选地，所述内标探针如seqidno.:21所示。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含：热启动taq酶、ung酶、和/或dutps。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阳性对照；优选地，所述阳性对照为含有cyp2c19*2、cyp2c19*3、cyp2c19*17这3种等位基因的杂合型dna。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第五容器，所述第五容器内包含阴性对照；优选地，所述阴性对照为纯水。

在另一优选例中，各探针分别带有荧光报告基团和荧光淬灭基团；优选地，各探针分别带有不同的荧光报告基团和不同的荧光淬灭基团。优选地，靶向cyp2c19*2基因的共用探针具有fam荧光报告基团和bhq1荧光淬灭基团。优选地，靶向cyp2c19*3基因的共用探针具有vic荧光报告基团和bhq2荧光淬灭基团。优选地，靶向cyp2c19*17基因的共用探针具有texasred荧光报告基团和tamra荧光淬灭基团。

本发明的第二方面，提供了一种检测cyp2c19基因多态性的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提供待检测对象的dna样本；

(2)制备荧光定量pcr反应体系并进行荧光定量pcr检测：

其中，所述荧光定量pcr反应体系包括第一荧光定量pcr反应体系、和第二荧光定量pcr反应体系；

所述第一荧光定量pcr反应体系包括：

靶向cyp2c19*2基因的seqidno.:1所示的正向引物、靶向cyp2c19*2基因的seqidno.:2所示的共用探针、靶向cyp2c19*2基因的seqidno.:3所示的野生型arms反向引物、靶向cyp2c19*2基因的seqidno.:6所示的突变型pcr扩增阻断剂；和/或

靶向cyp2c19*3基因的seqidno.:7所示的正向引物、靶向cyp2c19*3基因的seqidno.:8所示的共用探针、靶向cyp2c19*3基因的seqidno.:9所示的野生型arms反向引物、靶向cyp2c19*3基因的seqidno.:12所示的突变型pcr扩增阻断剂；和/或

靶向cyp2c19*17基因的seqidno.:13所示的正向引物、靶向cyp2c19*17基因的seqidno.:14所示的共用探针、靶向cyp2c19*17基因的seqidno.:15所示的野生型arms反向引物、靶向cyp2c19*17基因的seqidno.:18所示的突变型pcr扩增阻断剂；

所述第二荧光定量pcr反应体系包括：

靶向cyp2c19*2基因的seqidno.:1所示的正向引物、靶向cyp2c19*2基因的seqidno.:2所示的共用探针、靶向cyp2c19*2基因的seqidno.:4所示的突变型arms反向引物、靶向cyp2c19*2基因的seqidno.:5所示的野生型pcr扩增阻断剂；和/或

靶向cyp2c19*3基因的seqidno.:7所示的正向引物、靶向cyp2c19*3基因的seqidno.:8所示的共用探针、靶向cyp2c19*3基因的seqidno.:10所示的突变型arms反向引物、靶向cyp2c19*3基因的seqidno.:11所示的野生型pcr扩增阻断剂；和/或

靶向cyp2c19*17基因的seqidno.:13所示的正向引物、靶向cyp2c19*17基因的seqidno.:14所示的共用探针、靶向cyp2c19*17基因的seqidno.:16所示的突变型arms反向引物、靶向cyp2c19*17基因的seqidno.:17所示的野生型pcr扩增阻断剂。

在另一优选例中，所述第一荧光定量pcr反应体系还包括：热启动taq酶、ung酶、和/或dutps。

在另一优选例中，所述第二荧光定量pcr反应体系还包括：热启动taq酶、ung酶、和/或dutps。

在另一优选例中，所述荧光定量pcr检测过程中，荧光定量pcr扩增条件为：

50℃2分钟，94℃5分钟；94℃15秒，58℃32秒，40个循环。

在另一优选例中，所述方法为非诊断目的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示cyp2c19*2-gg野生型7例中1例的检测结果。

