基因重组胶原样肽MJLGG-34及其制备方法与应用与流程

本发明属于基因工程
技术领域：
，特别涉及一种基因重组人胶原样肽mjlgg-34及其制备方法与应用。
背景技术：
：胶原蛋白是很多动物体内含量最丰富的蛋白质，有着丰富的多样性和组织分布的特异性。胶原蛋白的类型、质量以及分布的改变直接影响动物体正常的机能，且其具有良好的生物相容性、低免疫原性和可生物降解性等优良特性，在生物医药、组织工程、食品、化妆品等领域有着广泛的应用。目前已经有研究表明胶原蛋白是改善皮肤水分含量的功能因子，不仅能够补充合成胶原所需要的氨基酸，也能起到修补受损细胞作用，改善细胞的营养状况和微环境，从而令肌肤重新焕发青春。动物体内的胶原蛋白以胶原原纤维或胶原纤维的形式存在。其基本结构单位是原胶原分子，长度约为300nm，直径约为1.5nm，分子量约为300kda，由三股相互缠绕的多肽链组成。在电子显微镜下，胶原纤维呈现特有的横纹区带，区带间距为60～70nm，这取决于胶原的类型和生物来源。原胶原蛋白分子在胶原纤维中有规则地按四分之一错位，首尾相接，并排列组成纤维束。由于胶原属于大分子化合物，需在体内代谢为小分子短肽而发挥作用，利用特异性胶原蛋白酶剪切胶原蛋白肽链可以得到保有胶原蛋白生物活性并有与人体皮肤结构生物相容性高的寡肽，可添加至化妆品作为有效成分。通过特定的氨基酸替代和改变产生各种肽类似物，能够精确调节潜在疗法的效力，溶解度，毒性和成本。对于大多数其他分子和生物化合物来说，这种可及性和控制不易实现。胶原蛋白生产主要有一下三大类：传统提取法、化学合成法及现代生物技术生产法。传统提取的胶原含有一定的免疫原性，增加了其应用的潜在风险，化学合成法在合成过程中外消旋作用及有毒试剂的使用导致明显的健康和环境问题，而重组蛋白具有可加工性、排异性低、无病毒隐患等特点。这些都预示着基因重组小分子胶原样肽有良好的应用价值和产业化前景。技术实现要素：为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种基因重组胶原样肽mjlgg-34。该胶原样肽mjlgg-34具有更好的透皮率和更高的生物活性。本发明的另一目的在于提供所述基因重组胶原样肽mjlgg-34的制备方法。该制备方法根据胶原样肽mjlgg-34的氨基酸序列及大肠杆菌密码子的偏好性，设计mjlgg-34在原核表达系统的基因序列，采用基因工程技术，结合蛋白内含肽(intein)的可诱导剪切功能实现目的多肽mjlgg-34的高效制备；该制备方法安全、生产效率高，生产成本低。本发明的再一目的在于提供所述基因重组胶原样肽mjlgg-34的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基因重组胶原样肽mjlgg-34，其肽段设计参考iii型胶原α1链为模板，综合分子量对透皮吸收率及抗氧化性的影响将大小定在3kd左右，在保留天然胶原蛋白胶原域gly-x-y序列的高度重复前提下，将除pro以外的疏水氨基酸替换为亲水氨基酸以改善亲水性能。引入对cu2+有高亲和作用的ghk序列，改变cu2+的经皮传送，同时减少cu2+结合络氨酸酶，抑制黑色素的生成。研究表明ghk-cu比单独任何一种药物能更好地诱导胶原产生以及加快伤口的愈合。ghk-cu通过上调mmp-2、timp-1和timp-2的mrna及蛋白质的水平诱导胶原蛋白的重构，同时能增加皮肤硫酸钠和硫酸软骨素的合成，最终减少皮肤松弛和皱纹。同时尾端的cys有利于维持胞内谷胱甘肽体系，发挥抗氧化的作用，同时也是最好的络氨酸酶制剂。其氨基酸序列如下所示：gepgnpghkghkgqpgqpgppgergppgpccggg。优化后编码所述的基因重组胶原样肽mjlgg-34的核苷酸序列为：ggtgaaccgggcaacccaggtcacaaaggccacaaaggccagccgggccagccgggtccgccgggcgaacgtgggccgccgggcccgtgctgtggtggtggc；目的蛋白mjlgg-34与pet-32a载体构建后的融合蛋白trx-6his-mjlgg-34的核苷酸序列如下：融合蛋白trx-6his-mjlgg-34的氨基酸序列如下所示：msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkamadigsefgepgnpghkghkgqpgqpgppgergppgpccggg所述的基因重组胶原样肽mjlgg-34的制备方法，包括以下步骤：(1)设计并合成mjlgg-34基因：采用两对互补引物退火合成mjlgg-34基因：引物t1+：5'-aattcggtgaaccgggcaacccaggtcacaaaggccacaaaggccagccgggccagc-3'；引物t1-：5'-cccggctggcccggctggcctttgtggcctttgtgacctgggttgcccggttcaccg-3'；引物t2+：5'-cgggtccgccgggcgaacgtgggccgccgggcccgtgctgtggtggtggctaactcgagg-3'；引物t2-：5'-gatccctcgagttagccaccaccacagcacgggcccggcggcccacgttcgcccggcgga-3'；gaattc为ecori酶切位点，ctcgag为xhoi酶切位点。将引物t1+和引物t1-进行退火合成反应，同时将引物t2+和引物t2-进行退火合成反应，分别制得片段一和片段二；(2)构建重组载体pet-32a-mjlgg-34：用ecori酶和xhoi酶分别对质粒pet-32a和步骤(1)制得的mjlgg-34基因进行双酶切，再将双酶切后得到的mjlgg-34基因和双酶切后的质粒pet-32a连接，得到重组载体pet-32a-mjlgg-34；(3)制备表达工程菌pet-32a-mjlgg-34/bl21(de3)：用重组载体pet-32a-mjlgg-34转化表达宿主大肠杆菌e.colibl21(de3)，得到表达工程菌pet-32a-mjlgg-34/bl21(de3)；(4)表达和纯化：①诱导表达工程菌pet-32a-mjlgg-34/bl21(de3)表达由目的多肽、his标签蛋白和trx标签蛋白等组成的融合蛋白；②得到的his标签融合蛋白用镍柱进行纯化：在蛋白上样后，带有组氨酸标签的蛋白特异性结合到镍柱，其他的杂蛋白流出；镍柱中的ni2+也可以与咪唑结合，用咪唑梯度洗脱，咪唑竞争性结合到镍柱上，释放融合蛋白，然后收集洗脱液；③目的蛋白的切割和纯化；④利用高效液相色谱技术纯化目的蛋白，得到基因重组胶原样肽mjlgg-34。步骤(1)中所述的退火合成反应的条件优选为：37℃，35min；98℃，3min；95℃，5min；步骤(4)②纯化所用的平衡缓冲液、洗涤缓冲液的组成如下：lysis平衡缓冲液(lebuffer)：50mmna2hpo4，0.3mnacl，ph＝8.0；洗涤缓冲液：50mmna2hpo4，0.3mnacl，10～50mmimidazole，ph＝8.0；步骤(4)②中所述的洗脱镍柱的溶液的组成优选如下：50mmna2hpo4，0.3mnacl，250mmimidazole，ph＝8.0；步骤(4)③中所述目的蛋白的切割和纯化步骤如下：1)将融合蛋白洗脱液透析到20mmtris-hcl，ph8.0或者1×pbs，ph7.4中；2)小规模酶切优化：a)在ek稀释/储存缓冲液(ekdilution/storagebuffer)中对肠激酶(ek，5iu/μl)进行4次连续稀释(0.001iu，0.01iu，0.1iu和1iu酶/μl)。b)设置5个反应，包括没有ek的反应用于对照：fusionprotein(融合蛋白)10μg10×ekcleavage/capturebuffer5μldilutedek(add2μlekdilution/storagebufferforthecontrol)2μldeionizedwater(去离子水)至50μltotalvolume50μlc)充分混合并在22℃下孵育1小时，3小时，5小时并过夜(～16小时)。d)在sds-page凝胶上加载10μl以确定最佳切割结果；如果结果不合适，可以测试温度的优化。结果显示ek酶切优化条件为：1u肠激酶22℃条件下裂解100μg融合蛋白，酶切5h。3)根据最佳切割结果放大反应比例。4)放大反应酶切后，将酶切体系过事先平衡好的ni-nta树脂中，收集穿透液，用含250mmol/l咪唑的洗脱缓冲液洗脱柱子上的标签蛋白和酶切的碎蛋白，洗脱总体积为柱床的5倍，从而将目的蛋白与标签蛋白分离开来，得到纯化的目的蛋白。