本发明涉及蔬菜贮藏技术领域，具体涉及一种鲜切叶菜菌群测定方法。
背景技术：
鲜切蔬菜是以新鲜蔬菜为原料，经过分拣、清洗、切分、包装等一系列处理后制成的即用或即食的蔬菜制品，具有新鲜、便捷、营养等优点。但鲜切蔬菜本身含水量较高又经过切割等程序，导致汁液流失严重，这些受伤的组织为微生物提供营养，使多种微生物群落得以繁殖，导致腐败，这直接限制了产品流通和货架期，腐败菌对鲜切蔬菜产生破坏的症状主要体现在褐变、产生异味、结构丧失以及在较低程度上的软腐，这极大地影响到消费者的购买欲望。
在鲜切蔬菜的贮藏过程中，肠杆菌、假单胞菌以及乳酸菌等腐败菌的增长与酸味、褐变、软腐有很强的相关性，研究鲜切蔬菜中特定腐败菌的情况，将会对选择适宜的保鲜方式起到重要的指导作用，但目前尚缺少有效的检测方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种能够有效测定鲜切叶菜菌群的方法。
为实现上述目，本发明提供了一种鲜切叶菜菌群测定方法，包括以下步骤：
步骤a：对蔬菜进行清洗，然后使用经灭菌处理的刀具，将蔬菜根部切割去除；在无菌条件下对去除根部后的蔬菜进行随机分装，放入无菌托盘，并用无菌pe保鲜膜包好，置于4℃下贮藏；
步骤b：在无菌条件下，从贮藏的蔬菜中选取不同部位的叶片共10g，置于无菌均质袋中，加入90ml质量浓度为8.5g/l的无菌生理盐水，在无菌均质仪以8次/秒的频率均质1min，静置10min，在高速冷冻离心机中以10000r/min的速度离心10min，弃上清，取10ml沉淀，置于-80℃冻存；使用dna提取试剂盒从上述沉淀中提取细菌基因组dna，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测效果；
步骤c：以上述提取的细菌基因组dna为模板，引物针对16srrna基因v3-v4区合成特异引物，利用341f：cctacgggnggcwgcag；805r：gactachvgggtatctaatcc；引物进行pcr扩增，扩增后的pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测效果；定量量取回收的dna，加入dna稀释液，得到浓度为20pmol的混合样品；对混合样品进行高通量测序；
步骤d：根据高通量测序结果，进行数据质控及过滤，包括：去除引物接头序列、序列拼接、质量剪切、去除非扩增区域序列和嵌合体序列，随后进行blastn比对，在97％的相似水平下进行归类得到分类操作单元，以此得出每个分类操作单元的分类学信息；基于得到的各个分类操作单元，计算香农指数、菌种丰富度指数、辛普森指数、覆盖率指数和ace指数，衡量样品中菌种的多样性，并且通过贝叶斯算法对97％相似水平的分类操作单元的代表序列进行分类学分析，在科、属水平上进行群落丰度统计分析并作图，得到微生物群落结构组成，鉴定优势腐败菌；
其中所述步骤b和步骤c以天为单位重复若干次。
本发明提供的鲜切叶菜菌群测定方法，能够有效检测鲜切叶菜在不同贮藏时期的菌群变化，为鲜切叶菜的防腐杀菌与贮运等提供重要的依据。
具体实施方式
下面以具体实施例为例，详细说明本发明的实施方式。
本实施例以鲜切叶菜中的鲜切菠菜为例，进行鲜切菠菜菌群变化的测定，包括以下步骤：
对菠菜进行清洗，然后使用经灭菌处理的刀具，如不锈钢菜刀，将菠菜根部切割去除，切割位置可选择距根部约3cm处。在无菌条件下，例如在超净工作台中，对菠菜进行随机分装，放入无菌托盘，并用无菌pe保鲜膜包好，置于4℃下贮藏。所用菠菜优选为当天采摘的，并从中选择大小均一、色泽鲜绿、清洁、无明显缺陷、无病虫毒害的。
在无菌条件下，从上述贮藏的菠菜中选取不同部位的菠菜叶片共10g，置于无菌均质袋中，加入90ml质量浓度为8.5g/l的无菌生理盐水，在无菌均质仪以8次/秒的频率均质1min，静置10min，在高速冷冻离心机中以10000r/min的速度离心10min，弃上清，取10ml沉淀，置于-80℃冻存。使用dna提取试剂盒，例如omega试剂盒，从上述沉淀中提取细菌基因组dna，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测效果。该步骤采样时间以天为单位，例如可分别在0d(天)、4d和8d进行。
以上述提取的细菌基因组dna为模板，引物针对16srrna基因v3-v4区合成特异引物，利用341f：cctacgggnggcwgcag；805r：gactachvgggtatctaatcc；引物进行pcr扩增。扩增后的pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测效果。定量量取回收的dna(即经电泳验证后，确定该批由试剂盒提取的dna质量可靠可以进行后续扩增步骤后剩余的dna)，加入dna稀释液，得到浓度为20pmol的混合样品，定量量取可通过qubit3.0dn检测试剂盒进行，浓度可使用qubit3.0荧光定量仪确定。对该混合样品进行高通量测序。
