一种用于实时荧光定量PCR的免提取直接扩增试剂及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于实时荧光定量pcr的免提取直接扩增试剂及其应用。

背景技术：

聚合酶链式反应(pcr)技术是一种简单快捷、高灵敏、特异的基因扩增方法，其过程通常包括20-50个由变性、退火和延伸三步反应构成的循环。可以在1.5-3小时内特异地扩增靶核酸序列至几百万倍。近年来，由于实时荧光pcr仪的出现使普通pcr不再需要凝胶电泳分析，从而不必pcr后操作，杜绝了pcr污染。目前，实时荧光pcr技术已经在感染性疾病检测、遗传病检测、肿瘤基因基因突变检测等多个领域广泛应用。

实时荧光pcr扩增的产物为核酸片段，而病毒、细菌或人体细胞中的核酸都是包裹在蛋白质和脂肪中，因此在扩增前需要对临床样本进行处理，将核酸释放并纯化出来后才能进行核酸扩增。现阶段对样本的核酸进行提取，主要采用离心柱法和磁珠法，两种方法都要经过裂解、结合、洗涤、重复洗涤、洗脱等步骤，操作复杂，耗时1~2小时，且需要用到大量的蛋白变构剂和有机溶剂。同时核酸提取还需用到专业的实验室设备及环境，对操作人员也有特殊的要求。

所以，为了满足日益旺盛的临床快速检测需求，亟需发明一种能够提高检测效率且操作要求低的直接扩增荧光pcr方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于实时荧光定量pcr的免提取直接扩增试剂及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

为了实现免提取直接扩增，则必须将核酸的释放整合到扩增体系中，利用实时荧光pcr开始前的预变性过程将细胞裂解、使核酸释放出来。由于细胞的裂解使在pcr扩增体系里进行，所以用于细胞裂解的试剂应该尽量温和，保证taq酶、逆转录酶等的活性是的pcr反应能够顺利进行，从而实现简便操作的同时并不影响pcr反应的准确性和灵敏度。

在细胞的裂解方面，本发明选用naoh来提供一个弱碱性环境，细胞在弱碱性环境中更易于裂解。同时经过试验对比，在naoh浓度为20mmol/l的条件下，将直接扩增试剂的ph值调整至9.5时，细胞裂解的速度最快。

细胞在裂解的过程中，需要表面活性剂的作用来加速细胞外模蛋白和脂类的溶解。但多数表面活性剂作用剧烈，在裂解细胞的同时会影响酶的活性，从而影响pcr扩增的效果。在表面活性剂的选择上，本发明选择了莎梵婷这一新型的温和表面活性剂，在加速细胞裂解的同时又能保证酶的活性。经过试验对比，莎梵婷的最佳工作浓度为0.5%。

细胞裂解后，会产生包含蛋白片段和脂类的杂质，这些杂质存在于pcr反应体系中时会影响pcr反应效果，所以必须降低这些杂质对pcr的干扰以保证结果的准确性和灵敏度。本发明涉及的直接扩增试剂中，添加chelex-100来去除细胞裂解后的杂质。chelex-100在碱性条件下能够是蛋白变性、细胞裂解，同时吸附非核酸类的有机物，能够有效地去除pcr反应体系中由于细胞裂解而产生的杂质。经过试验对比，chelex-100的最佳工作浓度为0.9%。

本发明涉及的直接扩增试剂中，添加了蔗糖来增加细胞溶胀、加速细胞裂解，经过试验对比，蔗糖的最佳工作浓度为8%。

为了保护进一步减少杂质对pcr的干扰，增加pcr的稳定性，本发明涉及的直接扩增试剂中添加了dmso，经过试验对比，dmso的最佳工作浓度为5%。

本发明还优化了直接扩增试剂的使用方法，按照以下组分终浓度配制直接扩增试剂：

naoh20mmol/l

莎梵婷0.5wt.%

dmso5wt.%

蔗糖8wt.%

chelex-1000.9wt.%。

配制好的直接扩增试剂，按照1：1的比例与样本混合，样本混合液直接加到pcr扩增试剂中，置入荧光定量pcr仪中进行pcr扩增。样本与直接扩增试剂混合后即开始裂解，在pcr仪中进行预变性时会加热至95℃，这个阶段能够将样本完全裂解。样本裂解后释放出来的核酸即可用于pcr扩增，本发明将核酸释放整合到pcr扩增体系中，实现了样本的免提取直接扩增。