图2显示cyp2c19*2-ag杂合型2例中1例的检测结果。

图3显示cyp2c19*2-aa突变型1例的检测结果。

图4显示cyp2c19*3-gg野生型6例中1例的检测结果。

图5显示cyp2c19*3-ag杂合型2例中1例的检测结果。

图6显示cyp2c19*3-aa突变型1例的检测结果。

图7显示cyp2c19*17-cc野生型9例中1例的检测结果。

图8显示cyp2c19*17-tc杂合型1例的检测结果。

图9显示cyp2c19*17-tt突变型1例的检测结果。

图10显示试剂盒阳性质控品的检测结果。

图11显示试剂盒阴性质控品的检测结果。

图12显示试剂盒以15例全血为模板的其中1例检测的结果。

图13显示试剂盒检测限为0.5ng/μl的其中1例检测结果。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种检测cyp2c19基因多态性的方法及试剂盒，两个扩增体系实现三个基因位点的多态性检测，具有检测快速、高通量、高灵敏度和降低成本的特点。

具体地，本发明采用arms-pcr法与加入pcr扩增阻断剂相结合，提供了一种高特异性、高灵敏度、高通量、操作简单的一种检测cyp2c19基因多态性的试剂盒。通过研发设计arms引物与pcr扩增阻断剂相结合，大大提高了特异性和准确性。因此，本发明提供了一种灵敏度高、特异性强的检测cyp2c19基因多态性的引物、探针，并提供了一种操作简单、结果准确、便于推广的检测cyp2c19基因多态性的试剂盒及方法。

本发明基于arms-pcr技术领域，同时加入pcr扩增阻断剂，特别涉及一种检测cyp2c19基因多态性的方法、引物、探针及包括该引物和探针混合的试剂盒。

本发明公开了一种检测cyp2c19基因多态性的方法、引物、探针及包括该引物和探针混合的试剂盒。提供了检测cyp2c19*2、cyp2c19*3和cyp2c19*17三个基因位点的引物及探针。本发明基于arms-pcr技术领域，两个扩增体系实现三个基因位点的多态性检测，具有检测快速、高通量、高灵敏度和降低成本的特点。此外，本发明通过加入pcr扩增阻断剂，保留了arms-pcr技术优点的同时大大提高了特异性，且可以直接用全血为模板扩增，免了dna提取繁琐的步骤，闭管操作，避免样本间交叉污染等优势。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

本发明基于arms-pcr与加入pcr扩增阻断剂相结合的技术领域，提供了一种检测cyp2c19基因多态性的方法、引物、探针及包括该引物和探针混合的试剂盒。本发明的检测cyp2c19基因多态性的方法，所需探针数量少，优化过程简单，简便快速，精准有效，且可以通过全血为模板进行快速检测。

在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了一种检测cyp2c19基因多态性的引物和探针，针对cyp2c19*2、cyp2c19*3和cyp2c19*17三个基因多态性位点，设计共用正向引物、共用的探针、野生型arms反向引物、突变型arms反向引物、野生型pcr扩增阻断剂和突变型pcr扩增阻断剂，具体核苷酸序列如下表。

表1cyp2c19*2基因检测的引物和探针序列情况表

表2cyp2c19*3基因检测的引物和探针序列情况表

表3cyp2c19*17基因检测的引物和探针序列情况表

对于上述检测cyp2c19基因多态性的引物和探针：

在本发明优选的实施方案中，针对不同的基因多态性位点，设计突变型和野生型的arms反向引物。

在本方面优选的实施方案中，突变型pcr扩增阻断剂在3’端进行c6spacer修饰，同时提高tm值在60～70℃，突变型pcr扩增阻断剂先与突变型模板结合，特异性阻断反向引物与突变型片段的结合，从而阻断突变型模板的扩增，探针不释放荧光信号，当检测野生型样本时，反向引物正常与野生型模板结合，扩增野生型目的片段，从而水解探针使其释放荧光信号，提高了野生型体系的特异性；相同地，野生型pcr扩增阻断剂在3’端进行c6spacer修饰，同时提高tm值在60～70℃，野生型pcr扩增阻断剂先与野生型模板结合，特异性阻断反向引物与野生型片段的结合，从而阻断野生型模板的扩增，探针不释放荧光信号，当检测突变型样本时，反向引物正常与突变型模板结合，扩增突变型目的片段，从而水解探针使其释放荧光信号，提高了突变型体系的特异性。

