短直链淀粉-赖氨酸纳米颗粒的制备方法与流程

本发明涉及纳米颗粒的制备领域，具体涉及短直链淀粉-赖氨酸纳米颗粒的制备方法。

背景技术：

现在主要的有机纳米颗粒是工程纳米颗粒，如脂质纳米颗粒、蛋白质纳米颗粒和碳水化合物纳米颗粒。天然有机纳米颗粒更适合于食品工业的应用，因此，开发有机纳米颗粒引起了人们的极大兴趣，尤其是利用天然材料开发纳米颗粒。但是，天然纳米颗粒具有纯度低、分离困难等缺点。目前，开发有机工程纳米颗粒的方法包括纳米沉淀、自组装、乳化交联和酶促褐变等。有研究表明，短直链淀粉中含有大量羰基，因此可能与氨基酸发生美拉德反应。对于美拉德反应制备纳米颗粒，目前的研究主要集中于通过美拉德反应对生物大分子进行修饰，然后通过疏水相互作用、离子凝胶化、自组装等多种方法制备纳米颗粒。例如，酪蛋白首先与葡聚糖共轭，然后与β-胡萝卜素通过疏水相互作用制备纳米颗粒。此外，也有报道将果糖通过美拉德反应接枝到壳聚糖上，再用改性壳聚糖与三聚磷酸钠通过离子凝胶法制备纳米颗粒。这些反应严格上来讲都属于美拉德反应的第一阶段席夫碱反应，目的是将大分子进行改性，在通过其它多种方法制备纳米颗粒。然而，直接通过美拉德反应制备纳米颗粒的报道很少。

技术实现要素：

针对现有的利用美拉德反应制备淀粉纳米颗粒的方法主要是通过美拉德反应对生物大分子进行修饰，然后通过疏水相互作用、离子凝胶化、自组装等多种方法制备纳米颗粒的上述问题，本发明提供一种直接通过美拉德反应制备短直链淀粉-赖氨酸纳米颗粒的方法，利用美拉德反应，直接制备短直链淀粉-氨基酸纳米颗粒，制备方法简单，无污染。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种短直链淀粉-赖氨酸纳米颗粒的制备方法，步骤如下：

(1)首先配制5-15g/100ml蜡质玉米淀粉乳，并向其中加入普鲁兰酶进行脱支，50-60℃水浴24-48h酶解，得到短直链淀粉溶液；离心，加入无水乙醇，沉淀离心，冷冻干燥，得到短直链淀粉粉末；

(2)将上步骤的得到的短直链淀粉配成10-15g/100ml水溶液，然后加入赖氨酸粉末，调节溶液ph＝10-12，80-100℃反应36-72h，保证美拉德反应进行到最后，得到纳米颗粒溶液，将溶液冷冻干燥，得到短直链淀粉-赖氨酸纳米颗粒。

进一步地，步骤(1)水浴完成后离心弃去下层沉淀得上清液，10-20min沸水浴灭酶，再次离心弃去失活酶。

进一步地，步骤(1)离心时3500-10000r/min离心1-3min。

进一步地，步骤(1)加入无水乙醇沉淀离心后弃去下层沉淀得上清夜。

进一步地，步骤(2)加入赖氨酸粉末浓度为5-15g/100ml。

进一步地，步骤(2)反应温度为80℃，反应时间36-48h。

进一步地，步骤(2)得到的纳米颗粒溶液用截留分子量3500da的透析袋透析72h。

进一步地，所述冻干工艺为：真空度5-10pa，温度-80--60℃，时间48-72小时。

与现有的方法通过美拉德反应的第一阶段席夫碱反应将大分子进行改性，再通过其它多种方法制备纳米颗粒相比，本发明利用充分的美拉德反应，通过短直链淀粉中的羰基和赖氨酸中氨基反应，直接制得短直链淀粉-赖氨酸纳米颗粒，制备方法简单，环境友好，产品具有较高的抗氧化性。

附图说明

图1为实施例1-3不同短直链淀粉与赖氨酸质量比制得的纳米颗粒的粒径图；

图2为实施例1-3不同短直链淀粉与赖氨酸质量比制备的纳米颗粒的透射图；

图3为实施例1-3不同短直链淀粉与赖氨酸质量比制备的纳米颗粒纳米追踪分析图，a、b、c分别为短直链淀粉与赖氨酸质量比1：2、1：1、3：2制备的纳米颗粒的浓度图，a、b、c分别为短直链淀粉与赖氨酸质量比1：2、1：1、3：2制备的纳米颗粒的尺寸分布图；