根据高通量测序结果，进行数据质控及过滤，包括：去除引物接头序列、序列拼接、质量剪切、去除非扩增区域序列和嵌合体序列，随后进行blastn比对，在97％的相似水平下进行归类得到分类操作单元(operationaltaxonomicunit，otu)，以此得出每个分类操作单元的分类学信息。基于得到的各个分类操作单元，计算香农指数(shannon)、菌种丰富度指数(chao1)、辛普森指数(simpson)、覆盖率指数(coverage)和ace指数等常用的alpha生物多样性指数，衡量样品中菌种的多样性，并且通过贝叶斯算法对97％相似水平的分类操作单元的代表序列进行分类学分析，在科、属水平上进行群落丰度统计分析并作图，得到微生物群落结构组成，鉴定优势腐败菌。
本实施例一个具体实验的检测结果如下：
如表1所示，三个样品经过测序后分别得到48353、62689、53046条原始序列，经过质量控制、去除非扩增序列和嵌合体序列得到44183、50954、46064条有效序列，各个样品的有效序列分别达到91.4％、81.3％、86.8％，片段长度约428bp，均达到生物信息分析的要求。还可通过构建稀释曲线反映样本的测序数据量是否合理，横坐标代表随机抽取的序列数量，纵坐标代表的是反映物种多样性的shannon指数，当曲线趋于平坦时，说明测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物物种信息。本实验中：当测序数目分别达到44183、50954、46064时，shannon指数分别达到2.19、2.95、2.57，继续增加测序数据量仅产生少量新的otu，此时稀释度曲线趋于平坦，这些表明测序已趋于饱和，具有代表性。
表1测序数据统计结果
在4℃条件下，鲜切菠菜贮藏过程中的alpha多样性指数变化如表2所示。首先，各个样品的coverage指数均大于等于0.95，说明本实验的测序数量充分代表样品的真实情况；从chao1指数、ace指数来看，贮藏4天菠菜表面的菌群丰度最高，其次是0天，最低的是8天；从shannon、simpson指数来看：贮藏4天菠菜表面的菌群多样性也明显高于0天及8天，以上说明：贮存4天的菠菜样品表面的微生物群落结构最为复杂。
表2alpha多样性指数
使用rdpclassifier以及blast分析对已得的otu进行菌种分类，共鉴定到10门，15纲，23目，52科，89属。在科的分类标准下，假单胞菌科和肠杆菌科是在整个贮藏期间的主要菌群结构，二者占比90％以上，为优势腐败菌；而其他分类的菌群丰度较低，都小于2％，这表明菌群的多样性程度较高，而丰度较为集中。从菌群变化的角度来看，随着贮藏时间的推移，假单胞菌科的丰度呈递增趋势，从初始丰度的48.99％到贮藏末期的70.27％；而肠杆菌科则从初始丰度的48.62％不断递减至21.75％，其余菌群的微生物均保持在较低丰度。
不同贮藏天数鲜切菠菜表面的微生物，在属的分类标准下共分离得到89个属。在科水平下为优势腐败菌的假单胞菌科，在属的分类下包括：假单胞菌属(pseudomonas)、氮单孢菌属(azomonas)，对于肠杆菌科，在属的分类下主要包括：泛菌属(pantoea)、欧文氏菌属(erwinia)、布丘氏菌属(buttiauxella)、沙门氏菌属(salmonella)、沙雷氏菌属(serratia)，除了上述几种外，丰度靠前的还有氮单孢菌属(azomonas)、不动杆菌属(acinetobacter)、微小杆菌属(exiguobacterium)、寡养单胞菌属(stenotrophomonas)等。假单胞菌属、泛菌属是鲜切菠菜的初始优势菌属，丰度分别达到47.84％、30.7％，而欧文氏菌属、布丘氏菌属为次优势菌属，丰度为8.09％和4.64％；到了贮存中期，假单胞菌属的丰度上升至58.25％，泛菌属丰度下降至13.94％，欧文氏菌属丰度基本保持不变为8.69％、布丘氏菌属丰度小幅上升至9.73％；贮存末期，假单胞菌属占绝对优势，丰度占比68.97％，而泛菌属丰度仅占5.4％，欧文氏菌属占比10.7％，布丘氏菌属占比4％。
检测结果表明，鲜切菠菜在不同贮藏时期的微生物多样性以及丰度存在较大差异，共鉴定到10门，15纲，23目，52科，89属，其中假单胞菌科和肠杆菌科为优势菌科。在属水平上，假单胞菌属(47.84％)、泛菌属(30.7％)、欧文氏菌属(8.09％)、布丘氏菌属(4.64％)是鲜切菠菜的主要初始菌群结构，到了贮存中后期，假单胞菌属丰度不断上升至68.97％，成为导致鲜切菠菜腐败的主要菌属，泛菌属、欧文氏菌属、布丘氏菌属成为次要腐败菌。
从前文描述可知，本发明提供的鲜切叶菜菌群测定方法能够全面地检测鲜切叶菜在不同贮藏时期的主要腐败菌及其演替规律，解析腐败菌的组成、生理生化特性、丰度及多样性，以此为鲜切叶菜的防腐杀菌与贮运等提供重要的依据。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。