本方面所设计的引物tm值均在55℃附近，结合搭配的正向或反向引物，避免了引物二聚体的产生，同时选用mgb探针提高了tm值，使探针的tm值在65℃附近，避免了探针的序列过长与其他非特异性序列的结合，同时也避免了探针相互之间行成的引物二聚体以及发夹结构，有效地提高了pcr扩增的特异性和效率。

在本方面优选的实施方案中，该引物和探针的组合中，每条引物浓度均为0.1～0.5μmol/l，每条探针浓度均为0.1～0.25μmol/l。

在本发明进一步优选的实施方案中，为达到检测目的，所有基因位点的探针均带有荧光报告基团和荧光淬灭基团，所述的检测同一基因位点的野生型和突变型的荧光基团相同,所述的检测不同基因位点间所带的荧光基团不同，优选地，所述的cyp2c19*2基因位点荧光报告基团选自fam，荧光淬灭基团选自bhq1。优选地，所述的cyp2c19*3基因位点荧光报告基团选自vic，荧光淬灭基团选自bhq2。优选地，所述的cyp2c19*17基因位点荧光报告基团选自texasred，荧光淬灭基团选自tamra。

在本发明的另一个优选地实施方式中，本发明提供了一种检测cyp2c19基因多态性检测试剂盒，其包含上述的引物和探针。优选地，该试剂盒由cyp2c19野生型pcr反应液a、cyp2c19突变型pcr反应液a、cyp2c19pcr反应液b、cyp2c19阳性质控品、阴性质控品组成。

在本方面优选的实施方案中，所述的一种检测cyp2c19基因多态性检测试剂盒，反应液a还包含了一组内标基因的检测引物和探针，具体核苷酸序列如下：

表4内标基因检测的引物和探针序列情况表

在本发明优选的实施方案中，所述的一种检测cyp2c19基因多态性检测试剂盒，内标基因探针与所述的目标探针的荧光基团不同,优选地，所述的荧光报告基团选自cy5，荧光淬灭基团选自bhq1。

在本方面优选的实施方案中，cyp2c19野生型pcr反应液a由用于检测cyp2c19*2、cyp2c19*3、cyp2c19*17基因多态性的共用正向引物、共用探针，野生型arms反向引物、突变型pcr扩增阻断剂、内标引物和探针、pcr反应液组成。

在本方面优选的实施方案中，cyp2c19突变型pcr反应液a由用于检测cyp2c19*2、cyp2c19*3、cyp2c19*17基因多态性的共用正向引物、共用探针，突变型arms反向引物、野生型pcr扩增阻断剂、内标引物和探针、pcr反应液组成。

在本发明进一步优选的实施方案中，其中所述的pcr反应液由ph值为8.0～8.8的tris-hcl、mgcl2、kcl组成，优选ph值为8.0～8.8的ris-hcl的浓度为50mmol/l，优选mgcl2的浓度为3～8mmol/l，优选kcl的浓度为150～350mmol/l。

在本发明优选的实施方案中，所述的cyp2c19pcr反应液b由热启动taq酶、dutps及防污染的ung酶组成，优选每人份pcr反应酶系中热启动taq酶的用量为5～10u；优选ung酶用量为1.5～5u；优选dutps为6～12mmol。

在本方面优选的实施方案中，所述的一种检测cyp2c19基因多态性检测试剂盒提供了阴性质控品为灭菌纯水，阳性质控品为含有cyp2c19*2、cyp2c19*3、cyp2c19*17这3种等位基因的杂合型dna。