图4为实施例1-3不同短直链淀粉与赖氨酸质量比制备的纳米颗粒紫外-可见光谱图；

图5为实施例1-3不同短直链淀粉与赖氨酸质量比制备的纳米颗粒x衍射图；

图6为实施例3中制备的短直链淀粉-赖氨酸纳米颗粒的核磁共振氢谱图；

图7为实施例1-3不同短直链淀粉与赖氨酸质量比制备的纳米颗粒dpph清除率曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。

实施例1

按照如下步骤制备短直链淀粉与赖氨酸重量比为1:2的纳米颗粒：

(1)短直链淀粉的制备：准确称量一定质量的蜡质玉米淀粉，加水配成5g/100ml淀粉乳，沸水浴40分钟使其糊化完全，边沸边搅拌，粘稠过后可间断搅拌。糊化完成后冷却至58℃，加入普鲁兰酶(10aspu/g)进行脱支，水浴24h。脱支后，后3500r/min离心2min，弃去下层沉淀得到上清液，20min沸水浴灭酶，再次离心弃去絮状失活酶，得到短直链淀粉溶液。用无水乙醇将短直链沉淀后3500r/min离心15min，弃去下层沉淀得到上清液，8pa、-80℃下冻干50小时得到短直链淀粉粉末。

(2)短直链淀粉-赖氨酸纳米颗粒的制备：首先将上步骤的得到的短直链淀粉配成10g/100ml水溶液，然后加入相当于短直链淀粉干粉重50％的赖氨酸粉末，用3m的naoh调节溶液的ph＝10，将混合溶液放在烘箱中80℃反应36h，在反应过程中，保持溶液的ph＝10。反应结束后，将得到的纳米颗粒溶液用截留分子量为3500da的透析袋透析72h，每隔12h更换一次去离子水。透析后的溶液10pa，-60℃冷冻60h得到短直链淀粉-赖氨酸纳米颗粒(sl-nps)。

实施例2

按照如下步骤制备短直链淀粉与赖氨酸重量比为1:1的纳米颗粒：

(1)短直链淀粉的制备：准确称量一定质量的蜡质玉米淀粉，加水配成10g/100ml淀粉乳，沸水浴40min使其糊化完全，边沸边搅拌，粘稠过后可间断搅拌。糊化完成后冷却至58℃，加入普鲁兰酶(10aspu/g)进行脱支，水浴36h。脱支后，后3500r/min离心2min，弃去下层沉淀得到上清液，20min沸水浴灭酶，再次离心弃去絮状失活酶，得到短直链淀粉溶液。用无水乙醇将短直链沉淀后3500r/min离心15min，弃去下层沉淀得到上清液，8pa、-80℃下冻干50小时得到短直链淀粉粉末。

(2)短直链淀粉-赖氨酸纳米颗粒的制备：首先将上步骤的得到的短直链淀粉配成10g/100ml水溶液，然后加入相当于短直链淀粉干粉重100％的赖氨酸粉末，用3m的naoh调节溶液的ph＝10，将混合溶液放在烘箱中80℃反应48h，在反应过程中，保持溶液的ph＝10。反应结束后，将得到的纳米颗粒溶液用截留分子量为3500da的透析袋透析72h，每隔12h更换一次去离子水。透析后的溶液10pa，-60℃冷冻60h得到短直链淀粉-赖氨酸纳米颗粒(sl-nps)。

实施例3

按照如下步骤制备短直链淀粉与赖氨酸重量比为3:2的纳米颗粒：

(1)短直链淀粉的制备：准确称量一定质量的蜡质玉米淀粉，加水配成10g/100ml淀粉乳，沸水浴30min使其糊化完全，边沸边搅拌，粘稠过后可间断搅拌。糊化完成后冷却至58℃，加入普鲁兰酶(10aspu/g)进行脱支，水浴36h。脱支后，后3500r/min离心2min，弃去下层沉淀得到上清液，15min沸水浴灭酶，再次离心弃去絮状失活酶，得到短直链淀粉溶液。用无水乙醇将短直链沉淀后3500r/min离心15min，弃去下层沉淀得到上清液，8pa、-80℃下冻干60h得到短直链淀粉粉末。

(2)短直链淀粉-赖氨酸纳米颗粒的制备：首先将上步骤的得到的短直链淀粉配成10g/100ml水溶液，然后加入相当于短直链淀粉干粉重150％的赖氨酸粉末，用3m的naoh调节溶液的ph＝11，将混合溶液放在烘箱中80℃反应48h，在反应过程中，保持溶液的ph＝11。反应结束后，将得到的纳米颗粒溶液用截留分子量为3500da的透析袋透析72h，每隔12h更换一次去离子水。透析后的溶液5pa，-80℃冷冻72h得到短直链淀粉-赖氨酸纳米颗粒。

