用于检测CYP3A5基因多态性的产品及其检测方法和应用与流程

本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种用于检测cyp3a5基因多态性的产品及其检测方法和应用。

背景技术：

高血压是我国人群脑卒中和冠心病发病及死亡的主要因素，近50年来我国高血压患病率呈明显上升趋势。钙离子通道阻滞剂类药物是临床常用的抗高血压药物，但是临床实践发现，同样服用该类药物，不同患者对药物的反应存在个体化差异，而基因多态性是药物反应个体化差异的重要影响因素。

cyp3a5基因第3内含子(rs776746，cyp3a5*3)中存在6986a>g的突变，该snp可导致cyp3a5mrna异常剪接，引起终止密码子过早出现，cyp3a5蛋白合成提前终止，从而使其失去酶的活性，因此，拥有cyp3a5*3突变的纯合子个体肝脏和肠道cyp3a5蛋白表达和活性显著下降。由于cyp3a5基因与钙离子通道阻滞剂类药物的代谢有关，cyp3a5*3突变型代谢能力会降低，造成药物不容易被代谢出体外，易发生药物副作用。

因此，实现差异个体的最佳用药剂量需要考虑两个方面，一是摄入钙离子通道阻滞剂类药物剂量；二是摄入体内的钙离子通道阻滞剂类药物利用率，即钙离子通道阻滞剂类药物的代谢能力。摄入体内的钙离子通道阻滞剂类药物剂量是由个体的钙离子通道阻滞剂类药物代谢能力决定的，所以个体的检测钙离子通道阻滞剂类药物代谢能力，根据检测结果指导个体的钙离子通道阻滞剂类药物剂量是实现科学合理用药的有效方法。

目前针对基因多态性的检测方法很多，如测序法，基因芯片法，高分辨率溶解曲线检测法(highresolutionmeltinganalysis，hrm)，荧光定量pcr法等。其中，荧光定量pcr法操作简单、耗时短、检测灵敏度高，在临床得到了广泛应用。荧光定量pcr最常采用的方法是taqman探针法，并且随着多种标记基团的出现，一个反应管含有多种荧光标记的探针从而识别不同多态性位点的多重pcr技术也得到了普遍应用。但是多重pcr技术由于含有多条引物探针，引物探针之间相互干扰，导致体系的检测灵敏度和特异性受到了限制。同时，目前的基因检测试剂盒中各组分都需要分开放置，使用时按照配比现场混合检测，易出现操作失误或试剂污染等问题，为检测带来了不便并且增加了错检的概率。

开发一种操作简单、快速的基因检测试剂盒将更会受市场青睐。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种用于检测cyp3a5基因多态性的引物组合物，本发明的第二目的在于提供一种用于检测cyp3a5基因多态性的试剂，本发明的第三目的在于提供一种用于检测cyp3a5基因多态性的试剂盒，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。

本发明的第四目的在于提供一种用于检测cyp3a5基因多态性的方法，该方法可以简单快速的进行cyp3a5基因多态性检测并直接得到结果，普适性强。

本发明的第五目的在于上述引物组合物、试剂或试剂盒在检测钙离子通道阻滞剂类药物的代谢能力中的应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种用于检测cyp3a5基因多态性的引物组合物，所述引物组合物包括用于检测cyp3a5*3位点的引物组；

所述用于检测cyp3a5*3位点的引物组包括：

如seqidno.1所示的cyp3a5*3位点的上游引物、如seqidno.2所示的cyp3a5*3位点的下游引物、含有如seqidno.3所示的cyp3a5*3位点的野生型特异性探针和含有如seqidno.4所示的cyp3a5*3位点的突变型特异性探针；