发明的优点：本发明的优势为1、简化荧光定量pcr的操作；2、缩短荧光定量pcr的流程，提高临床检测效率；3、无需特殊的实验室设备及实验室环境。

发明的有益效果：1、本发明优化了pcr检测流程，能显著提高pcr检测的效率；2、本发明的应用能大幅降低pcr检测成本，具有较高的经济效益；3、本发明配合pcr试剂冻干技术，能够实现pcr的现场即时检测（poct），为临床医学检验、检验检疫、疾病预防控制等提供有效的解决方案。

附图说明

图1，流感病毒样本01扩增结果，两种方法扩增ct值无明显差异。

图2，流感病毒样本02扩增结果，两种方法扩增ct值无明显差异。

图3，流感病毒样本03扩增结果，两种方法扩增ct值无明显差异。

图4，流感病毒样本04扩增结果，两种方法扩增ct值无明显差异。

图5，流感病毒样本05扩增结果，两种方法扩增ct值无明显差异。

图6，流感病毒样本06扩增结果，两种方法扩增ct值无明显差异。

图7，流感病毒样本07扩增结果，两种方法扩增ct值无明显差异。

图8，流感病毒样本08扩增结果，两种方法扩增ct值无明显差异。

图9，人乳头瘤病毒样本01扩增结果，两种方法扩增ct值无明显差异。

图10，人乳头瘤病毒样本02扩增结果，两种方法扩增ct值无明显差异。

图11，人乳头瘤病毒样本03扩增结果，两种方法扩增ct值无明显差异。

图12，人乳头瘤病毒样本04扩增结果，两种方法扩增ct值无明显差异。

图13，人乳头瘤病毒样本05扩增结果，两种方法扩增ct值无明显差异。

图14，人乳头瘤病毒样本06扩增结果，两种方法扩增ct值无明显差异。

图15，8例流感病毒快速扩增结果，8例样本皆能被准确的检测出来。

具体实施方式

实施例一：免提取直接扩增试剂用于甲型流感病毒核酸检测

流感病毒包括甲、乙、丙三型，甲型最容易引起流行，乙型次之，丙型极少引起流行。依据病毒颗粒外膜血凝素（ha）和神经氨酸酶（na）蛋白抗原性的不同，甲型流感病毒目前可分为16个h亚型（h1-h16）和9个n亚型（n1-n9），目前已有h1、h2、h3、h5、h7和h9等亚型有人感染的报道。由于编码ha和（或）na的核苷酸序列容易发生突变，致使ha和（或）na的抗原表位发生改变，这种抗原性的改变使人群原有的特异性免疫力失效，故甲型流感病毒常引起较大规模甚至世界性的流感流行。按照流行特点，造成人间流感流行的流感病毒可区分为季节性流感病毒和新型甲型流感病毒。季节性流感病毒通常在年度间发生小范围的基因变异，这种基因变异会导致微小的抗原性改变，称为抗原漂移（antigenicdrift）。因此，季节性流感病毒虽具有年度特异性且抗原性的改变使感染者不易获得持久免疫力，但传播范围通常局限于较小的人群范围，一般不会造成太高的发病率和死亡率，易感人群多为老年人（>65岁）和婴幼儿（<6岁）。在过去的几十年中，季节性流感病毒主要集中在甲型h3n2和h1n1亚型。近年来，新型甲型流感病毒亚型暴发流行的案例时有发生。例如，2009年新型甲型h1n1流感病毒造成全球性流感大流行；人感染高致病性禽流感（h5亚型）病毒的病例时有报道，禽类甲型h5n1亚型流感病毒被认为具有造成人间大范围流感流行的潜力。新型甲型流感病毒通常由于基因的节段性重组所致，这种大范围的基因改变易导致病毒抗原特性的重大改变，称为抗原转变（antigenicshift）。新型甲型h1n1流感病毒（2009）即同时包含了禽流感、猪流感和人季节性流感的基因片段从而导致病毒在抗原水平发生了明显改变。由于抗原性的明显改变以及可能由此造成的病毒毒力的增强，病毒的传染性和致病严重程度都有所增加，故新型甲型流感病毒可能造成更高的发病率和死亡率。

