本发明属于生物技术领域，特别涉及一种脐带间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法。
背景技术：
干细胞在稳定生长过程中，会分泌许多种细胞因子，以蛋白质多肽形式分泌到培养基上清中，通过收集处理培养干细胞之后的上清液，通过一系列处理，可以获得大量细胞因子，这些人源性因子包括egf(表皮生长因子)、vegf(血管内皮生长因子)、hgf(肝脏生长因子)、pdgf(血小板衍生因子)、bfgf(成纤维细胞生长因子)等。这些因子大都具有与皮肤生长、血管生长、皮下组织再生有关的生物活性，能够有效调控机体细胞信号传导，活化人体细胞进而生理性修复或替代机体损伤、衰老细胞，促进改善皮肤再生修复。
液体状态下的干细胞生物活性肽溶液在室温保存时间短，不利于运输，浓度也低。并且异体来源的干细胞生物活性肽，干细胞种子虽然经过筛选，但仍然存在微生物感染风险。还有一些产品是通过直接裂解干细胞或其它活性细胞直接获得，蛋白成分复杂，虽然浓度高，但无效蛋白多，对人体也将是代谢压力。
技术实现要素：
基于此，本发明的目的在于提供一种脐带间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法，提高干细胞因子的产量、生物活性和稳定性，快速制备得浓度高、无微生物感染风险、可长期保持活性的脐带间充质干细胞因子。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种脐带间充质干细胞因子的制备方法，包括以下步骤：
(1)取脐带上的华通氏胶，离体培养得脐带间充质干细胞，记为p0代；
(2)传代3～5次，即至p3～p5代后，置于低氧环境中培养4～8h，并对细胞进行机械牵拉；
(3)恢复正常氧气浓度，继续培养；
(4)收集细胞上清液，超滤透析，收集截留液，即得脐带间充质干细胞因子。
在其中一些实施例中，步骤(2)中所述的置于低氧环境中培养为：于(5±0.5)％co2和(5±0.5)o2的条件下培养。
在其中一些实施例中，所述对细胞进行机械牵拉的方法为：
传代时将细胞转移至机械牵拉细胞培养盒中，细胞贴壁附着于机械牵拉细胞培养盒的弹性膜上生长；所述机械牵拉包括：一次将弹性膜拉长15％～30％。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述的离体培养得脐带间充质干细胞，包括以下步骤：
取脐带上的华通氏胶，置于培养皿中至贴壁后，加入培养基，于二氧化碳培养箱中培养；2～3日后，将其中一半的培养基更换为新鲜的培养基，继续培养4～5日，华通氏胶的组织块周边会有间充质干细胞克隆出现，更换新的培养基继续培养，至细胞融合度达到80％～90％时，弃去组织块，即得。
在其中一些实施例中，步骤(4)所述的超滤透析为：通过30～50kd的超滤膜进行超滤透析，取透析液；再将透析液通过90～110d超滤膜，收集截流液。
本发明还提供了一种脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，具体技术方案如下：
一种脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将如上所述制备得到的脐带间充质干细胞因子的浓缩液，加入冻干保护剂，冻干，即得。
在其中一些实施例中，所述冻干保护剂为：每100ml所述脐带间充质干细胞因子的浓缩液中，加入以下组分：5～20g脱脂乳粉、1～15g海藻糖、2～10g羧甲基纤维素、1～5g羟乙基淀粉、0.01～0.1g谷氨酰胺、1～5g泊洛沙姆。
在其中一些实施例中，所述冻干的条件为：以9～11℃/min的速度降至-60～-45℃，维持冷冻1～3小时；后置于真空冷冻干燥机中于压强10～50pa，温度-38～35℃的条件下冻干20～48h。
