抗人PD-L1单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明涉生物医药领域。更具体地，涉及到一种抗人pd-l1的单克隆抗体及其应用。

背景技术：

癌症是目前导致人类死亡率最高的疾病之一。据世界卫生组织统计，2012年全球恶性肿瘤发病和死亡病例数达到1400万和820万，中国新诊断癌症病例为307万，死亡人数220万。近年，针对免疫检查点的抗体药物研发被认为是有望攻克各类癌症的潜在靶点。

pd-1和pd-l1全称分别为程序性死亡受体1(programmedcelldeath-1)和程序性死亡受体-配体1(programmedcelldeath-ligand1)，作为免疫球蛋白超家族协同刺激分子的重要成员，主要参与自身免疫、肿瘤免疫等机体免疫调节过程。已有研究发现，pd-1是大小为40kda的i型跨膜蛋白，主要表达在活化t细胞上的抑制性受体，与其配体pd-l1结合后，可显著抑制t细胞的活化和增殖。目前已知pd-1的配体有两个，分别是pd-l1(又称b7-h1)和pd-l2(又称b7-dc)。人pd-l1基因定位于染色体9p24，是编码290个氨基酸的i型跨膜蛋白，由胞外区igv、igc结构域、疏水性跨膜结构域及30个氨基酸的胞内域组成。pd-l1广泛表达在多种免疫细胞、上皮细胞和肿瘤细胞表面。而pd-l2主要表达在免疫细胞表面。

目前的研究发现，pd-l1在肿瘤细胞表面的表达则成为了肿瘤逃脱免疫细胞追杀造成肿瘤生长的驱动因素，肿瘤细胞通过高表达pd-l1分子，与t细胞表面的受体pd-1结合，传递负调控信号，抑制肿瘤抗原特异性t细胞的活化和增殖，从而逃避机体的免疫监控和杀伤。近年来，利用靶向pd-1/pd-l1蛋白的单克隆抗体药物，通过阻断pd-1/pd-l1的结合，进而促进体内t细胞的活化和增殖，达到杀伤肿瘤细胞的目的，已在多种肿瘤，如黑色素瘤、淋巴癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈癌、结肠癌等治疗应用，取得显著的疗效。肿瘤免疫治疗已成为世界范围的研究热点和新药研发方向之一。但当这一治疗落实到临床实践中时，就提出了很多的问题。如nccn指南中明确提出对于无明确驱动基因突变的初诊的晚期nsclc肺癌患者可以进行pd-l1的检测，如果pd-l1表达≥50％，初始治疗可以选择pd-1单抗。因此，研究pd-l1在肿瘤中的表达对于肿瘤的致病机理及治疗预后具有重要的科学意义和临床价值。

技术实现要素：

本发明提供了一种特异性结合pd-l1的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中，所述pd-l1是人源pd-l1。

优选的，所述单克隆抗体或其抗原结合部分包括重链可变区和轻链可变区。

更优选的，所述重链可变区包含cdr1、cdr2和cdr3，所述cdr1-3分别与seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同源性；和，所述轻链可变区包含cdr1、cdr2和cdr3，所述cdr1-3分别与seqidno.6、seqidno.7和seqidno.8所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同源性。

或者

所述重链可变区包含cdr1、cdr2和cdr3，所述cdr1-3分别与seqidno.9、seqidno.10和seqidno.11所示的氨基酸序列具有至少90％。91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同源性；以及，所述轻链可变区包含cdr1、cdr2和cdr3，所述cdr1-3分别与seqidno.12、seqidno.13和seqidno.14所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同源性。

更优选的，所述重链可变区的cdr1-3分别如seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5所示，以及，轻链可变区的cdr1-3分别如seqidno.6、seqidno.7和seqidno.8所示。

或者所述重链可变区的cdr1-3分别如seqidno.9、seqidno.10和seqidno.11所示，以及，轻链可变区的cdr1-3分别如seqidno.12、seqidno.13和seqidno.14所示。

优选的，本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分，重链可变区包含与seqidno.1所示的氨基酸序列至少具有同源性为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列，以及，所述轻链可变区包括与seqidno.2所示的氨基酸序列至少具有同源性为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列。