对实施例1-3所制备的短直链淀粉-赖氨酸纳米颗粒进行性能检测：

(1)纳米颗粒粒径与电位检测：将制得的短直链淀粉-赖氨酸纳米颗粒分散在超纯水中，用激光动态光散射测定其粒径与电位

表1短直链淀粉-赖氨酸纳米颗粒粒径及电位

图1为不同短直链淀粉与赖氨酸质量比制得的纳米颗粒的粒径图。由表1及图1可见，纳米颗粒的粒径为110-150nm，随着短直链淀粉比例的增加，纳米颗粒的粒径增大，并且带负电荷。

(2)纳米颗粒的形貌检测：将制得的短直链淀粉-赖氨酸纳米颗粒分散于超纯水中，制成浓度为0.1％的悬浮液，滴于带有碳支持膜的铜网上，再将铜网冷冻干燥测定。图2为不同短直链淀粉与赖氨酸质量比制备的纳米颗粒的透射图，如图2可见，纳米颗粒为规则的球形形貌，且分散性良好。

(3)颗粒浓度和尺寸分布检测：将制得的纳米颗粒分散在超纯水中，用纳米追踪分析仪检测颗粒浓度和尺寸分布。图3为不同短直链淀粉与赖氨酸质量比制备的纳米颗粒纳米追踪分析图，a、b、c分别为短直链淀粉与赖氨酸质量比1:2、1:1、3:2制备的纳米颗粒的浓度图，a、b、c分别为短直链淀粉与赖氨酸质量比1:2、1:1、3:2制备的纳米颗粒的尺寸分布图，如图3可见，短直链淀粉与赖氨酸质量比为1:2、1:1、3:2制备的纳米颗粒的颗粒浓度分别为3.0×10⁷、1.6×10⁷、2.5×10⁷/ml，尺寸分布主要集中在100-300nm。

(4)紫外-可见光谱检测：对纳米颗粒的溶液进行紫外-可见光谱扫描，扫描的波长范围为380-900nm。如图4可见，纳米颗粒的最大吸收波长为420nm，并且随着短直链淀粉的增加，最大吸收波长发生红移，说明褐变程度加深。

(5)x衍射检测：对纳米颗粒粉末进行x衍射分析，扫描范围(2θ)为4-40°。如图5可见，短直链淀粉为无定形结构，赖氨酸具有一定的结晶结构，二者发生美拉德反应后，得到的短直链淀粉-赖氨酸纳米颗粒为无定形结构。纳米颗粒在21.73°处有一个弥散峰，这归因于高度无序的碳原子。结果也说明美拉德反应能够降低反应物的结晶性。

(6)核磁共振氢谱检测：将实施例1制得的短直链淀粉-赖氨酸纳米颗粒准确称量20mg，分散在1mld2o中，混合均匀后测定核磁共振氢谱。如图6可见，在1.75ppm处出现一个新的信号，是由于席夫碱基(-n＝ch-)产生的，说明短直链的羰基和赖氨酸的氨基之间成功发生了美拉德反应。

(7)抗氧化性检测:短直链淀粉-赖氨酸纳米颗粒的抗氧化性是通过1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph)自由基清除率来测定的。将不同浓度(20,40,60,80,100,200,300,400,and500μg/ml)的短直链淀粉-赖氨酸纳米颗粒与等体积的0.2mm的dpph无水乙醇溶液混合，室温下暗处理30min后，测定其在570nm处的吸光值。半抑制浓度(ic50)是指清除50％自由基活性时纳米颗粒的浓度。dpph的清除率通过以下公式计算：

dpph清除率(％)＝[1-(abs样品-abs空白)/abs对照]×100.

式中，纳米颗粒溶液加入dpph溶液作为样品；纳米颗粒溶液加入无水乙醇作为空白；无水乙醇加入dpph溶液作为对照。

如图7可见，与短直链淀粉和赖氨酸粉末相比，短直链淀粉-赖氨酸纳米颗粒的抗氧化性明显增强，当短直链淀粉与赖氨酸的质量比为3：2制备的纳米颗粒浓度为500μg/ml时，dpph清除率可达到99％，显示出较强的抗氧化性。另外，当短直链淀粉与赖氨酸质量比1：2、1：1、3：2时，制备的纳米颗粒对dpph自由基的半抑制浓度ic50分别为308.89、188.07、128.81μg/ml。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。