本发明还提供了一种脐带间充质干细胞因子冻干粉，具体技术方案如下：
一种脐带间充质干细胞因子冻干粉，由如上所述的制备方法制备得到。
本发明还提供了一种脐带间充质干细胞因子冻干粉的应用，具体技术方案如下：
脐带间充质干细胞因子冻干粉在制备促进伤口愈合的药物或医用材料中的应用。
基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明的发明人在培养干细胞中发现，低氧刺激和机械刺激在脐带间充质干细胞的培养中，可提升细胞因子的分泌能力，本发明通过将脐带上的华通氏胶离体培养得到的脐带间充质干细胞在低氧和机械刺激的环境下培养，制备得到脐带间充质干细胞因子。其中，选用脐带间充质干细胞避开了社会伦理争议，增殖较快、免疫排斥低，而且该干细胞因子的制备方法制备得到的细胞因子的含量高、促进伤口愈合的活性好。
进一步地，本发明采用上述方法培养脐带间充质干细胞制备得到的干细胞因子与合适的冻干粉保护剂制备得到脐带间充质干细胞因子冻干粉，其有利于干细胞因子的长期稳定保存。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供了一种脐带间充质干细胞因子的制备方法，包括以下步骤：(1)取脐带上的华通氏胶，离体培养得脐带间充质干细胞，记为p0代；(2)传代3～5次，即至p3～p5代后，置于低氧环境中培养4～8h，并对细胞进行机械牵拉；(3)恢复正常氧气浓度，于二氧化碳培养箱中继续培养；(4)收集细胞上清液，超滤透析，收集截留液，即得脐带间充质干细胞因子。
具体地，取脐带上的华通氏胶，离体培养得脐带间充质干细胞的方法为：取脐带上的华通氏胶，置于培养皿中至贴壁后，加入培养基，于二氧化碳培养箱中培养；2～3日后，将其中一半的培养基更换为新鲜的培养基，继续培养4～5日，华通氏胶的组织块周边会有间充质干细胞克隆出现，更换新的培养基继续培养，至细胞融合度达到80％～90％时，弃去组织块，即得。优选地，脐带间上的华通氏胶按照以下步骤获取得到：1)在超净台中取出运输液中的脐带，放于培养皿中，用清洗液洗涤数遍已去除脐带表面的血液；2)将清洗后的脐带，剪成2-3cm长的小段于培养皿，用清洗液逐个洗涤数遍，已去除残留在里面的血液；3)每一段再经无抗生素的0.9％的无菌生理盐水清洗数遍，将羊膜动静脉管剥离，只保留华通氏胶体。优选地，将华通氏胶体置于培养皿中培养的步骤包括：将所有的华通氏胶体移至离心管中，加入1-2倍的生理盐水，用剪刀将其剪碎，800～1000g，离心3～8min；5)弃去上清，将组织沉淀平均分于60cm2的培养皿中，待其贴壁加入8～10ml脐带间充质干细胞培养基，放于(37±5)℃，(5±0.5)％二氧化碳培养箱培养。其中，优选的脐带间充质干细胞培养基为：lonza12-725f。
优选地，离体培养的步骤包括：1)当培养上述脐带华通氏胶组织块2～3天，对其进行半换液处理即加入4～6ml新鲜培养基；2)培养4～6天，组织块周边会有间充质干细胞克隆出现，可记为p0代，进行全换液处理；3)培养5～6d，间充质干细胞融合度达到80～90％，弃去脐带组织块和原有培养液，生理盐水洗涤一次；4)加入2～3ml0.25％胰酶，放于培养箱中消化20～30s，加入盐水进行稀释消化液，轻轻吹到细胞使其脱落；5)上述(4)所制得的细胞悬液经100μm滤网过滤以去除残余的组织碎片，300～400g，离心5～6min，弃去上清，加新鲜培养基重悬细胞沉淀，并以1:3～4的比例进行传代。
优选地，步骤(2)中所述的置于低氧环境中培养为：于(5±0.5)％co2和(5±0.5)o2的条件下培养。进一步优选地，对细胞进行机械牵拉的方法为：传代时将细胞转移至机械牵拉细胞培养盒中，细胞贴壁附着于机械牵拉细胞培养盒的弹性膜上生长；所述机械牵拉包括：一次将弹性膜拉长15％～30％。具体地，1)待细胞长至85％左右时进行传代培养，并进行细胞表型的鉴定；2)将p3～p5细胞传至机械牵拉细胞培养盒中，细胞生长密度达到50％～65％时，对细胞进行37℃，5％co2，5％o2作用6h，之后根据培养盒壁上的刻度一次将弹性膜拉长20％，继续置于二氧化碳培养箱培养；3)待细胞浓度达到85％～90％收集细胞上清液，9000～10000rpm，4～6℃，离心8～12min，以除去细胞碎片。
优选地，步骤(4)所述的超滤透析为：通过30～50kd的超滤膜进行超滤透析，取透析液；再将透析液通过90～110d超滤膜，收集截流液。
本发明还提供了一种充质干细胞因子冻干粉的制备方法，包括以下步骤：将如上所述制备得到的脐带间充质干细胞因子的浓缩液，加入冻干保护剂，冻干，即得。
优选地，所述冻干保护剂为：每100ml所述脐带间充质干细胞因子的浓缩液中，加入以下组分：5～20g脱脂乳粉、1～15g海藻糖、2～10g羧甲基纤维素、1～5g羟乙基淀粉、0.01～0.1g谷氨酰胺、1～5g泊洛沙姆。
进一步优选地，所述冻干的条件为：以9～11℃/min的速度降至-60～-45℃，维持冷冻1～3小时；后置于真空冷冻干燥机中于压强10～50pa，温度-38～35℃的条件下冻干20～48h。
本发明还提供了一种脐带间充质干细胞因子冻干粉，由上述方法制备得到。
本发明所述的脐带间充质干细胞因子冻干粉，还可以在制备促进伤口愈合的药物或医用材料中应用，其具有很好的促进伤口愈合和组织修复功能。
本发明所选用的细胞培养基及冻干粉保护剂中均无血清的添加，避免了病原微生物的感染问题，在后续的应用中，尤其是在制备促进伤口愈合的药物或医用材料中的应用中，具有较高安全性，且具有优异的效果。
下面结合具体实施例对本发明进行更全面的说明：
实施例1
本实施例提供了一种脐带间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法，具体步骤如下：
(一)冻干保护剂的配制
每100ml细胞因子浓缩液有以下组分：15g脱脂乳粉、10g海藻糖、8g羧甲基纤维素、3g羟乙基淀粉、0.05g谷氨酰胺、3g泊洛沙姆。
(二)脐带间充质干细胞的分离
1)在超净台中取出运输液中的脐带，放于培养皿中，用清洗液洗涤数遍已去除脐带表面的血液；
2)将清洗后的脐带，剪成2-3cm长的小段于培养皿，用清洗液逐个洗涤数遍，已去除残留在里面的血液；
3)每一段再经无抗生素的0.9％的无菌生理盐水清洗数遍，将羊膜动静脉管剥离，只保留华通氏胶体；
4)将所有的华通氏胶体移至50ml离心管中，加入1-2倍的生理盐水，用剪刀将其剪碎，800g，离心5min；
5)弃去上清，将组织沉淀平均分于60cm2的培养皿中，待其贴壁加入8ml脐带间充质干细胞培养基(lonza12-725f)，放于37℃，5％二氧化碳培养箱培养。
(三)脐带间充质干细胞的培养
1)当培养上述脐带块2d，对其进行半换液处理即加入4ml新鲜培养基；
2)培养4d，组织块周边会有间充质干细胞克隆出现，可记为p0代，进行全换液处理；
3)培养5-6d，间充质干细胞融合度达到90％，弃去脐带组织块和原有培养液，2ml生理盐水洗涤一次，弃去；
4)加入2ml0.25％胰酶，放于培养箱中消化30s，加入2ml盐水进行稀释消化液，轻轻吹到细胞使其脱落；
5)上述(4)所制得的细胞悬液经100μm滤网过滤以去除残余的组织碎片，300g，离心5min，弃去上清，加3ml新鲜培养基重悬细胞沉淀，并以1:3的比例进行传代。
(四)脐带间充质干细胞因子的制备
1)待细胞长至85％左右时进行传代培养，并进行细胞表型的鉴定；