更优选的，所述重链可变区如seqidno.1所示，以及，所述轻链可变区如seqidno.2所示。

优选的，本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述的抗体或其抗原结合部分为全抗体、双特异性抗体、scfv、fab、fab’、f(ab’)2或fv。

优选的，本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分，使用蛋白免疫法或者dna免疫法获得；进一步，所述的蛋白免疫法包括以人源pd-l1蛋白为免疫原进行免疫获得抗体或其抗原结合部分；所述的dna免疫法包括以人源pd-l1编码dna质粒为免疫原进行免疫获得抗体或其抗原结合部分。

本发明的另一方面，提供一种分离的dna，所述dna编码上述的单克隆抗体或其抗原结合部分。

本发明的另一方面，提供一种载体，所述载体包括上述任一的dna。

本发明的另一方面，提供一种细胞，所述细胞包括上述载体。

本发明的另一方面，提供一种制备上述单克隆抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括蛋白免疫法或者dna免疫法制备单克隆抗体或其抗原结合部分。

优选的，所述的蛋白免疫法包括以人源pd-l1蛋白为免疫原进行免疫获得抗体或其抗原结合部分；所述的dna免疫法包括以人源pd-l1编码dna质粒为免疫原进行免疫获得抗体或其抗原结合部分。

本发明的另一方面，提供一种上述单克隆抗体或其抗原结合部分、上述分离的dna、载体或者细胞在与pd-l1相关方面的应用。

优选的，所述应用包括评估pd-l1功能，检测pd-l1的表达、筛选药物、治疗疾病。优选的，所述检测为免疫组织化学检测。

更优选的，所述疾病为与t细胞的活化相关的疾病，例如肿瘤，所述肿瘤包括恶性肿瘤，例如癌症、血液系统恶性肿瘤等。在一个具体实施例，所述恶性肿瘤例如黑色素瘤、淋巴癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈癌、结肠癌。

更优选的，所述应用包括在制备药物组合物中的用途。

在本发明的另一个方面，提供一种药物组合物，其包含：上述的单克隆抗体或其抗原结合部分、上述分离的dna、上述载体或者上述细胞；以及，可选的包括可药用载体。

优选的，所述可药用载体可以是一种也可以是多种，所述载体包括但不限于稀释剂、粘合剂、致湿剂、表面活性剂、润滑剂、崩解剂等等。

进一步，本发明携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。

更优选的，所述药物组合物可包含在纳米载体、病毒载体、微胶囊、脂质体等中给予。

优选的，所述药物组合物联合其他药物进行治疗。

在本发明的另一个方面，提供一种上述的单克隆抗体或其抗原结合部分、上述分离的dna、上述载体或者上述细胞在制备试剂盒中的用途。

在本发明的另一个方面，提供一种试剂盒，其包含：上述的单克隆抗体或其抗原结合部分、上述分离的dna、上述载体或者上述细胞。

在本发明的另一个方面，本发明提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的上述药物组合物。

优选的，所述方法包括将上述药物组合物联合其他药物进行疾病治疗。

进一步，本发明的疾病包括与t细胞的活化相关的疾病，例如肿瘤，所述肿瘤包括恶性肿瘤，例如癌症、血液系统恶性肿瘤等。在一个具体实施例，所述恶性肿瘤例如黑色素瘤、淋巴癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈癌、结肠癌。

更优选的，本发明提供了一种联合治疗受试者中的癌症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的上述药物组合物，还包括向所述受试者施用治疗有效量的其它治疗癌症的药剂或施用其它治疗癌症的方法。

本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。

本发明的有益效果：本发明经过筛选得到的结合人源pd-l1的单克隆抗体或其抗原结合片段能够特异性的与人源pd-l1结合,具有高亲和力，表现稳定，可用于制备特异性检测pd-l1蛋白的免疫组化检测工具,用于医学研究和对肿瘤的诊断、治疗方案的选择和预后提供重要的临床参考。此外，本发明经过筛选得到的结合人源pd-l1的单克隆抗体或其抗原结合片段能够有效的阻断pd-l1和其受体pd-1的结合，其阻断效果与阳性对照抗体相当，可用于与pd-l1相关的检测、治疗、功能评估和药物筛选等。