步骤(4)④中所述的利用高效液相色谱技术纯化目的蛋白mjlgg-34的步骤如下：a、流动相a为在体积百分比100％乙腈中添加三氟乙酸(tfa)得到，tfa的终浓度为体积百分比0.1％；流动相b为100％水中添加三氟乙酸(tfa)，tfa的终浓度为体积百分比0.1％；流速1.0ml/min，25min线性梯度洗脱；b、线性梯度洗脱中流动相b由90～65％(v/v)，收集目的蛋白洗脱峰，光吸收检测波长为220nm；并进行质谱鉴定。所述的基因重组胶原样肽mjlgg-34应用于制备美容化妆品、保健品或食品原料，有如下作用：抗氧化、抑制人真皮成纤维细胞凋亡、抑制黑色素合成等功能。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)、本发明设计的胶原样肽基因mjlgg-34是全新的序列，长度远小于天然人胶原蛋白基因，分子水平操作更简易化，且其翻译的多肽分子量小，容易制备，生物活性稳定，在保证生物活性的同时皮肤更易吸收，可显著抑制皮肤的氧化损伤抵抗衰老；(2)、本发明根据大肠杆菌密码子的偏好性，对胶原样肽的基因序列进行密码子优化，消除了胶原样肽表达中因密码子利用限制导致的低翻译效率，使其更适于在大肠杆菌中表达；(3)、本发明方法所制备的基因重组人胶原样肽mjlgg-34，与动物来源的天然胶原蛋白相比较，其生物相容性和生物安全性均佳，具有良好的抗氧化、抗凋亡、抑制黑色素生成等生物活性，同时结果显示，制备的基因重组胶原样肽mjlgg-34通过减少中环腺苷酸依赖性蛋白激酶催化亚基(prkaca)和小眼转录因子(mitf)的表达抑制黑素合成，无明显的毒副作用表现；可用于食品、保健品、化妆品等，应用范围广泛，具有良好的应用价值和产业化前景；(4)本发明所述重组人胶原样肽mjlgg-34的制备方法效率高、成本低，应用前景广阔。附图说明图1是质粒pet-32a及重组表达质粒pet-32a-mjlgg-34酶切示意图。图2是sds-page检测his融合蛋白trx-6his-mjlgg-34表达的鉴定图；其中，泳道1是iptg诱导前全菌蛋白；泳道2是iptg诱导前全菌上清；泳道3是iptg诱导后的全菌蛋白；泳道4、5均是iptg诱导后的全菌上清；泳道6是诱导后菌体破碎上清液；泳道7是诱导后菌体破碎沉淀。图3是sds-page检测his融合蛋白trx-6his-mjlgg-34纯化的鉴定图；其中，泳道1是纯化前菌体破碎上清液；泳道2上柱样品流出液；泳道3是洗涤流出液；泳道4是250mmol/l咪唑纯化后的蛋白。图4是制备的重组人胶原样肽mjlgg-34的飞行质谱鉴定图。图5为制备的重组人胶原样肽mjlgg-34的dpph清除作用检测结果图；其中，a：样品一；b：样品二。图6为重组人胶原样肽mjlgg-34缓解h2o2导致的hacat细胞氧化应激损伤的检测结果图。图7为重组人胶原样肽mjlgg-34抑制人黑色素瘤细胞的黑素生成检测结果图。图8为重组人胶原样肽mjlgg-34减少人黑色素瘤细胞黑素合成信号通路中环腺苷酸依赖性蛋白激酶催化亚基和小眼转录因子表达的检测结果图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。实施例1表达工程菌pet-32a-mjlgg-34/bl21(de3)的构建和表达具体步骤如下：(1)设计并合成mjlgg-34基因：按照大肠杆菌的密码偏好性设计编码mjlgg-34的cdna，设计两对引物，采用两对互补引物退火合成mjlgg-34基因：引物t1+：5'-aattcggtgaaccgggcaacccaggtcacaaaggccacaaaggccagccgggccagc-3'；引物t1-：5'-cccggctggcccggctggcctttgtggcctttgtgacctgggttgcccggttcaccg-3'；引物t2+：5'-cgggtccgccgggcgaacgtgggccgccgggcccgtgctgtggtggtggctaactcgagg-3'；引物t2-：5'-gatccctcgagttagccaccaccacagcacgggcccggcggcccacgttcgcccggcgga-3'；其中，gaattc为ecori酶切位点，ctcgag为xhoi酶切位点。退火各个成分的用量：(引物浓度为1od溶于400μlddh2o，反应体系：20μl)片段一：引物t1+2μl、引物t1-5μl、t4pnk1μl(10u)、atp20mm、ddh2o补水至20μl；片段二：引物t2+2μl、引物t2-2μl、t4pnk1μl(10u)、atp20mm、ddh2o补水至20μl；退火反应程序：37℃，35min；98℃，3min；95℃，5min；自然冷却至室温，退火产物备用。