在本发明的进一步地实施方式中，本发明还提供了优选以全血为模板扩增的一种检测cyp2c19基因多态性的方法，包括以下步骤：

(1)直接使用待测全血样本或者使用核酸提取试剂盒提取dna。

(2)采用第一方面所述的检测cyp2c19基因多态性的引物和探针，或者采用第二方面所述的一种检测cyp2c19基因多态性检测试剂盒，以步骤(1)中的待测全血或dna为模板进行荧光pcr扩增。

(3)根据第二方面所述的一种检测cyp2c19基因多态性检测试剂盒，pcr扩增条件为：50℃2分钟，94℃5分钟；94℃15秒，58℃32秒，40个循环。

(4)根据第二方面所述的一种检测cyp2c19基因多态性检测试剂盒，pcr结果判断通过各检测通道ct值确定，内标cy5通道的ct值小于35的样本的检测结果视为有效，其他检测通道ct值小于35视为该通道检测基因突变型或者野生型阳性。

具体结果判读方式如下：

在本方面优选的实施方案中，pcr结果判断通过各检测通道ct值确定，内标cy5通道的ct值小于35的样本的检测结果视为有效，其他fam、vic、texasred检测通道ct值小于35视为该通道检测基因突变型或者野生型阳性。

在本方面优选的实施方案中，对于上述检测方法，作为优选，其中直接使用全血为模板进行pcr扩增，全血用量为1ul～5ul，免了dna提取繁琐的步骤，操作更简便，闭管操作，避免样本间交叉污染。

在本方面优选的实施方案中，进一步优选地，所述的pcr扩增条件为：50℃2分钟，94℃5分钟；94℃15秒，58℃32秒，40个循环，整个上机时间大大缩短，仅需70分钟即可获取结果。

在本方面优选的实施方案中，arms-pcr是利用特异性引物对突变靶序列进行高精准pcr扩增放大，与此同时加入pcr扩增阻断剂，利用探针对扩增产物进行检测，在实时荧光定量pcr平台上实现对样品dna中基因多态性的检测，以达到高特异性和高灵敏度。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明基于arms-pcr技术检测，同时加入pcr扩增阻断剂，保留了arms-pcr技术的优点同时大大提高了特异性，还具有了高灵敏度和高准确性的特点。

(2)本发明通过两个扩增体系可以实现3个基因位点cyp2c19*2、cyp2c19*3、cyp2c19*17的多态性检测，相对于一次只能检测一个基因位点，更高通量检测，降低检测成本和操作强度，适用于临床。

(3)本发明可以直接使用全血为模板扩增的优势，免了dna提取的步骤，操作更简便更快速，闭管操作，避免样本间交叉污染。

(4)本发明的两个扩增体系同时加入内标基因，减少提取问题导致假阳性，且加入了阴阳性质控品，能够对试剂的质量和环境是否存在污染进行把控，提高试剂盒的准确性，结果更真实可靠。

(5)本发明提供了一种快速上机条件，检测时间短，全程只需70分钟即可出结果，相对于市场现有的同类试剂盒大大缩减至少20分钟，操作简单、检测快速，且仅需实时荧光定量pcr仪即可实现，便于推广。

本发明的方法同样适用于非诊断的目的，例如，在新药研发过程中，使用本发明的检测方法获得用作中间结果的基因突变信息，这些基因突变信息可以作为公众健康管理之需，也可以用于药物代谢机制的研究及靶向新药研发。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国sambrook.j等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1试剂盒