非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：molecularcloningalaboratorymanual，2nded.，ed.bysambrook，fritschandmaniatis(coldspringharborlaboratorypress：1989)；dnacloning，volumesiandii(d.n.glovered.，1985)；oligonucleotidesynthesis(m.j.gaited.，1984)；transcriptionandtranslation(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；b.perbal，apracticalguidetomolecularcloning(1984)；；immunochemicalmethodsincellandmolecularbiology(mayerandwalker，eds.，academicpress，london，1987)；handbookofexperimentalimmunology，volumesv(d.m.weirandc.c.blackwell，eds.，1986)。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：单克隆抗体对人源pd-l1与biotin-hpd1受体结合的阻断作用结果图

图2：免疫组化法检测肺癌组织中pd-l1蛋白的表达染色图

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，主要设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

balb/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；

nod-prkdc^scidil-2rg^null(b-ndg)小鼠来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号b-cm-001；

人源pd-l1重组蛋白(humanpd-l1/b7-h1protein,fctag)购自北京百普赛斯生物科技有限公司，货号pd1-h5258；

小鼠二步法试剂盒(小鼠聚合物法检测系统)购自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号为pv-6002；

柠檬酸盐修复液ph6.0购自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号为zli-9065；

dab显色剂(dabkit)购自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号为zli-9018；

封闭用正常羊血清(工作液)购自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号为zli-9056；

鼠cd3e抗体磁珠(cd3εmicrobeadkit,mouse)来源miltenyibiotec，货号130-094-973；

抗鼠igm抗体磁珠(mouseigm–isotypecontrolantibodies)来源miltenyibiotec，货号130-120-156；

苏木精(hematoxylinsolution,harrismodified)购自sigma，货号为hhs16；

anti-pd-l1抗体[28-8]来源abcam，货号为ab205921

实施例1抗pd-l1单克隆抗体的制备及纯化

1动物免疫

1.1免疫前血清采集

将待免疫小鼠用ep管眼眶采血收集50-100μl免疫前血清作为后续检测试验的空白对照。收集的血清放置37℃培养箱30min后，转移到4℃过夜，第二天早上4000rmp离心5min，取上清转移到新的ep管中保存待用。

1.2免疫

采用经典免疫方法，对balb/c小鼠进行免疫，免疫原为人源pd-l1重组蛋白(购自百普塞斯)或人源pd-l1编码dna质粒，以使动物产生抗人pd-l1抗体。

蛋白免疫法：取6-8周龄balb/c雌鼠，用his标记的人源pd-l1蛋白与完全弗氏佐剂(cfa)等体积混合后，注射小鼠进行首次免疫，每只皮下注射20μg(100μg/ml)。待14天后，将pd-l1蛋白与不完全弗氏佐剂(ifa)等体积混合后，进行第二次皮下注射免疫20μg(100μg/ml)。14天后进行第三次免疫，方法与第二次免疫相同。待完成第三次免疫的3天后，通过小鼠眼眶采血的方法收集血清，利用elisa法测定抗体滴度。

dna免疫法：取6-8周龄balb/c雌鼠，将编码人pd-l1基因的表达质粒，通过肌肉注射进行免疫，每只小鼠注射60μg(1000μg/μl)。对小鼠连续进行至少4次免疫，每次间隔14天。最后一次免疫的7天后，通过小鼠眼眶采血的方法收集血清，利用elisa法测定抗体滴度。

增强免疫是在最后一次免疫的14天后进行，将表达人源pd-l1蛋白的cho细胞，按照体积200μl、1×10⁷个细胞/只，通过尾静脉注射方式注入小鼠体内，4天后通过二氧化碳安乐死后收集小鼠脾脏进行后续实验。

2细胞融合

将收集的小鼠脾脏进行研磨，利用鼠cd3e抗体磁珠和抗鼠igm抗体磁珠分离和纯化脾脏细胞后，通过peg将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0按10：1到5：1的比例进行融合，将融合的杂交瘤细胞接种在96孔细胞培养板内，用含有次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶核苷(hypoxanthine-aminopterin-thymidine,hat)的培养基进行培养扩增7天。