(2)构建重组载体pet-32a-mjlgg-34：用ecori酶和xhoi酶分别对质粒pet-32a(购自上海生工生物工程有限公司)和步骤(1)制得的mjlgg-34基因进行双酶切，酶切反应体系：pet-32a2μg、10×fdbuffer5μl、ecori1μl(10u/μl)、xhoi1μl(10u/μl)、ddh2o42μl，以上体系放入37℃恒温水浴锅中反应2h；再将双酶切后得到的mjlgg-34基因和双酶切后的质粒pet-32a连接，连接体系20μl：片段一1μl、片段二1μl、酶切载体pet-32a4μl、10×t4dnaligasebuffer2μl、t4dnaligase1μl(5u/μl)、ddh2o补充至20μl，上述连接混合液放在16℃恒温1h即可，得到重组载体pet-32a-mjlgg-34，重组载体pet-32a-mjlgg-34酶切鉴定如图1所示；(3)制备表达工程菌pet-32a-mjlgg-34/bl21(de3)：用重组载体pet-32a-mjlgg-34转化表达宿主大肠杆菌e.colibl21(de3)(购自上海生工生物工程有限公司)，得到表达工程菌pet-32a-mjlgg-34/bl21(de3)；(4)表达和纯化：从保种的ep管中取50μl表达工程菌菌液于5ml含有100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中，37℃、220rpm摇菌培养过夜，再扩大，以体积比为1：100的比例接于50ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基，37℃、220rpm摇菌至od600为0.8～1.0左右，加入异丙基-β-d硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度0.5mmol/l，37℃诱导表达6h。5000rpm离心30min收集菌体，将菌体重悬于10ml平衡缓冲液(50mmna2hpo4，0.3mnacl，ph＝8.0)中，然后超声破碎细胞，在冰上进行操作，破碎1秒，冷却3秒，总时间为30～45分钟。破碎产物在4℃，12000rpm离心15～20mim，收集上清，该上清称为破碎上清液。sds-page检测his融合蛋白trx-6his-mjlgg-34的表达，鉴定结果如图2所示。表明his融合蛋白表达成功，且以上清表达为主。融合蛋白trx-6his-mjlgg-34的核苷酸序列如seqidno：3，其氨基酸序列为seqidno：4。实施例2重组人胶原样肽mjlgg-34的纯化、制备和鉴定轻轻颠倒翻转瓶子几次，使介质混合均匀，吸取2ml的介质加入到柱子(ni-nta柱，金斯瑞生物科技有限公司，10ml柱体积)中，让介质自由沉降，并放干储存液，加入4倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析介质；用破碎上清液以1.0ml/min的流速上柱，收集流出液以待后续分析；用8倍柱体积的洗涤缓冲液(50mmna2hpo4，0.3mnacl，10～50mmimidazole，ph＝8.0)以1.0ml/min过柱，以洗去杂蛋白或未亲和结合的融合蛋白，收集流出液以待后续分析；用10倍柱体积的洗脱缓冲液以1.0ml/min过柱，从第二管开始收集洗脱液。取样品流出液，洗涤流出液，洗脱流出液进行sds-page检测his融合蛋白的纯化效果(结果如图3所示)。表明在用250mm咪唑的洗脱液中得到了除去了大部分杂质的his融合蛋白。对目的蛋白进行切割和纯化，步骤如下：1)将融合蛋白洗脱液透析到20mmtris-hcl，ph8.0或者1×pbs，ph7.4中；2)小规模酶切优化：a)在ek稀释/储存缓冲液(ekdilution/storagebuffer)中对肠激酶(ek，5iu/μl)进行4次连续稀释(0.001iu，0.01iu，0.1iu和1iu酶/μl)。b)设置5个反应，包括没有ek的反应用于对照：fusionprotein(融合蛋白)10μg10×ekcleavage/capturebuffer5μldilutedek(add2μlekdilution/storagebufferforthecontrol)2μldeionizedwater(去离子水)至50μltotalvolume50μlc)充分混合并在22℃下孵育1小时，3小时，5小时并过夜(～16小时)。