本实施例提供了一种检测cyp2c19基因多态性的检测试剂盒，本发明所述的检测试剂盒的组成如下表：

实施例2用于检测cyp2c19基因多态性的检测方法

步骤一：pcr反应体系的配制

从试剂盒中取出cyp2c19野生型pcr反应液a、cyp2c19突变型pcr反应液a和cyp2c19pcr反应液b，室温融化后振荡混匀，8,000rpm瞬时离心后使用。

cyp2c19试剂单人份野生型pcr反应管体系配制如下表：

cyp2c19试剂单人份突变型pcr反应管体系配制如下表：

将各组分充分混合配制成相应的cyp2c19野生型pcr反应管和cyp2c19突变型pcr反应管，瞬时离心，将20μl扩增体系分装到pcr管中。

步骤二：处理待测样本

直接使用30例待测全血样本为模板或者使用核酸提取试剂盒提取全血样本中dna。

步骤三：加样

往上述pcr反应管中用分别加入待测样全血样本或者dna、cyp2c19阳性质控品和阴性质控品各1～5μl。盖紧管盖，8,000rpm瞬时离心后转移至扩增检测区。

步骤四：pcr扩增(abiprism7500荧光定量pcr仪)

打开setup窗口，按对应顺序设置阴、阳性质控品和待测标本，并在name栏中设置样品名称。选中所有设置样品孔，双击，选择adddetector，选择reporter为fam和quencher为none，再选择reporter为hex和quencher为none；再选择reporter为texasred和quencher为none；然后选择reporter为cy5和quencher为none后关闭窗口。在passivereference中选择(none)。打开instrument窗口设置循环条件：50℃2分钟，94℃5分钟；94℃15秒，58℃32秒，40个循环。所有设置完成后保存文件，运行。

步骤五结果分析

根据cyp2c19野生型和突变型扩增体系检测的扩增曲线，结果显示，cyp2c19*2-gg型为7例，cyp2c19*2-ag型为2例，cyp2c19*2-aa型为1例，cyp2c19*3-gg为7例，cyp2c19*3-ag为2例，cyp2c19*3-aa型为1例，cyp2c19*17-cc型为9例，cyp2c19*17-tc型1例，cyp2c19*17型为1例，代表性的基因分型结果如说明书附图1-图11所示，与金标注测序法结果对比发现，使用本发明提供的检测cyp2c19基因多态性的试剂盒，检测cyp2c19基因多态性结果的准确性为100％。

实施例3以人临床全血样本为模板检测cyp2c19基因多态性

本实施例采用人临床全血样本并以其为模板，按照本发明的试剂盒进行检测cyp2c19*2、cyp2c19*3、cyp2c19*17基因多态性。

本实施例采用本说明书已经说明的pcr反应体系与pcr反应条件，具体操作方法与实施例2相同。本实施例选取15例具有代表性的的人类临床全血样本，进一步地，分别把15例全血样本直接加入至pcr反应孔中，上机检测即可。通过基因分型结果与金标准测序对比发现，同时检测到cyp2c19*1/*1型14例，cyp2c19*1/*2型2例，cyp2c19*1/*3型2例，cyp2c19*1/*17型2例，代表性的基因分型结果如说明书附图12所示，验证了以全血样本为模板检测的准确性。本实施例验证了本发明不需要目前主流的试剂盒依赖基因组dna提取与纯化等繁琐的步骤，操作更简便，节约了大量的时间与成本，直接使用全血样本为模板是本发明的一大特色。

实施例4以人基因组dna样本为模板检测本发明试剂盒的灵敏度

本实施例以人基因组dna样本为模板检测本发明试剂盒的灵敏度，具体检测方法如下：

采用本说明书已经说明的pcr反应体系与pcr反应条件，具体操作方法与实施例2相同。选取9例人基因组dna为模板，9例人基因组dna的型别分别为cyp2c19*2-gg、cyp2c19*2-ag、cyp2c19*2-aa、cyp2c19*3-gg、cyp2c19*3-ag、cyp2c19*3-aa、cyp2c19*17-cc、cyp2c19*17-tc、cyp2c19*17-tt，同时设置9例dna模板检出限分别为0.1ng/μl、0.5ng/μl、1ng/μl、10ng/μl、100ng/μl。结果显示，在dna模板浓度为0.5ng/μl条件下仍然可以很清晰地准确分型，代表性的基因分型结果如说明书附图13所示。通过本实施例验证证明，利用本发明的试剂盒进行cyp2c19*2、cyp2c19*3、cyp2c19*17基因分型检测具有很高的灵敏度，灵敏度高达到0.5ng/μl。