其中，所述野生型特异性探针和所述突变型特异性探针的5’端均分别连接有荧光报告基团且互不相同；

所述野生型特异性探针和所述突变型特异性探针的3’端均分别连接有荧光淬灭基团。

进一步地，所述野生型特异性探针和所述突变型特异性探针均分别连接有mgb修饰基团；

优选地，所述mgb修饰基团与所述荧光淬灭基团连接；

优选地，所述野生型特异性探针修饰有锁核酸，进一步优选地，所述锁核酸位于探针的中间，更进一步优选地，所述锁核酸包括目的等位基因；

优选地，所述荧光报告基团选自fam、vic、rox、cy3或cy5中的任一种；

优选地，所述荧光淬灭基团选自tamra、bhq1、bhq2或nfq中的任一种；

优选地，所述野生型特异性探针的荧光报告基团为fam，所述突变型特异性探针的荧光报告基团为vic；

优选地，所述野生型特异性探针和所述突变型特异性探针的荧光淬灭基团均为nfq。

进一步地，所述引物组合物还包括用于检测内参gapdh序列的引物组；

所述用于检测内参gapdh序列的引物组包括：

如seqidno.5所示的内参上游引物、如seqidno.6所示的内参下游引物和含有如seqidno.7所示的内参特异性探针；

其中，所述内参特异性探针的5’端连接有荧光报告基团且与所述野生型特异性探针和所述突变型特异性探针的荧光报告基因均不相同；

所述内参特异性探针的3’端连接有荧光淬灭基团；

优选地，所述荧光报告基团选自fam、vic、rox、cy3或cy5中的任一种；

优选地，所述荧光淬灭基团选自tamra、bhq1、bhq2或nfq中的任一种；

优选地，所述内参特异性探针的荧光报告基团为rox；

优选地，所述内参特异性探针的荧光淬灭基团为bhq2。

一种用于检测cyp3a5基因多态性的试剂，所述试剂包括上述引物组合物。

一种用于检测cyp3a5基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组合物或试剂。

进一步地，所述试剂盒还包括pcr缓冲液、dmso和酶；

优选地，所述dmso与pcr体系预混液的体积比为(0.5-2)：23；

优选地，所述试剂盒中所述引物组合物、所述pcr缓冲液、所述dmso和所述酶混合构成pcr体系预混液。

进一步地，所述pcr缓冲液中包括pcr添加剂、mgcl2或dntps中的至少一种；

优选地，所述pcr添加剂包括dmso、甘油或bsa中的至少一种；

优选地，所述mgcl2的浓度为1-5mm；

优选地，所述dntps包括datp、dgtp、dctp和dutp；

优选地，所述datp、dutp、dgtp和dctp的浓度均独立地为0.1-0.5mm；

优选地，所述酶包括taq酶和ung酶；

优选地，所述taq酶和所述ung酶在pcr体系预混液的总量比为：(0.5u-1.0u)：(0.1u-0.5u)。

进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照液和/或空白对照液；

优选地，所述阳性对照液包括2种质粒，所述2种质粒分别包括带有cyp3a5*3a的dna片段和带有cyp3a5*3g的dna片段；

优选地，所述阳性对照液为所述2种质粒的混合液；

优选地，所述混合液的浓度为2000-3000copies/μl；

优选地，所述空白对照液包括tris-hcl缓冲液；

优选地，所述tris-hcl缓冲液的浓度为7-13mm，ph为7.5-8.5。

一种用于检测cyp3a5基因多态性的方法，应用上述引物组合物、试剂或试剂盒，以待测样本的dna为模板，进行pcr扩增反应并进行基因分型。

本发明最后提供上述引物组合物、试剂或试剂盒在检测钙离子通道阻滞剂类药物的代谢能力中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的用于检测cyp3a5基因多态性的引物组合物，包括用于检测cyp3a5*3位点的引物组，其中，野生型特异性探针和突变型特异性探针的荧光报告基团互不相同。该引物组合物可以准确检测cyp3a5基因多态性，具有灵敏度高并且特异性好的优势，可以准确检测0.1ng基因组dna的基因型，同时又可以耐受500ng的基因组dna。结果清晰明了易分析，利用不同的荧光标记，分通道检测，结合结果判读方法，即可明确得到结论，检测结果可用于临床指导用药。

本发明提供的用于检测cyp3a5基因多态性的试剂和试剂盒，包括上述引物组合物，其成本低，效率高，结果真实可靠，检测过程均为闭管反应，显著降低污染，操作简单，耗时短，只需90min即可完成检测。试剂盒采用一管检测两种多态性，避免了分管，极大地简化了操作流程。该试剂盒解决了现有多重pcr技术对低浓度的dna无法准确检出，对高浓度的dna无法准确判型的问题。

本发明提供的用于检测cyp3a5基因多态性的检测方法，应用本发明提供的引物组合物、试剂或试剂盒，以待测样本的dna为模板，进行pcr扩增反应并进行基因分型。该方法操作简单，成本低，耗时短，结果准确可靠。

附图说明

图1为本发明实施例2中cyp3a5*3位点a/a纯合野生检测结果图；

图2为本发明实施例2中cyp3a5*3位点g/g纯合突变检测结果图；

图3为本发明实施例2中cyp3a5*3位点a/g杂合突变检测结果图；

图4为本发明实施例3中cyp3a5*3位点a/a纯合野生检测结果图；

图5为本发明实施例3中cyp3a5*3位点g/g纯合突变检测结果图；

图6为本发明实施例4中cyp3a5*3-wp1探针制备pcr体系热稳定性检测结果图；

图7为本发明实施例4中cyp3a5*3-wp2探针制备pcr体系热稳定性检测结果图；

图8为本发明实施例4中cyp3a5*3-wp3探针制备pcr体系热稳定性检测结果图；

图9为本发明实施例5中takara的taq酶制备的pcr体系热稳定性检测结果图；

图10为本发明实施例5中promega的taq酶制备的pcr体系热稳定性检测结果图；

图11为本发明实施例6中不含lna的pcr体系热稳定性检测结果图；

图12为本发明实施例6中含lna的pcr体系热稳定性检测结果图；

图13为本发明实施例6中不含lna和含lna两种体系检测灵敏度对比检测结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

