一种辣木根多糖MRP-1及其提取纯化方法以及应用与流程

本发明属于天然化学领域，具体涉及一种辣木根多糖mrp-1及其提取纯化方法以及应用。
背景技术：
：辣木又被称作鼓槌树、辣根树，原产于印度北部，是一种多年生热带、亚热带落叶乔木，在全世界范围内共有14个品种，广泛种植在亚洲、非洲热带和亚热带地区。辣木的叶、花、籽、根以及种子都可以直接食用，具有高钙、高蛋白质、高纤维和低脂质的特性。除食用价值较高外，辣木还能够增强人体免疫力，促进身体健康，预防疾病，在印度、非洲等国家或地区用于治疗疾病，被称为保健之宝。临床证明，辣木在治疗糖尿病、骨质疏松、高血压、预防感染、抗病毒、抗炎症、抗肿瘤等方面也发挥着重要作用。免疫调节是指在各种因素的影响下，机体的免疫应答适度，以维持机体内环境的相对稳定。在机体免疫功能低下的情况下，免疫增强剂可以使低下的免疫功能提高，增强机体的抗肿瘤作用、抗感染能力等。因此，免疫增强剂在临床上可用于免疫缺陷疾病、恶性肿瘤的辅助治疗以及难治性病原菌的感染等，或者可作为佐剂用于新型疫苗的研发。目前辣木多糖的提取和应用主要集中在辣木叶多糖的提取和应用上面，其提取工艺主要有热水浸提法、酸碱提取法。如陈瑞娇提出以1:20料液比，80℃水浴提取3次，每次1.5h，可以使辣木多糖的提取率达到15.86％，此法虽然工艺简单，但提取耗时较长；还有相关研究证明也可以使用热水浸提-稀碱溶液连用法进行辣木多糖的提取，但提取得到的多糖水溶性较差，并且碱法提取条件严格，较难达到预期效果。目前对辣木叶多糖的功能研究多集中在辣木叶多糖的抗氧化活性和抗炎活性的研究。辣木根作为辣木的一种主要组织，其1.5-2年内生的根组织肥厚、鲜嫩，直接食用有辛辣味，其目前主要将其用于饮食中煲汤的食材。然而对于其根组织中粗多糖的提取、其组分的分离纯化、结构的鉴定及生物学功能尚未进行报道。技术实现要素：本发明的主要目的是针对现有技术的缺点，提出一种辣木根多糖mrp-1及其提取纯化方法以及应用。为达上述目的，本发明依据下述的技术方案实现。一种辣木根多糖mrp-1，所述辣木根多糖mrp-1单糖组成比例为鼠李糖:阿拉伯糖：果糖：木糖：甘露糖：半乳糖＝1.5:2.0:3.1:6.0:5.3:1.1。本发明的再一目的在于提供该辣木根多糖mrp-1的提取纯化方法，包括如下步骤：1)、取原料辣木根，切成片状后，按料液比1:10-1:20的比例加入去离子水，超声-微波提取20-30分钟后，沸水煮2-3个小时，过滤去渣得提取液，将提取液蒸发浓缩后，加入无水乙醇，于0-4℃下沉淀过夜；离心取沉淀，用去离子水将沉淀复溶后，利用sevag法脱蛋白，重复3-5次，得到辣木根粗多糖组分；2)、将步骤1)得到的辣木根粗多糖组分经q-sepharosefastflow离子交换柱层析分离，收集洗脱组分；3)、将步骤2)收集得到的洗脱组分经3500da的透析袋透析脱盐，并通过真空冷冻干燥，得到辣木根多糖mrp-1的粉末样品。进一步的，所述步骤2)中辣木根多糖组分采用2-4mg/ml的质量浓度上样到q-sepharosefastflow离子交换柱，再分别以蒸馏水、0.1mnacl溶液、0.2mnacl溶液、0.4m的nacl溶液洗脱，洗脱流速为1ml/min，并收集0.2mnacl溶液的洗脱组分。进一步的，所述步骤1)中待提取液蒸发至40-50ml后，缓慢加入与浓缩液等体积的无水乙醇。本发明的还一目的在于提供该辣木叶多糖mrp-1的应用，所述的辣木根多糖mrp-1在制备免疫增强剂的应用。所述的辣木根多糖mrp-1在制备疫苗佐剂中的应用。与现有技术相比，本发明有如下优点和效果：辣木根组织肥厚，其有效成分提取纯化相对困难，现有技术中没有针对辣木根进行提取多糖，而本发明采用热水浸提法从辣木根中提取多糖，并通过去蛋白、离子交换柱层析、透析对多糖进行分离纯化，得到纯化的多糖组分mrp-1，其得率可达到10％，且通过鉴定结果显示，辣木根多糖mrp-1为较纯的碳水化合物类物质，无明显杂质出现。