3杂交瘤细胞初筛

利用流式细胞仪(bdfacsariaii)进行荧光激活细胞分选法(fluorescence-activatedcellsorting，facs)对杂交瘤细胞进行初步筛选。在96孔培养板内加入表达人源pd-l1蛋白的cho细胞(2x10⁴细胞/孔)后，分别取50μl杂交瘤细胞上清培养液加入对应的96孔培养板的孔内。用fitc-affinipuref(ab)2片段化山羊抗小鼠igg二抗与fcγ片段特异性反应，流式细胞仪筛选阳性杂交瘤细胞。

4杂交瘤细胞亚克隆

将初筛得到的阳性杂交瘤细胞转移到含半固体培养基的96孔细胞培养板中进行培养10-14天(每孔1个细胞)，利用moleculardevices公司的clonepix2自动化平台和fitc标记的山羊抗小鼠igg二抗，高效筛选和挑取高表达阳性杂交瘤细胞系，转移到24孔细胞培养板中用于后续培养扩增。

5腹水制备抗体

将1×10⁶个阳性杂交瘤细胞腹腔注射入重度免疫缺陷b-ndg小鼠(北京百奥赛图基因生物技术有限公司)体内进行腹水抗体生产，因该小鼠体内缺失功能性t、b和nk细胞，进而无法表达抗体，非常适合外源杂交瘤细胞表达抗体的腹水制备，用于后续检测。

6抗体纯化

从小鼠腹水收集的阳性杂交瘤抗体，利用geakta蛋白色谱全自动纯化仪(gehealthcare)进行纯化，纯化流程和方法可参见ge公司网站“抗体纯化手册”(http://www.gelifesciences.com.cn/cnls/jsp/service％20&％20support/handbooks.html)。

本申请所述的pd-l1抗体09-8b8(“8b8”)是由上述方法制备和纯化获得。抗体的氨基酸序列，包括重链可变区、轻链可变区或其cdr区，参见表1-3所示：

表1：抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列

表2：抗体的kabatcdr序列

表3：抗体的chothiacdr序列

实施例2抗体对人源pd-l1与biotin-hpd1受体结合的阻断作用检测

本实验用于检测实施例1的anti-hpd-l1抗体对人源pd-l1与pd-1受体结合的阻断能力。取96孔细胞培养板，每孔加入25μl表达人源pd-l1蛋白的cho-hpd-l1细胞(2x10⁴细胞/孔)，将纯化腹水按照50、5、0.5、0.05、0.005μg/ml稀释，血清按照终浓度1：100稀释后，每孔加入25μl，放4℃静置30min。取biotin-hpd-1蛋白(200μg/ml)按照0.4μg/ml稀释后，每孔加入50μl，放4℃静置15min。1200rpm离心5min，pbs洗涤两次。每孔加入50μl1:100anti-mouseiggfc-fitc和1：100streptavidin-pe二抗，放4℃静置30min。1200rpm离心5min，pbs洗涤一次后，每孔加200μlpbs上机进行流式分析。

由图1可以看出，随着anti-hpd-l1抗体09-8b8浓度的增加，pe标记的biotin-hpd-1荧光强度逐渐减弱，表明anti-hpd-l1抗体09-8b8可以阻断人源pd-l1与pd-1受体的结合。

实施例3抗体特异性检测

使用proteinl芯片，以捕获法捕获pd-l1抗体09-8b8作为配体，分别设置不同浓度重组无关蛋白(人btla、ctla4、cd28)作为分析物，具体浓度为200nm、100nm、50nm、25nm、12.5nm、6.25nm、3.125nm、1.5625nm、0nm，与捕获的pd-l1抗体09-8b8进行结合检测。通过biacoret200evaluationsoftware3.0对产生的数据进行分析，获得pd-l1抗体09-8b8与不同蛋白不同浓度的结合响应值，并绘制曲线，确认交叉反应。结果表明pd-l1抗体09-8b8与这些无关蛋白不结合。