一种用于检测cyp3a5基因多态性的引物组合物，包括用于检测cyp3a5*3位点的引物组，用于检测cyp3a5*3位点的引物组包括：如seqidno.1所示的cyp3a5*3位点的上游引物、如seqidno.2所示的cyp3a5*3位点的下游引物、含有如seqidno.3所示的cyp3a5*3位点的野生型特异性探针和含有如seqidno.4所示的cyp3a5*3位点的突变型特异性探针；

其中，野生型特异性探针和突变型特异性探针的5’端均分别连接有荧光报告基团且互不相同；

野生型特异性探针和突变型特异性探针的3’端均分别连接有荧光淬灭基团。

本发明提供的引物组合物用于检测cyp3a5*3等位基因的序列号为rs776746的snp位点：

表1：cyp3a5*3等位基因的类型

其中，*3a为野生型位点，*3g为突变型位点。

本发明提供的两条引物用于扩增cyp3a5*3基因多态性的dna片段：

上游引物：5’-cccagcttaacgaatgctctac-3’(seqidno.1)；

下游引物：5’-tgaagggtaatgtggtccaaacag-3’(seqidno.2)；

本发明提供的两条taqman探针，均是snp探针，可以特异性识别目的序列：

seqidno.3的序列为：5’-tgtctttcaatatctcttc-3’，含有该序列的特异性探针用于检测野生型位点；

seqidno.4的序列为：5’-tgtctttcagtatctcttc-3’，含有该序列的特异性探针用于检测突变型位点。

该引物组合物可以准确检测cyp3a5基因多态性，具有灵敏度高并且特异性好的优势，可以准确检测0.1ng基因组dna的基因型，同时又可以耐受500ng的基因组dna。结果清晰明了易分析，利用不同的荧光标记，分通道检测，结合结果判读方法，即可明确得到结论，检测结果可用于临床指导用药。

一些优选地实施方式中，野生型特异性探针和所述突变型特异性探针均分别连接有mgb修饰基团。mgb修饰基团本身不产生荧光，因此可以大大降低本底信号的强度，同时该特异性探针上还连接有mgb修饰基团，可以将该探针的tm值提高10℃左右，因此同样的tm值，mgb探针可以比普通taqman探针设计的更短，使得探针在识别具有单个核苷酸多态性位点时，特异性更强。

一些优选地实施方式中，mgb修饰基团与荧光淬灭基团连接。例如mgb-nfq。

一些优选地实施方式中，野生型特异性探针修饰有锁核酸，进一步优选地，锁核酸位于探针的中间，更进一步优选地，锁核酸包括目的等位基因。锁核酸(lna)修饰进一步提高了探针的tm值，更利于探针与模板牢固结合，从而提高探针的扩增效率。另外lna可以抵抗核酸酶降解，采用lna修饰探针更利于探针在pcr体系预混液中稳定保存。

一些实施方式中，荧光报告基团选自fam、vic、rox、cy3或cy5中的任一种。

一些实施方式中，荧光淬灭基团选自tamra、bhq1、bhq2或nfq中的任一种。

一些优选地实施方式中，野生型特异性探针的荧光报告基团为fam，突变型特异性探针的荧光报告基团为vic，野生型特异性探针和突变型特异性探针的荧光淬灭基团均为nfq(non-fluorescentquencher)。nfq基团本身不产生荧光，因此可以大大降低本底信号的强度，由于两种探针的荧光报告集团互不相同，两条探针可以同时在一个反应管内，建立了同一反应管检测同一基因两种不同多态性的多重荧光定量pcr检测体系。

野生型特异性探针(“+”为锁核酸位点)：

5’-fam-tgtctttca+a+t+a+tctcttc-nfq-mgb-3’；

突变型特异性探针：

5’-vic-tgtctttcagtatctcttc-nfq-mgb-3’。

一些优选地实施方式中，引物组合物还包括用于检测内参gapdh序列的引物组，用于检测内参gapdh序列的引物组包括：如seqidno.5所示的内参上游引物、如seqidno.6所示的内参下游引物和含有如seqidno.7所示的内参特异性探针；