本发明分离纯化得到的辣木根多糖组分mrp-1能够促进细胞因子il-2、il-4、il-5和ifn-γ的产生，可显著提高免疫抑制性小鼠血清中il-2和tnf-α的水平，具有良好的免疫增强活性，可以用作例如化疗、感冒生病等免疫力低下人群的免疫增强制剂或者应用在疫苗佐剂中。附图说明图1为本发明基于气相-质谱(gc-ms)对辣木根多糖mrp-1组分的单糖组成分析结果图；图2为本发明所述辣木根多糖mrp-1组分的q-sepharosefastflow分离纯化的洗脱曲线；图3为本发明所述辣木根多糖mpr-1的傅里叶红外光谱图；图4为本发明所述辣木根多糖mrp-1组分对小鼠腹腔巨噬细胞raw264.7的细胞因子产生的刺激作用。具体实施方式以下结合相关附图和具体实施例对本发明做进一步地详细描述，但本发明的实施方式不因此而限定于以下实施例。如图1所示，图1为本发明基于气相-质谱(gc-ms)对辣木根多糖mrp-1组分的单糖组成分析结果图。一种辣木根多糖mrp-1，所述辣木根多糖mrp-1单糖组成比例为鼠李糖:阿拉伯糖：果糖：木糖：甘露糖：半乳糖＝1.5:2.0:3.1:6.0:5.3:1.1。该辣木根多糖的提取纯化工艺通过以下实施例来说明。实施例1一种辣木根多糖mrp-1的提取纯化工艺，包括如下步骤：1)、取原料辣木根100g，切成片状后，按料液比1:10的比例加入去离子水1000ml，超声-微波提取20分钟后，沸水煮2个小时，过滤去渣得提取液，将提取液经过旋转蒸发仪蒸发浓缩，待提取液蒸发至50ml后，缓慢加入与浓缩液等体积的无水乙醇，于4℃下沉淀过夜；离心取沉淀，用去离子水将沉淀复溶后，利用sevag法(v氯仿:v正丁醇＝4:1)脱蛋白，重复3次，得到辣木根粗多糖组分；2)、将步骤1)得到的辣木根多糖组分用水充分复溶，采用2mg/ml的质量浓度上样到q-sepharosefastflow离子交换柱(柱填料为强碱阴离子三甲胺基烷基季铵基，xk50/30层析柱，柱床高5cm)，再分别以蒸馏水、0.1mnacl溶液、0.2mnacl溶液、0.4m的nacl溶液洗脱，控制洗脱流速为1ml/min，每个洗脱组分收集10管，每管收集1ml，收集0.2mnacl溶液的洗脱组分；即为mrp-1，同时采用苯酚-硫酸法测定各收集管洗脱液的多糖浓度，以洗脱体积为横坐标，以各洗脱体积对应的多糖浓度为纵坐标绘制洗脱曲线。如图2为本发明所述辣木根多糖mrp-1组分的q-sepharosefastflow分离纯化的洗脱曲线。3)、将步骤2)收集得到的洗脱组分经3500da的透析袋透析脱盐，并通过真空冷冻干燥，得到辣木根多糖mrp-1的粉末样品。实施例2一种辣木根多糖mrp-1的提取纯化工艺，包括如下步骤：1)、取原料辣木根100g，切成片状后，按料液比1:20的比例加入去离子水2000ml，超声-微波提取20分钟后，沸水煮3个小时，过滤去渣得提取液，将提取液经过旋转蒸发仪蒸发浓缩，待提取液蒸发至40ml后，缓慢加入与浓缩液等体积的无水乙醇，于3℃下沉淀过夜；离心取沉淀，用去离子水将沉淀复溶后，利用sevag法(v氯仿:v正丁醇＝4:1)脱蛋白，重复5次，得到辣木根粗多糖组分；2)、将步骤1)得到的辣木根多糖组分用去离子水充分复溶，采用4mg/ml的质量浓度上样到q-sepharosefastflow离子交换柱(柱填料为强碱阴离子三甲胺基烷基季铵基，xk50/30层析柱，柱床高5cm)，再分别以蒸馏水、0.1mnacl溶液、0.2mnacl溶液、0.4m的nacl溶液洗脱，控制洗脱流速为1ml/min，每个洗脱组分收集10管，每管收集1ml，收集0.2mnacl溶液的洗脱组分；即为mrp-1。