实施例4免疫组化实验

1，分别取3种不同类型的人肿瘤组织取样制作组织芯片，由外部商业公司进行切片，切片厚度为4μm；

2，使用常规方法对本发明抗体进行免疫组化染色测试：

a)先将石蜡切片在58℃烘烤2小时脱蜡，系列乙醇复水。加入适量小鼠二步法试剂盒(小鼠聚合物法检测系统)中的试剂1(内源性过氧化物酶阻断剂)室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶活性，然后蒸馏水洗2min×3次，pbs缓冲液浸泡5min。

b)抗原修复：组织切片置于400ml0.1×柠檬酸盐修复液(ph6.0)中，微波炉加热4min，然后使其自然冷却。封闭：laminin多克隆抗体(santacruz公司)选用10％封闭用正常羊血清(pbs缓冲液稀释)封闭，室温孵育30min。

c)以本发明的抗体作为一抗，以anti-pd-l1抗体[28-8]作为对照抗体，倾去血清，滴加适当比例稀释的一抗(1：100稀释)，4℃冰箱过夜。

d)以小鼠二步法试剂盒(小鼠聚合物法检测系统)中的试剂2(酶标羊抗小鼠igg聚合物)作为二抗，滴加1：200稀释的二抗(中山生物技术公司)，37℃孵育30min。pbs缓冲液清洗5min，重复清洗3次。

e)显微镜下观察dab染色情况。苏木素复染，流水冲洗。系列乙醇脱水，中性树胶封片。

镜检，09-8b8抗体染色结果：部分肿瘤组织上显示细胞膜染色，部分样品显示阴性无pd-l1染色，其中肺癌染色如图2所示，可见明显细胞膜染色，染色模式正确，信号较强，未见明显非特异染色。该效果和对照抗体的效果相当(未在图中显示)，表明本发明的抗体可以有效结合人源pd-l1，其染色效果与阳性对照抗体相当，具有较好的特异性。

以上结果说明本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段能够特异性的与人源pd-l1结合,具有高亲和力，表现稳定，可用于制备特异性检测pd-l1蛋白的免疫组化检测工具,用于医学研究和对肿瘤的诊断、治疗方案的选择和预后提供重要的临床参考。此外，本发明经过筛选得到的结合人源pd-l1的单克隆抗体或其抗原结合片段能够有效的阻断pd-l1和其受体pd-1的结合，其阻断效果与阳性对照抗体相当，可用于与pd-l1相关的检测、治疗、功能评估和药物筛选等。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110>百奥赛图江苏基因生物技术有限公司

北京百奥赛图基因生物技术有限公司

<120>抗人pd-l1单克隆抗体及其应用

<130>1

<160>14

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>118

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gluvalglnleuglnglnserglyprogluleuvallysproglyala

151015

servallysilesercyslysthrserglytyrthrphethrasptyr

202530

asnvalhistrpvalserglnserhisglylysserleuglutrpile

354045

glytyriletyrprotyrserglyglythralatyrasnglnargphe

505560

lysserlysalathrleuthrvalaspasnserserserthralatyr

65707580

metgluleuargserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys

859095

alaargsertyrglyasnglyalametasptyrtrpglyglnglythr

100105110

servalthrvalserser

115

<210>2

<211>107

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

serilevalmetthrglnthrprolyspheleuleuvalseralagly

151015

aspargvalthrilethrcyslysalaserglnservalserasnasp

202530

valalatrptyrglnglnlysproglyglnserprolysleuleuile

354045

asntyralaserasnargtyrthrglyvalproaspargphethrgly

505560

serglytyrglythraspphethrphethrileserthrvalglnala

65707580

gluaspleualavaltyrphecysglnglnasptyrthrserproarg

859095

thrpheglyglyglythrlysleugluilelys

100105

<210>3

<211>5

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

asptyrasnvalhis

15

<210>4

<211>17

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tyriletyrprotyrserglyglythralatyrasnglnargphelys

151015

ser

<210>5

<211>9

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

sertyrglyasnglyalametasptyr

15

<210>6

<211>11

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

lysalaserglnservalserasnaspvalala

1510

<210>7

<211>7

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

tyralaserasnargtyrthr

15

<210>8

<211>9

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

glnglnasptyrthrserproargthr

15

<210>9

<211>10

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

glytyrthrphethrasptyrasnvalhis

1510

<210>10

<211>6

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

tyrprotyrserglygly

15

<210>11

<211>9

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

sertyrglyasnglyalametasptyr

15

<210>12

<211>11

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

lysalaserglnservalserasnaspvalala

1510

<210>13

<211>7

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

tyralaserasnargtyrthr

15

<210>14

<211>9

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

glnglnasptyrthrserproargthr

15