2)将p3～p5细胞传至机械牵拉细胞培养盒中，细胞生长密度达到50％～65％时，对细胞进行37℃，5％co2，5％o2作用6h，之后根据培养盒壁上的刻度一次将弹性膜拉长20％，继续置于二氧化碳培养箱培养；
3)待细胞浓度达到85％～90％收集细胞上清液，10000rpm，4℃，离心10min，以除去细胞碎片。
(五)脐带充质干细胞冻干粉的制备
1)上述离心后的上清液，经0.22μm滤膜过滤上清除菌；
2)然后通过40kd超滤膜，收集透析液，再将透析液通过100d超滤膜，收集截留液，得到细胞因子浓缩液，即可；
3)冻干前，先加入冻干保护剂；按照3ml/支分装到无菌、无热原西林瓶；
4)西林瓶的溶液以10℃/min的速度降至-50℃，维持冷冻2小时；
后置于真空冷冻干燥机中于压强35pa，温度-30℃的冻干条件下冻干36h，冻干结束，真空压盖，西林瓶取出，即制备得到脐带间充质干细胞因子冻干粉。
实施例2
本实施例提供了一种脐带间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法，与实施例1相比，步骤(四)中，脐带间充质干细胞因子的制备：2)将p3～p5细胞传至机械牵拉细胞培养盒中，细胞生长密度达到50％～65％时，对细胞进行37℃，5％co2，5％o2作用6h，继续置于二氧化碳培养箱培养；即不进行根据培养盒壁上的刻度一次将弹性膜拉长20％的操作。
其余步骤与实施例1相同。
实施例3
本实施例提供了一种脐带间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法，与实施例1相比，步骤(四)中，脐带间充质干细胞因子的制备：2)将p3～p5细胞传至机械牵拉细胞培养盒中，细胞生长密度达到50％～65％时，根据培养盒壁上的刻度一次将弹性膜拉长20％，继续置于二氧化碳培养箱培养；即不进行对细胞进行37℃，5％co2，5％o2作用6h的操作。
其余步骤与实施例1相同。
实施例4
本实施例提供了一种脐带间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法，与实施例1相比，冻干保护剂为每100ml细胞因子浓缩液有以下组分：5g脱脂乳粉、1g海藻糖、2g羧甲基纤维素、1g羟乙基淀粉、0.01g谷氨酰胺、1g泊洛沙姆。
其余步骤与实施例1相同。
实施例5
本实施例提供了一种脐带间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法，与实施例1相比，冻干保护剂为每100ml细胞因子浓缩液有以下组分：20g脱脂乳粉、15g海藻糖、10g羧甲基纤维素、5g羟乙基淀粉、0.1g谷氨酰胺、5g泊洛沙姆。
其余步骤与实施例1相同。
对比例1
一种脐带间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法，与实施例1相比，步骤(四)中，脐带间充质干细胞因子的制备：2)将p3～p5细胞传至细胞培养皿中置于二氧化碳培养箱培养；不进行机械牵拉和气体环境的改变等操作。
其余步骤与实施例1相同。
对比例2
一种脐带间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法，与实施例1相比，冻干保护剂的配制：每100ml细胞因子浓缩液有以下组分10g葡萄糖、7g海藻糖、3g人血白蛋白。
其余步骤与实施例1相同。
对比例3
一种脐带间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法，与实施例1相比，冻干保护剂中缺少谷氨酰胺。
其余步骤与实施例1相同。
对比例4
一种脐带间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法，与实施例1相比，冻干保护剂中缺少泊洛沙姆。