3)、将步骤2)收集得到的洗脱组分经3500da的透析袋透析脱盐，并通过真空冷冻干燥，得到辣木根多糖mrp-1的粉末样品。实施例3一种辣木根多糖mrp-1的提取纯化工艺，包括如下步骤：1)、取原料辣木根100g，切成片状后，按料液比1:15的比例加入去离子水1500ml，超声-微波提取25分钟后，沸水煮2.5个小时，过滤去渣得提取液，将提取液经过旋转蒸发仪蒸发浓缩，待提取液蒸发至45ml后，缓慢加入与浓缩液等体积的无水乙醇，于4℃下沉淀过夜；离心取沉淀，用去离子水将沉淀复溶后，利用sevag法(v氯仿:v正丁醇＝4:1)脱蛋白，重复5次，得到辣木根粗多糖组分；2)、将步骤1)得到的辣木根多糖组分用去离子水充分复溶，采用4mg/ml的质量浓度上样到q-sepharosefastflow离子交换柱(柱填料为强碱阴离子三甲胺基烷基季铵基，xk50/30层析柱，柱床高5cm)，再分别以蒸馏水、0.1mnacl溶液、0.2mnacl溶液、0.4m的nacl溶液洗脱，控制洗脱流速为1ml/min，每个洗脱组分收集10管，每管收集1ml，收集0.2mnacl溶液的洗脱组分；即为mrp-1。3)、将步骤2)收集得到的洗脱组分经3500da的透析袋透析脱盐，并通过真空冷冻干燥，得到辣木根多糖mrp-1的粉末样品。辣木根中也含有多糖，但是多糖含量较少，提取困难、纯化难度也很大，与传统工艺相比，本发明采用强阴离子(三甲胺基烷基季铵基)交换柱层析可以使载量在很宽的ph范围内保持恒定，能提高层析柱对多糖的吸附能力，通过上述方法可得到单一的mrp-1多糖组分，纯化效率高，纯化的效果好。下面对本实施例1中的辣木根多糖mrp-1的单糖组成分析称取5mg辣木根多糖mrp-1，溶解于3ml的2m三氟乙酸中，封口，于100℃下水解4h，70℃下挥干三氟乙酸，向水解的样品中加入5mg盐酸羟胺和0.25ml的吡啶，90℃水浴振荡30min，样品冷却至室温，然后加入0.25ml乙酸酐，90℃水浴振荡30min，冷却至室温。将反应产物于70℃水浴中用氮吹仪吹干后复溶于800μl的氯仿中，取1μl进行gc-ms分析。采用外标法定量分析单糖组分，7种单糖标准品分别为木糖、鼠李糖、甘露糖、果糖、阿拉伯糖、葡萄糖以及半乳糖。将混合单糖标准品配成浓度为25，50，100，200，400μg/ml的储备液，同样条件下进行乙酰化处理。将标准糖样品与mrp-1多糖样品用于gc-ms分析。以质量浓度cμg/ml)为横坐标，衍生物的峰面积为纵坐标做出单糖线性回归方程，由此计算出mrp-1中所含各单糖的含量。结果如图1所示。由gc-ms结果可知，mrp-1多糖组分的主要单糖组成比例为鼠李糖:阿拉伯糖：果糖：木糖：甘露糖：半乳糖＝1.5:2.0:3.1:6.0:5.3:1.1。其单糖组成中,木糖和甘露糖比例最高，不含有葡萄糖。下面是对实施例1中的辣木根多糖mrp-1的傅里叶红外光谱分析对辣木根多糖mrp-1进行傅里叶红外光谱分析(德国bruker，型号vertex7.0)。该多糖在3413.90cm-1处为o-h的典型伸缩振动峰；2939.52cm-1处为-ch标志性伸缩振动峰；2162.41cm-1处为累积双键伸缩振动峰；1741.61cm-1处和1610.70cm-1为c＝o典型伸缩振动峰；1416.18cm-1和1329.99cm-1处具有c-h伸缩振动峰；1248.84cm-1和1018.22cm-1处为吡喃环结构伸缩振动峰；在1329.99cm-1处吸收峰为＝ch2的变性伸缩峰，956.11cm-1和832.95cm-1处伸缩振动峰说明mrp-1存在β-糖苷键结构；766.27cm-1处伸缩振动峰说明mrp-1存在α-糖苷键结构。应用例1辣木根多糖mrp-1对小鼠腹腔巨噬细胞raw264.7的细胞因子产生的刺激作用将细胞数量为6×104/孔的小鼠腹腔巨噬细胞raw264.7接种于96孔板中，100μl/孔。