d)在sds-page凝胶上加载10μl以确定最佳切割结果；结果显示ek酶切优化条件为：1u肠激酶22℃条件下裂解100μg融合蛋白，酶切5h。3)根据最佳切割结果放大反应比例。4)放大反应酶切后，将酶切体系过事先平衡好的ni-nta树脂中，收集穿透液，用含250mmol/l咪唑的洗脱缓冲液洗脱柱子上的标签蛋白和酶切的碎蛋白，洗脱总体积为柱床的5倍，从而将目的蛋白与标签蛋白分离开来，得到纯化的目的蛋白。再利用高效液相色谱(hplc)纯化目的蛋白mjlgg-34，步骤如下：a、流动相a为在体积百分比100％乙腈中添加三氟乙酸(tfa)得到，tfa的终浓度为体积百分比0.1％；流动相b为100％水中添加三氟乙酸(tfa)，tfa的终浓度为体积百分比0.1％；流速1.0ml/min，25min线性梯度洗脱；b、线性梯度洗脱中流动相b由90～65％(v/v)，收集目的蛋白洗脱峰，光吸收检测波长为220nm。制备得到了纯度为质量百分比99.3％的目的多肽。制备的目的多肽mjlgg-34进行质谱鉴定(结果如图4所示)，质谱检测分子量为3.215kda.，其与理论值一致，表明经ek酶切并纯化后成功地将目的小肽与标签蛋白分离开来，得到正确的目的蛋白。实施例3制备的重组人胶原样肽mjlgg-34的抗氧化能力(1)dpph的清除作用取多肽适量用pbs(ph7.5，0.02m)溶解成0.3mm的溶液，加入1.5％的胰蛋白酶水解4h后沸水浴5min灭活酶，终止水解制成样品一；另取多肽适量用pbs(ph7.5，0.02m)溶解成3mm溶液为样品二。分别取0～250μl样品一和样品二于1.5ml离心管，按浓度梯度分别加入250～500μl乙醇溶液，再加入1ml0.1mmdpph·乙醇溶液，混匀，暗处放置30min，不断震荡，测定517nm处的吸光值。dpph·清除能力计算公式为：dpph·抑制率(％)＝(ao—a1)/ao×100其中ao为未加样品的空白的吸光值，a1为加入样品后的吸光值。实验结果如图5所示，a图随着多肽水解液浓度的升高，清除dpph的能力逐渐增强，在浓度为0.125mm时，清除率达到58.89％；b图完整的胶原样肽mjlgg-34的dpph清除率同样显示出浓度依赖性，随着胶原样肽浓度的升高，清除dpph的能力逐渐增强，在浓度为1.25mm时，清除率达到62.14％。实施例4重组人胶原样肽mjlgg-34缓解h2o2导致的hacat细胞氧化应激损伤hacat细胞(购自中国科学院昆明细胞库)接种于6孔细胞培养板中，于37℃、5％co2培养箱中培养，待细胞生长至亚融合状态时，换入新鲜培养基。空白组(blankcontrol)：生理盐水；模型组(model)：生理盐水；胶原对照组(collangeni)：200μmol·l-1天然人i型胶原蛋白；重组胶原样肽组(polypeptide)：200μmol·l-1制备的mjlgg-34。除空白组外，其余三组在加药前，用300μmol·l-1的h2o2处理12h。加药作用48h后，吸取一定量培养液于1ml离心管中留样待测。吸弃剩余培养液，用预冷的pbs缓冲液洗1～2次，刮下贴壁细胞，加入1×d-hank’s缓冲液1ml，用移液枪轻轻混匀，反复冻融3次，3500r·min-1、4℃离心10min，取上清液待测。按照试剂盒说明书操作，测定细胞裂解液中sod的含量。如图6所示，当用采用300μmol·l-1h2o2处理细胞12h后，模型组sod值非常低，约只有空白组sod值(0.01449u/mgprotein)的三分之一。当加入重组人胶原样肽mjlgg-34及天然i型胶原蛋白对细胞进行修复后，细胞内的sod值有所增加，两者相对于模型组均表现出显著性差异，其中胶原样肽处理组增加了152.14％，i型胶原处理组增加了166.80％，这表明二者对h2o2造成的hacat氧化损伤有较好的修复作用。实施例5制备的重组人胶原样肽mjlgg-34抑制人黑色素瘤细胞的黑素生成调整人黑素瘤细胞a375(购自中国科学院昆明细胞库)浓度至1×105个/ml，接种于6孔板，每孔2ml。