其中，内参特异性探针的5’端连接有荧光报告基团且与野生型特异性探针和突变型特异性探针的荧光报告基因均不相同；

内参特异性探针的3’端连接有荧光淬灭基团。

内标上游引物：5’-gggccactaggcgctca-3’(seqidno.5)；

内标下游引物：5’-agccacccgcgaactca-3’(seqidno.6)；

seqidno.7所示的序列为：5’-ctctccctccgcgcagccg-3’。

用于检测内参gapdh序列的引物组为人源性内标，使用内标系统监测该荧光定量pcr反应是否存在抑制，由于待检测的样品中的某些成分可能含有导致pcr出现部分或完全抑制；此外，扩增仪可能存在高于允许范围的孔间差，导致不同管间扩增效率差异，另外人为加样错误也可能导致假阴性结果的出现，因此本发明中采用内标系统来消除上述隐患，保证了检测结果的准确性。seqidno.5-7所示的引物所检测的内标物的序列选择的是人类基因组dna的一段gapdh序列，gapdh序列与靶标序列同时存在于人类基因组，且与目标待检基因无同源性。因此保证了内标引物只扩增gapdh序列，而不影响靶标序列扩增。

一些实施方式中，荧光报告基团选自fam、vic、rox、cy3或cy5中的任一种。

一些实施方式中，荧光淬灭基团选自tamra、bhq1、bhq2或nfq中的任一种。

一些优选地实施方式中，内参特异性探针的荧光报告基团为rox。

一些优选地实施方式中，内参特异性探针的荧光淬灭基团为bhq2。

内参特异性探针：5’-rox-ctctccctccgcgcagccg-bhq2-3’。

一种用于检测cyp3a5基因多态性的试剂，包括上述引物组合物。

一种用于检测cyp3a5基因多态性的试剂盒，包括上述引物组合物或试剂。本试剂盒可用于高通量、低成本快速检测cyp3a5*3基因多态性，其灵敏度高，特异性强，可适用于从edta、枸橘酸钠抗凝全血中提取的人类基因组dna的检测。该试剂盒采用一管检测两种多态性，避免了分管，极大地简化了操作流程。该试剂盒也解决了现有多重pcr技术对低浓度的dna无法准确检出，对高浓度的dna无法准确判型的问题。

一些实施方式中，试剂盒还包括pcr缓冲液、dmso和酶。

一些优选地实施方式中，dmso与pcr体系预混液的体积比为(0.5-2)：23。dmso与pcr体系预混液的体积比典型但非限制性的为0.5:23、1:23、1.5:23或2:23。二甲基亚砜(dmso)可以进一步提高试剂盒的稳定性，并且提高试剂盒的检测特异性。

一些优选地实施方式中，试剂盒中引物组合物、pcr缓冲液、dmso和酶混合构成pcr体系预混液。由于pcr的特殊性，将引物探针与酶混合在一起，不利于试剂盒的稳定保存，所以，目前的产品都是pcr体系现用现配的，这种操作较为繁琐，易出现操作误差，本发明通过大量的试验，对各因素进行分析、论证和改进，通过在野生型特异性探针上同时添加锁核酸和mgb两种修饰，成功构建了mix型式试剂盒，引物探针和酶可以混合稳定保存，从而提供了一种含酶的多重pcr试剂盒。该试剂盒由于酶直接存在于pcr体系预混液中，需要检测时，直接将待检测样品点样加入体系中即可进行pcr扩增，极大地节省了操作时间，整个反应只需90min即可完成。

一些优选地实施方式中，pcr缓冲液中包括pcr添加剂、mgcl2或dntps中的至少一种。

一些优选地实施方式中，pcr添加剂包括dmso、甘油或bsa中的至少一种。

一些优选地实施方式中，mgcl2的浓度为1-5mm。mgcl2的浓度典型但非限制性的为1mm、2mm、3mm、4mm或5mm。

一些实施方式中，dntps包括datp、dgtp、dctp和dutp。

一些优选地实施方式中，datp、dutp、dgtp和dctp的浓度均独立地为0.1-0.5mm。datp的浓度典型但非限制性的为0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm或0.5mm；dutp的浓度典型但非限制性的为0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm或0.5mm；dgtp的浓度典型但非限制性的为0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm或0.5mm；dctp的浓度典型但非限制性的为0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm或0.5mm。

一些优选地实施方式中，酶包括taq酶和ung酶。本发明提供的酶溶液中含有taq酶，优选hotstarttaq酶，其为pcr反应所必需的，且该酶溶液还含有ung酶。其中ung(uracil-n-glycosylase)酶为尿嘧啶-n-糖基化酶，其特点是最佳活性温度为50℃，95℃灭活，其作用原理是选择性水解断裂含有du的双链或单链dna中的尿嘧啶糖苷键，形成有缺失碱基的dna链。在pcr反应中，使用ung酶可预防非特异性pcr扩增和污染。

一些优选地实施方式中，taq酶和ung酶在pcr体系预混液的总量比为：(0.5u-1.0u)：(0.1u-0.5u)。taq酶和ung酶的总量比典型但非限制性的为0.5u：0.1u、0.5u:0.5u、1.0u:0.1u或1.0u:0.5u。