流感病毒主要经空气飞沫传播，常引起发热、乏力、肌肉酸痛以及轻到中度的呼吸道症状，重者可致肺炎、心肌炎和心衰。流感病毒核酸检测试剂可用于流感的辅助诊断，甲型流感病毒各亚型检测试剂还可用于区分季节性流感病毒和新型甲型流感病毒，并可获得关于流感暴发的流行病学信息。

为了验证免提取直接扩增试剂用于甲型流感病毒核酸检测的有效性，我们购买了上海之江生物科技股份有限公司生产的“甲、乙型流感病毒核酸联合测定试剂盒（荧光pcr法）”及配套的核酸提取试剂盒（磁珠法）来进行对比试验。

分别采用上海之江公司提供的核酸提取试剂（磁珠法）以及本发明提供的直接扩增试剂对8例甲型流感病毒样本（鼻咽部拭子）进行处理，然后用“甲、乙型流感病毒核酸联合测定试剂盒（荧光pcr法）”进行pcr检测，对比两种方法的检测结果。

本发明提供的直接扩增试剂配方如下：

实验过程如下：

1、样本处理：

（1）上海之江公司提供的磁珠法核酸提取试剂：按照试剂盒说明书，取200ul样本在核酸提取设备中进行核酸提取，最终用100ul洗脱液洗脱。整个过程耗时1小时15分钟。

（2）本发明免提取直接扩增试剂：取5ul样本和5ul直接扩增试剂加入pcr反应管中备用。整个过程耗时2分钟。

2、加样：

（1）上海之江公司提供的磁珠法核酸提取试剂：在pcr反应管中加入20ul配制好的“甲、乙型流感反应缓冲液”，然后加入提取好的核酸各5ul。

（2）本发明免提取直接扩增试剂：在已加入样本和直接扩增试剂混合液的pcr管中加入20ul配制好的“甲、乙型流感反应缓冲液”。

3、上机扩增：

反应条件为：45℃10min，95℃15min；95℃15s，60℃60s，45个循环。

4、结果分析：

扩增后的ct值对比如下（具体见图1-8）：

实施例二：免提取直接扩增试剂用于人乳头瘤病毒核酸分型检测

人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus,hpv）属于乳头瘤病毒科，是一种小分子的、无被膜包被的1、环状双链dna病毒，基因组长约8000碱基对（bp），分为3个功能区，即早期转录区（e区）、晚期转录区（l区）和非转录区（长控制区，lcr）。hpv通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。该病毒不但具有宿主特异性，而且具有组织特异性，只能感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，引起人类皮肤的多种乳头状瘤或疣及生殖道上皮增生性损伤。

多年来，国际上通用的宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的诊断主要遵循“三阶梯式”诊断程序，即宫颈细胞学、阴道镜及组织病理学检查。宫颈细胞学检查是普遍应用的宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的筛查方法，可发现早期病变。但宫颈细胞学检查存在其固有的局限性。高危型hpv检测用于宫颈细胞学检查异常患者的分流及宫颈癌筛查，可有效地增加宫颈病变检出率，提高细胞学检查敏感性，并降低筛查频率。