贴壁后细胞分组分别用25～200μmol·l-1的mjlgg-34处理(polypeptide)，对照组(collangeni)用200μmol·l-1天然人i型胶原蛋白处理，空白组(control)用生理盐水处理，48h后用预冷的pbs洗涤3次刮下收集于无菌ep管中。黑色素含量的测定采用tsuboi(1998)的方法，1500rpm离心5min弃上清，以0.5ml含10％dmso的1mol·l-1naoh溶液裂解细胞，超声波破碎30min，90℃水浴2h，使细胞团块完全裂解后，3000rpm离心15min，取上清至96孔板于酶标仪450nm处测a值，计算细胞黑色素相对含量。黑素合成相对含量(％)＝a1/a0×100式中al是样品组的吸光度，a0是空白组的吸光值如图7所示，25～200μmol·l-1范围内的重组人胶原样肽mjlgg-34孵育黑素瘤细胞48小时后，呈浓度依赖性抑制黑素细胞中的黑素合成(p＜0.05)，而200μmol·l-1mjlgg-34对黑素合成抑制作用最强，与空白组相比，黑素含量减少约26.62％(73.38±0.017；p<0.01)。实施例6mjlgg-34减少人黑色素瘤细胞黑素合成信号通路中环腺苷酸依赖性蛋白激酶催化亚基(prkaca)和小眼转录因子(mitf)的表达调整人黑素瘤细胞a375浓度至1×105个/ml，接种于6孔板，每孔2ml。贴壁后细胞分组，分别用200μmol·l-1的mjlgg-34(polypeptide)和200μmol·l-1天然人i型胶原蛋白(collangeni)处理，空白组(control)用等量的pbs处理，48h后弃上清，用预冷的pbs洗涤2次，将pbs弃去，加含pems的裂解液150μl/孔，摇匀冰上裂解30min；裂解完后，将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中；4℃，12000r/min，离心15min，将离心后的上清液分装置200μlep管中，-70℃保存备用。按bca蛋白浓度测定试剂盒操作测定、配平蛋白浓度后进行sds-page电泳、转膜和western-blotting反应，具体实验步骤按试剂盒操作进行。如图8所示，由western-blotting实验结果可知，制备的重组人胶原样肽mjlgg-34和天然i型胶原蛋白分别作用a375细胞48h后，与空白组相比，两种药物不同程度减少环腺苷酸依赖性蛋白激酶催化亚基(prkaca)和小眼转录因子(mitf)的表达，且效果显著(p<0.05)；其中200μmol·l-1mjlgg-34作用细胞48h后，与空白组相比，mitf含量减少约64.81％，prkaca含量减少65.62％。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>暨南大学<120>基因重组胶原样肽mjlgg-34及其制备方法与应用<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>34<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>基因重组胶原样肽mjlgg-34<400>1glygluproglyasnproglyhislysglyhislysglyglnprogly151015glnproglyproproglygluargglyproproglyprocyscysgly202530glygly<210>2<211>102<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>编码所述的基因重组胶原样肽mjlgg-34的核苷酸序列<400>2ggtgaaccgggcaacccaggtcacaaaggccacaaaggccagccgggccagccgggtccg60ccgggcgaacgtgggccgccgggcccgtgctgtggtggtggc102<210>3<211>612<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>融合蛋白trx-6his-mjlgg-34的核苷酸序列<400>3atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcg60gacggggcgatcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgcc120ccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaac180atcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctg240ctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttg300aaagagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcat360catcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaa420ttcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatg480gctgatatcggatccgaattcggtgaaccgggcaacccaggtcacaaaggccacaaaggc540cagccgggccagccgggtccgccgggcgaacgtgggccgccgggcccgtgctgtggtggt600ggctaactcgag612<210>4<211>201<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>融合蛋白trx-6his-mjlgg-34的氨基酸序列<400>4metserasplysileilehisleuthraspaspserpheaspthrasp151015valleulysalaaspglyalaileleuvalaspphetrpalaglutrp202530cysglyprocyslysmetilealaproileleuaspgluilealaasp354045glutyrglnglylysleuthrvalalalysleuasnileaspglnasn505560proglythralaprolystyrglyileargglyileprothrleuleu65707580leuphelysasnglygluvalalaalathrlysvalglyalaleuser859095lysglyglnleulysglupheleuaspalaasnleualaglysergly100105110serglyhismethishishishishishisserserglyleuvalpro115120125argglyserglymetlysgluthralaalaalalysphegluarggln130135140hismetaspserproaspleuglythraspaspaspasplysalamet145150155160alaaspileglyserglupheglygluproglyasnproglyhislys165170175glyhislysglyglnproglyglnproglyproproglygluarggly180185190proproglyprocyscysglyglygly195200<210>5<211>57<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>引物t1+<400>5aattcggtgaaccgggcaacccaggtcacaaaggccacaaaggccagccgggccagc57<210>6<211>57<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>引物t1-<400>6cccggctggcccggctggcctttgtggcctttgtgacctgggttgcccggttcaccg57<210>7<211>60<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>引物t2+<400>7cgggtccgccgggcgaacgtgggccgccgggcccgtgctgtggtggtggctaactcgagg60<210>8<211>60<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>引物t2-<400>8gatccctcgagttagccaccaccacagcacgggcccggcggcccacgttcgcccggcgga60当前第1页12