一些优选地实施方式中，试剂盒还包括阳性对照液和/或空白对照液。

一些优选地实施方式中，阳性对照液包括2种质粒，2种质粒分别包括带有cyp3a5*3a的dna片段和带有cyp3a5*3g的dna片段。该质粒可为本领域技术人员熟知的质粒，这2种质粒浓度可以相同。

一些优选地实施方式中，阳性对照液为2种质粒的混合液。含有2中质粒的阳性对照液利用本发明提供的引物组合物进行检测时，可以同时检测出野生型和突变型位点。该混合液的浓度优选为2000-3000copies/μl。该混合液的浓度典型但非限制性的为2000copies/μl、2200copies/μl、2400copies/μl、2600copies/μl、2800copies/μl或3000copies/μl。该浓度下，可以良好的保证阳性对照液的稳定性，检出率，同时浓度很低，避免了试剂的浪费。

一些实施方式中，空白对照液包括tris-hcl缓冲液，tris-hcl缓冲液的浓度优选为7-13mm，ph优选为7.5-8.5。tris-hcl缓冲液的浓度典型但非限制性的为7mm、9mm、11mm或13mm；ph典型但非限制性的为7.5、8.0或8.5。

本发明提供的试剂盒，检测结果真实可靠，检测过程均为闭管反应，可以显著的降低污染，并加入ung酶也可以防污染。另外，采用人源性内标引物组监测样本质量和操作准确性，并且采用阳性对照和空白对照监测试剂盒质量，避免了假阳性和假阴性结果的发生。同时，检测结果清晰明了易分析，野生型特异性探针，突变型特异性探针和内参特异性探针分别采用不同的荧光标记，三色通道检测，结合结果判读方法，可立即明确得到结论。此外，采用将酶直接与其他试剂混合的形式作为产品，极大地简化了操作流程，试剂盒热稳定性好，混有酶的pcr体系预混液37℃放置24小时，体系性能无明显下降。

一种用于检测cyp3a5基因多态性的方法，应用上述引物组合物、试剂或试剂盒，以待测样本的dna为模板，进行pcr扩增反应并进行基因分型。该方法操作简单，成本低，耗时短，结果准确可靠。

优选地，用于检测cyp3a5基因多态性的引物组合物中，cyp3a5*3位点的上游引物、cyp3a5*3位点的下游引物、cyp3a5*3位点的野生型特异性探针、cyp3a5*3位点的突变型特异性探针的浓度比为0.1μm-1.0μm：0.1μm-1.0μm：0.1μm-1.0μm：0.1μm-1.0μm；

更优选地，当所述引物组合物中还包括用于检测内参gapdh序列的引物组时，seqidno.1-7的所示引物的浓度比为：0.1μm-1.0μm：0.1μm-1.0μm：0.1μm-1.0μm：0.1μm-1.0μm：0.1μm-0.5μm：0.1μm-0.5μm：0.1μm-0.5μm。

优选地，如上所述的方法，待检测样本的dna样品为从edta和/或枸橘酸钠抗凝新鲜全血中提取的人类基因组dna。

该检测方法具体可包括以下步骤：

(1)设计并筛选特异性扩增与检测cyp3a5*3基因多态性的引物组合物；制备本发明的用于检测cyp3a5*3基因多态性的试剂盒。

(2)基因组dna提取。

(3)进行荧光定量pcr扩增：每管中加入含有引物组合物、pcr反应缓冲液、dmso、taq酶和ung酶的pcr体系预混液，加入提取好的基因组dna，并进行pcr反应。

具体地，以25μl反应体系为例，向反应管中加入待检测样品后得到的混合物中各组分终浓度及含量如下：

上述体系仅为例证性，在实际应用中可以按照比例扩大或缩小该混合物体积及其中各组分含量。

具体地，在步骤(3)中的荧光定量pcr反应条件为：

37℃处理10min，95℃预变性5min，

40个循环：95℃15s，60℃60s并收集荧光信号。

在上述pcr反应后，所得结果按表2进行结果判定：

表2结果判定

本发明的检测方法具有灵敏度高、特异性强、结果真实可信的优点，同时该检测方法操作简单快速，能在90min内完成检测，并且结果判读简单客观，便于分析。

本发明同时提供上述引物组合物、试剂或试剂盒在检测钙离子通道阻滞剂类药物的代谢能力中的应用。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1