对比例1

本发明人在研究过程中，针对各突变位点目标序列筛选了数十组荧光定量pcr用引物和探针，其中绝大部分显示特异性低、灵敏度差、多重扩增效率差等问题，无法满足应用需求。同时我们发现有些探针虽然仅差一个核苷酸即可显著影响检测特异性。典型的普通引物序列和探针检测效果如下：

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中山大学达安基因股份有限公司

<120>一种检测cyp2c19基因多态性的方法及试剂盒

<130>000009

<160>48

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>1

ccagagcttggcatattgtatc22

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>2

agatatgcaataattttcccac22

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>3

taagtaatttgttctgcatcc21

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>4

taagtaatttgttatcgcatct22

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>5

ttatgggttcccgggacatgatc23

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>6

ttatgggttcctgggagatcatc23

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>7

ctgcaatgtgatctgctcca20

<210>8

<211>22

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>8

cgtttcgattataaagatcagc22

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>9

aacttggccttacctcgttc20

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>10

aacttggccttacctgattt20

<210>11

<211>22

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>11

ttacctggatccaggcggtcct22

<210>12

<211>22

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>12

ttacctggattcaggggatgct22

<210>13

<211>22

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>13

gaacaggatgaatgtggtatat22

<210>14

<211>25

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>14

gctaaaacaaagttttagcaaacga25

<210>15

<211>23

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>15

cattatctcttacatcagcgtag23

<210>16

<211>23

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>16

cattatctcttacatcagccaga23

<210>17

<211>23

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>17

catcagagatgctttgagcacag23

<210>18

<211>23

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>18

catcagagatactttgagatcag23

<210>19

<211>22

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>19

ccgtgtactattagccatggtc22

<210>20

<211>19

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>20

gacctcaaaggagacgcgg19

<210>21

<211>20

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>21

cttcgacattgccgtcgacg20

<210>22

<211>26

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>22

ctcttagatatgcaataattttccca26

<210>23

<211>26

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>23

ctttctccaaaatatcactttccata26

<210>24

<211>21

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>24

ttgattatttcccgggaaccc21

<210>25

<211>25

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>25

ggcatattgtatctatacctttatt25

<210>26

<211>25

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>26

aatatcactttccataaaagcaagg25

<210>27

<211>21

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>27

ttgattatttcccgggaaccc21

<210>28

<211>22

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>28

ccagagcttggcatattgtatc22

<210>29

<211>26

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>29

ctttctccaaaatatcactttccata26

<210>30

<211>21

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>30

ttgattatttcccgggaaccc21

<210>31

<211>22

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>31

ccagagcttggcatattgtatc22

<210>32

<211>26

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>32

ctttctccaaaatatcactttccata26

<210>33

<211>18

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>33

gattatttcccgggaacc18

<210>34

<211>24

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>34

ttattttccagaaacgtttcgatt24

<210>35

<211>22

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>35

aaaacttggccttacctggatc22

<210>36

<211>23

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>36

agcaccccctggatccaggtaag23

<210>37

<211>24

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>37

ttattttccagaaacgtttcgatt24

<210>38

<211>22

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>38

aaaacttggccttacctggatc22

<210>39

<211>15

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>39

ccccctggatccagg15

<210>40

<211>23

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>40

ttccaatcatttagcttcaccct23

<210>41

<211>25

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>41

gaattttggatttcccagaaaaaaa25

<210>42

<211>15

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>42

ccccctggatccagg15

<210>43

<211>18

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>43

tgtcttctgttctcaaag18

<210>44

<211>19

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>44

ttggtgccacacagctcat19

<210>45

<211>24

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>45

tcagaagacctcagctcaaatccc24

<210>46

<211>19

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>46

tgtcttctgttctcatagc19

<210>47

<211>19

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>47

ttggtgccacacagctcat19

<210>48

<211>24

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>48

tcagaagacctcagctcaaatccc24