分别设置空白组、lps刺激组、不同浓度样品组(12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)，于二氧化碳培养箱中(37℃，5％co2)培养24h后，取细胞上清液，利用elisa方法，分别测定细胞上清液中il-2、il-4、il-5和ifn-γ的含量。结果如下图4所示。如图4所示，辣木根多糖组分mrp-1在25-200μg/ml浓度范围内均对小鼠腹腔巨噬细胞raw264.7的细胞因子il-2、il-4、il-5和ifn-γ的产生有不同程度的刺激作用。应用例2辣木根多糖组分mrp-1对免疫抑制小鼠血清中il-2和tnf-α水平的刺激作用将30只重20kg左右的小鼠分成6个实验组，每组5只小鼠，分别设置空白对照组，环磷酰胺对照组、不同浓度mrp-1样品组(50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg)。环磷酰胺对照组(100mg/kg)和不同浓度mrp-1样品组小鼠连续5天腹腔注射环磷酰胺(50mg/kg)，空白对照组给予等体积生理盐水。第六天开始，对小鼠连续灌胃10天，每天1次，空白对照组和环磷酰胺组用生理盐水灌胃，样品中分别用不同浓度的mrp-1多糖样品灌胃。灌胃结束后，收集小鼠眼球血液，按照il-2il-2和tnf-α的elisa检测试剂盒检测两种细胞因子的含量。环磷酰胺是临床常用的抗肿瘤药物，该药在体外无活性，进入体内后在肝脏或血液中进行活化，生产烷基化的代谢产物，进而发挥抗肿瘤的作用，其主要副作用就是对免疫系统的抑制作用，能抑制血清中il-2和tnf-α细胞因子的含量。表1为辣木根多糖mrp-1对小鼠血清中il-2和tnf-α细胞因子的刺激作用表1组别剂量mg/kgil-2mg/ltnf-αmg/l空白对照(生理盐水)——155.30186.33环磷酰胺50mg/kg119.56147.30mrp-1(低剂量)50mg/kg131.22163.53mrp-1(中剂量)100mg/kg150.60182.51mrp-1(高剂量)200mg/kg154.91185.33如表1所示，辣木根多糖组分mrp-1在50mg/kg-200mg/kg范围内，均能显著提高免疫抑制小鼠血清中il-2和tnf-α的水平，可达到空白对照水平。通过采用热水浸提、醇沉、阴离子交换柱层析、透析等方法对辣木根多糖进一步分离纯化得到单一组分的辣木根多糖mrp-1，并通过对其进行单糖组成分析，得出该辣木根多糖mrp-1的单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、木糖、甘露糖、半乳糖，并通过红外光谱分析进行表征。通过实施例4的实验得出辣木根多糖组分mrp-1在25-100μg/ml浓度范围内均对小鼠腹腔巨噬细胞raw264.7的细胞细胞因子il-2、il-4、il-5和ifn-γ的产生有不同程度的刺激作用，实施例5表明辣木根多糖组分mrp-1在50mg/kg-200mg/kg范围内，均能显著提高免疫抑制小鼠血清中il-2和tnf-α的水平，本发明的辣木根多糖组分具有良好的免疫增强活性，可以用作例如化疗、感冒生病等免疫力低下人群的免疫增强制剂或者应用在疫苗佐剂中。本发明的具体实施例仅是为清楚说地明本发明所作的举例，而并非是对本发明实施方式的限定。对于相应领域的技术工人来说，在上述说明的基础上还可以做出类似的变动，在权利要求范围内的变动也均可实现，此处无法且无需对所有实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内作出的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。当前第1页12