制备本发明的用于检测cyp3a5基因多态性的试剂盒，包括以下步骤：

a).引物及探针筛选

根据ncbi数据库公布的cyp3a5基因序列，设计多套引物探针组合，分别制备pcr体系，检测同样的野生型及突变型模板，选择扩增灵敏度和特异性均较好的引物探针组合。

b).引物及探针合成：

合成筛选到的引物探针组合，具体包括：cyp3a5*3位点的上、下游引物seqidno:1、seqidno:2，特异性探针seqidno:3与seqidno:4。并在seqidno:3的5’端标记fam荧光基团，3’端标记mgb-nfq不发光淬灭基团；同时在seqidno:3的中间包含目的等位基因的位置进行lna修饰。在seqidno:4的5’端标记vic荧光基团，3’端标记mgb-nfq不发光淬灭基团。将引物、探针分别制备成100μm的母液储存。

c).制备内标系统：设计并合成针对人源性基因gapdh的1对内参引物对，该引物对序列为seqidno:5和seqidno:6；设计并合成内参特异性探针，该探针的序列为seqidno:7。在seqidno:7的5’端标记rox荧光基团，3’端标记bhq2不发光淬灭基团。将该内标引物、内标分别配制成100μm的母液储存。

d).seqidno:1～seqidno:7引物组浓度优化：pcr扩增中引物探针组合的浓度比为0.1μm-1.0μm：0.1μm-1.0μm：0.1μm-1.0μm：0.1μm-1.0μm：0.1μm-0.5μm：0.1μm-0.5μm：0.1μm-0.5μm。为了提高体系的扩增灵敏度和特异性，需要对seqidno:1～seqidno:7的浓度进行细致优化。设计引物探针浓度比为：0.1μm：0.1μm：0.1μm：0.1μm：0.1μm：0.1μm：0.1μm；0.2μm：0.2μm：0.1μm：0.1μm：0.1μm：0.1μm：0.1μm；0.2μm：0.2μm：0.2μm：0.2μm：0.1μm：0.1μm：0.1μm；0.2μm：0.2μm：0.24μm：0.24μm：0.1μm：0.1μm：0.1μm，然后分别配制pcr体系，检测同样的野生型及突变型模板，选择扩增灵敏度和特异性均较好的引物探针浓度组合为0.2μm：0.2μm：0.24μm：0.24μm：0.1μm：0.1μm：0.1μm。

e).制备其他试剂：制备pcr缓冲液，并对pcr缓冲液各组分进行优化。首先调整pcr缓冲液中mgcl2浓度，设置1mm、2mm、3mm、4mm、5mm的mgcl2浓度，分别制备pcr体系，检测同样的野生型及突变型模板，选择扩增灵敏度和特异性均较好的mgcl2浓度为4.0mm。

然后调整pcr缓冲液中datp、dutp、dgtp和dctp的浓度，设置datp、dgtp、dctp和dutp的浓度为：0.1mm、0.1mm、0.1mm、0.2mm；0.15mm、0.15mm、0.15mm、0.3mm；0.2mm、0.2mm、0.2mm、0.4mm，分别制备pcr体系，检测同样的野生型及突变型模板，选择扩增灵敏度和特异性均较好的datp、dutp、dgtp和dctp的浓度为0.15mm、0.15mm、0.15mm、0.3mm。

最后调整pcr缓冲液中dmso的浓度，设置dmso添加量为0.5μl、1μl、2μl，分别制备pcr体系，检测同样的野生型及突变型模板，选择扩增灵敏度和特异性均较好的dmso浓度为0.5μl。

f).混入酶溶液，并对酶溶液浓度进行优化。设置taq酶0.5u、ung酶0.25u；taq酶1.0u、ung酶0.25u；taq酶1.0u、ung酶0.5u，分别制备pcr体系，检测同样的野生型及突变型模板，选择扩增灵敏度和特异性均较好的taq酶1.0u，ung酶0.25u。

g).制备阳性对照液和空白对照液，该阳性对照液中含有2种质粒dna，这些质粒dna中分别含有本发明试剂盒涉及的cyp3a5*3a质粒和cyp3a5*3g质粒2种不同的多态性质粒，该质粒的选择及设计为本领域技术人员熟知，均为2500copies/μl；该空白对照液为tris-hcl(10mm)缓冲液。

h).pcr体系预混液配制：按照下表3进行pcr体系预混液的配制：

表3pcr体系预混液成分

计算20人份各成分使用量，一次加入各组分，充分混匀。

g).组装试剂盒：将试剂盒各组分按顺序组装成成品试剂盒，具体包括1号管cyp3a5*3pcr体系预混液，2号管阳性对照，3号管空白对照。

实施例2

用实施例1制备的试剂盒对待测样品进行检测。

本实施例中收集3例基因组dna，基因型分别为纯合野生、纯合突变、杂合突变型。

1.dna样本稀释

取3例基因组dna样本，稀释至0.05ng/μl。

2.样本的荧光定量pcr检测

将步骤1中样品取2μl分别加入到23μl的实施例1的试剂盒的cyp3a5*3检测pcr体系预混液中，使反应体系总体积为25μl，并放入荧光定量pcr仪，按如下所示设置pcr反应程序后进行扩增反应：