为了验证免提取直接扩增试剂用于人乳头瘤病毒核酸分型检测的有效性，我们购买了江苏硕世生物科技有限公司生产的“人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒(荧光pcr法)”及配套的核酸提取试剂盒（磁珠法）来进行对比试验。

分别采用江苏硕世公司提供的核酸提取试剂（磁珠法）以及本发明提供的直接扩增试剂对6例人乳头瘤病毒样本（宫颈脱落细胞）进行处理，然后用“人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒(荧光pcr法)”进行pcr检测，对比两种方法的检测结果。

本发明提供的直接扩增试剂配方如下：

实验过程如下：

1、样本处理：

（1）江苏硕世公司提供的磁珠法核酸提取试剂：按照试剂盒说明书，取500ul样本在核酸提取设备中进行核酸提取，最终用100ul洗脱液洗脱。整个过程耗时1小时30分钟。

（2）本发明免提取直接扩增试剂：取3ul样本和3ul直接扩增试剂加入pcr反应管中备用。整个过程耗时2分钟。

2、加样：

（1）江苏硕世公司提供的磁珠法核酸提取试剂：在pcr反应管中加入18ul配制好的反应缓冲液，然后加入提取好的核酸各2ul。

（2）本发明免提取直接扩增试剂：在已加入样本和直接扩增试剂混合液的pcr管中加入18ul配制好的反应缓冲液。

3、上机扩增：

反应条件为：37℃5min，95℃10min；95℃15s，58℃40s，40个循环。

4、结果分析：

扩增后的ct值对比如下（具体见图9-14）：

实施例三：免提取直接扩增试剂配合冻干试剂用于甲型流感病毒快速检测

流感病毒主要经空气飞沫传播，常引起发热、乏力、肌肉酸痛以及轻到中度的呼吸道症状，重者可致肺炎、心肌炎和心衰。流感病毒核酸检测试剂可用于流感的辅助诊断，现阶段流感病毒核酸检测试剂操作较为复杂，需要经过核酸提取---扩增试剂配制---加样上机---pcr检测，这四个过程。检测期间需要用到大量专业的实验室设备，且需要严格的实验室环境来保证操作过程中，不同样本之间不产生交叉干扰。整个检测流程需要3.5~5小时，不具备较好的检测时效性，给患者带来额外的治疗成本。

贝南生物科技（厦门）有限公司提供的冻干粉试剂，能够实现常温的保存和运输，使用时不需额外的试剂配制操作，直接撕开试剂包装即可使用。配合本发明的免提取直接扩增试剂使用，检测流程能在1小时内完成，能够显著减少检测操作，降低对环境及设备的要求，同时提高检测时效性。

为了验证流感病毒快速检测系统的有效性，我们采用8例甲型流感病毒阳性患者的咽部拭子进行验证，过程如下：

本发明提供的直接扩增试剂配方如下：

甲型流感病毒冻干粉核酸检测试剂配方如下：

其中，甲型流感病毒引物探针序列如下：

上游引物：tgatcctctcgttgttgcag

下游引物：ctgccgatattcttccctca

探针：ggtttgaaaagagggccttc

具体实验过程为：

1、样本采集：

用拭子采样器灵敏而轻柔的擦拭两侧腭弓和咽、扁桃体上的分泌物，然后将拭子放入装有500ul直接扩增试剂的离心管中，转动拭子使分泌物洗脱到直接扩增试剂中，挤干拭子上的液体后将拭子丢弃，管中的液体备用。

2、加样：

撕开甲型流感病毒冻干粉试剂包装，将管子取出，揭开盖子，加入上述洗脱好的拭子样本20ul，盖上盖子。

3、上机检测：

将加好样的试剂放入荧光定量pcr仪中进行扩增。反应条件如下：50℃5min；95℃10s，58℃25s，45个循环。

4、结果分析：

8例样本检测结果皆为阳性，表明本发明的直接扩增试剂配合冻干粉试剂使用，检测结果能够满足临床需求，具体见图15。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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<110>贝南生物科技（厦门）有限公司

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