37℃10min；

95℃5min；

95℃15s，60℃60s，40个循环；每个循环后收集fam、vic和rox的荧光信号。

3.样本的检测结果分析:

cyp3a5*3位点a/a纯合野生检测结果如图1所示；

cyp3a5*3位点g/g纯合突变检测结果如图2所示；

cyp3a5*3位点a/g杂合突变检测结果如图3所示；

由图中结果可以看出，检测低至0.05ng/μl的纯合野生型的样本，fam正常扩增，vic无扩增，rox正常扩增，按试剂盒说明书可以判断为纯合野生型；

检测低至0.05ng/μl的纯合突变型的样本，fam无扩增，vic正常扩增，rox正常扩增，按试剂盒说明书可以判断为纯合突变型；

检测低至0.05ng/μl的杂合突变型的样本，fam、vic和rox三通道均正常扩增，按试剂盒说明书可以判断为杂合突变型；

以上结果显示，本发明的试剂盒检测灵敏度可以达到：低至0.1ng(0.05ng/μl，上样2μl)的基因组dna准确检出基因型。本发明检测方法灵敏度高于传统荧光定量pcr法，操作简单快速，利于大规模推广。

实施例3

用实施例1制备的试剂盒对待测样品进行检测。

本实施例中收集2例基因组dna，基因型分别为纯合野生、纯合突变。

1.dna样本制备

取2例基因组dna样本，定量至250ng/μl。

2.样本的荧光定量pcr检测

将步骤1中样品取2μl分别加入到23μl的实施例1的试剂盒的cyp3a5*3检测反应体系中，使反应体系总体积为25μl，并放入荧光定量pcr仪，按如下所示设置pcr反应程序后进行扩增反应：

37℃10min；

95℃5min；

95℃15s，60℃60s，40个循环；每个循环后收集fam、vic和rox的荧光信号。

3.样本的检测结果分析:

cyp3a5*3位点a/a纯合野生检测结果如图4所示；

cyp3a5*3位点g/g纯合突变检测结果如图5所示；

由图中结果可以看出，检测高至250ng/μl的纯合野生型样本，fam正常扩增，vic无扩增，rox正常扩增，按试剂盒说明书可以判断为纯合野生型；

检测高至250ng/μl的纯合突变型样本，fam无扩增，vic正常扩增，rox正常扩增，按试剂盒说明书可以判断为纯合突变型；

以上结果显示，本试剂盒检测500ng(250ng/μl，上样2μl)的基因组dna，依然无非特异扩增，试剂盒可以正常判型，说明试剂盒特异性具有显著提高。

从实施例2和实施例3可以看出，本试剂盒可以检测0.1ng-500ng的基因组dna，试剂盒检测dna浓度范围宽广，对dna样本浓度要求低，利于大规模推广。

为了提高体系的热稳定性，本试剂盒首先对探针序列进行了多种设计，发现调整探针序列不能根本提高体系热稳定性，具体见实施例4。接着本试剂盒又对影响探针稳定性的taq酶进行了多厂家的筛选，发现不同厂家taq酶均不能根本提高体系热稳定性，具体见实施例5。最后本试剂盒对已经采用mgb修饰的探针再进行锁核酸(lna)修饰，最终解决了本试剂盒37℃稳定保存24小时的难题，同时采用锁核酸修饰的探针进一步提高了体系的灵敏度，显著提高了试剂盒的检测性能，具体见实施例6。

实施例4

探针序列筛选实验如下：

1.设计并合成多条野生型探针

cyp3a5*3-wp1：5’-tgtctttcaatatctcttccctg-3’(seqidno.8)

cyp3a5*3-wp2：5’-tgtctttcaatatctcttcc-3’(seqidno.9)

cyp3a5*3-wp3：5’-tgtctttcaatatctcttc-3’(seqidno.3)

合成上述3条探针，其中探针的5’端标记fam荧光基团，3’端标记mgb-nfq不发光淬灭基团。然后将探针制备成100μm母液保存备用。

2.pcr体系制备

按下表4分别用三条探针配制pcr体系

表4pcr体系

然后分别用cyp3a5*3-wp2和cyp3a5*3-wp3按上表同样的配方制备各自pcr体系。上述三条探针仅用于阐述本试剂盒的发明过程，并不是本试剂盒选定的探针。

3.pcr体系热稳定性处理

取制备的3种pcr反应液，各等分成2份，1份-20±5℃保存24小时，1份37℃放置24小时。

4.样本制备

取实施例3制备的纯合野生型基因组dna，稀释至15ng/μl，-20±5℃保存备用。

5.样本的荧光定量pcr检测

将步骤4中样品取2μl分别加入到23μl的步骤3处理的pcr体系，使反应体系总体积为25μl，并放入荧光定量pcr仪，按如下所示设置pcr反应程序后进行扩增反应：

37℃10min；

95℃5min；

95℃15s，60℃60s，40个循环；每个循环后收集fam荧光信号。

6.样本的检测结果分析:

cyp3a5*3-wp1探针制备pcr体系热稳定性检测结果如图6所示；

cyp3a5*3-wp2探针制备pcr体系热稳定性检测结果如图7所示；

cyp3a5*3-wp3探针制备pcr体系热稳定性检测结果如图8所示；

由图中结果可以看出，三条探针制备的pcr体系37℃放置24小时与-20±5℃放置24小时相比，体系性能均有不同程度下降，其中cyp3a5*3-wp3探针性能下降最少，因此选择cyp3a5*3-wp3探针进行后续的探索实验。

实施例5

不同厂家taq酶筛选实验如下：

根据以往研发经验，本试剂盒选择takara的taq酶进行研发实验，为了提高体系热稳定性，本试剂盒另外选择了promega的taq酶进行对比验证。具体步骤如下：

1.pcr体系制备

按实施例4的配方，采用cyp3a5*3-wp3探针和两种厂家的taq酶分别配制pcr体系

2.pcr体系热稳定性处理

取制备的2种pcr反应液，各等分成2份，1份-20±5℃保存24小时，1份37℃放置24小时。

3.样本的荧光定量pcr检测

将实施例4制备的样品取2μl分别加入到23μl的步骤2处理的pcr体系，使反应体系总体积为25μl，并放入荧光定量pcr仪，按如下所示设置pcr反应程序后进行扩增反应：

37℃10min；

95℃5min；

95℃15s，60℃60s，40个循环；每个循环后收集fam荧光信号。

4.样本的检测结果分析:

takara的taq酶制备的pcr体系热稳定性检测结果如图9所示；

promega的taq酶制备的pcr体系热稳定性检测结果如图10所示；

由图中结果可以看出，选择热稳定相对较好的探针与两种厂家的taq酶制备pcr体系，体系37℃放置24小时与-20±5℃放置24小时相比，性能依然有不同程度下降，说明更换taq酶不能根本提高体系热稳定性，需要对探针进行改造。

实施例6

探针改造后热稳定性和检测灵敏度验证实验如下：

经过不断探索，最终选择在cyp3a5*3-wp3探针序列基础上进行lna修饰改造得到本试剂盒最终选择的序列为seqidno.3探针。seqidno.3与cyp3a5*3-wp3探针序列一致，并同时用mgb探针修饰，但是seqidno.3探针还增加了lna修饰。两条探针序列如下：

cyp3a5*3-wp3：5’-fam-tgtctttcaatatctcttc-nfq-mgb-3’

野生型特异性探针：5’-fam-tgtctttca+a+t+a+tctcttc-nfq-mgb-3’。

两条探针对比验证实验步骤如下：

1.pcr体系制备

按实施例1的配方用cyp3a5*3-wp3探针与试剂盒其他组分制备不含lna的pcr体系，同时用本试剂盒的seqidno:3探针与试剂盒其他组分制备含lna的pcr体系(即本发明的试剂盒)。

2.pcr体系热稳定性处理

取制备的2种pcr反应液，各等分成2份，1份-20±5℃保存24小时，1份37℃放置24小时。

3.样本的荧光定量pcr检测

将实施例4制备的样品取2μl分别加入到23μl的步骤2处理的pcr体系，使反应体系总体积为25μl，并放入荧光定量pcr仪，按如下所示设置pcr反应程序后进行扩增反应：

37℃10min；

95℃5min；

95℃15s，60℃60s，40个循环；每个循环后收集fam荧光信号。

4.样本的检测结果分析:

不含lna的pcr体系热稳定性检测结果如图11所示；

含lna的pcr体系热稳定性检测结果如图12所示；

两种体系检测灵敏度对比检测结果如图13所示；

由图中结果可以看出，同样的探针序列经过lna修饰后体系37℃放置24小时的扩增曲线与-20±5℃保存24小时的曲线基本重合，无明显下降；但是未经lna修饰的37℃放置24小时的扩增曲线信号值明显下降，因此在mgb修饰基础上对探针再进行lna修饰可以显著提高体系热稳定性。

同时对比了两个体系扩增效率，发现扩增同样的样本经过lna修饰的体系的扩增曲线信号值提高，ct值明显提前，因此在mgb修饰基础上对探针再进行lna修饰同时可以显著提高体系扩增效率。

综合实施例4-6可以看出，在mgb修饰的基础上再进行lna修饰是提高本试剂盒热稳定性的唯一有效方式。mgb修饰和lna修饰均是探针已有的修饰方式，但将两者组合起来进行探针修饰是本试剂盒首次进行探索发现，未在其他专利或文献中发现有同样的修饰方式。经过这种创新性修饰，本试剂盒显著提高了多重pcr体系的扩增灵敏度和特异性，并解决了试剂盒37℃保存不稳定的难题。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

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