其余步骤与实施例1相同。
实验例1细胞因子分泌量检测
检测实施例1～3及对比例1间充质干细胞不同的培养方法，对细胞因子含量的影响，用elisa试剂盒对表皮生长因子(egf)、成纤维细胞生长因子(fgf)和血管内皮细胞生长因子(vegf)为代表的细胞因子进行检测。结果如表1所示。
表1不同的培养方法的间充质干细胞的细胞因子分泌量
由表1可见，实施例1～3所制备的egf、fgf、vegf三种细胞因子含量均高于对比例1，结果说明：机械牵拉、5％o2的低氧环境中培养，有利于脐带间充质干细胞分泌细胞因子，脐带间充质干细胞在低氧和机械刺激的环境下，分泌细胞因子的能力增强。实施例1中各细胞因子的分泌量最多，可见机械牵拉和低氧环境按一定的顺序、共同作用所起到的效果更佳。
实验例2不同冻干保护剂的效果检测
检测实施例1、4、5，及对比例2～4不同冻干粉剂制备得到的脐带间充质干细胞冻干粉末中各细胞因子含量，冻干粉末分别放置0、6、12个月，用elisa试剂盒对表皮生长因子(egf)、成纤维细胞生长因子(fgf)和血管内皮细胞生长因子(vegf)为代表的细胞因子进行检测。
其中，将实施例1、4、5，及对比例2～4中的冻干粉与溶媒以1：3的比例混匀，其中溶媒为：3g透明质酸、2gvc溶于50ml无菌纯化水中制备得到。
检测结果如表2所示。
表2不同冻干粉中的间充质干细胞的细胞因子的含量
由表2可见，实施例1、4、5所制备的干细胞因子含量均高于对比例3、4，且放置12个月后，其干细胞因子的含量无显著下降，说明本发明提供的冻干保护剂，在脱脂乳粉、海藻糖、羧甲基纤维素、羟乙基淀粉、谷氨酰胺和泊洛沙姆各组分的合理配合，一方面，有利于保护间充质干细胞因子在冻干时的稳定性及含量，另一方面还保证了间充质干细胞因子在后续储存中的稳定性，有效维持了干细胞因子的含量。其中，对比例3中缺少了谷氨酰胺，对比例4中缺少了泊洛沙姆，其打破了本发明冻干保护剂中各组分的合理配合效果，尤其是缺少了谷氨酰胺和泊洛沙姆的协同作用，从而导致了对比例3和对比例4所述的制备方法制备得到的间充质干细胞冻干粉末中的干细胞因子含量较低，并且在放置6个月和12个月后其含量也有明显下降。而对比例2中，其在制备得到后放置0个月的干细胞因子含量与实施例5虽然没有显著差异，但是，其在放置6个月及放置12个月后，干细胞因子的含量降低，而且，对比例2中采用了人血白蛋白，其具有免疫原性，因此不建议采用。
实验例3细胞活性检测
本实验检测实施例1、4、5，及对比例2～4不同冻干粉保护剂，放置12个月的各细胞因子活性对创面愈合的影响。
1)选取18只健康新西兰大白兔，耳缘静脉消毒缓慢注射3％戊巴比妥钠溶液，待其完全麻醉后进行实验；
2)选取腹部，剃毛用碘伏对其进行消毒，然后用手术刀作1×1cm的创面；
3)先用普通灭菌纱布吸收血液，将实施例1、4、5，及对比例2～4制备的冻干粉，制成水溶液涂抹于伤口处，每日一次，然后用纱布包扎；每组各3只兔；
4)每天观察腹部伤口的变化，观察各伤口的愈合情况、统计大白兔伤口愈合的天数，结果如表3所示。
表3干细胞冻干粉用于促进伤口愈合的效果
由表3可见，实施例1、4、5所制备的干细胞因子冻干粉用于促进兔创面愈合时，兔的愈合平均天数明显小于对比例2～4，说明实施例1、4、5的生长因子活性均高于对比例3、4。本发明所述的干细胞因子冻干粉在脱脂乳粉、海藻糖、羧甲基纤维素、羟乙基淀粉、谷氨酰胺和泊洛沙姆各组分的合理配合，有利于保护间充质干细胞因子在冻干及后续储存的稳定性，有效维持了干细胞因子的生物活性，有效保证了冻干后的干细胞因子促进创面愈合的活性。其中，对比例3中缺少了谷氨酰胺，对比例4中缺少了泊洛沙姆，其打破了本发明冻干保护剂中各组分的合理配合效果，尤其是缺少了谷氨酰胺和泊洛沙姆的协同作用，从而导致了对比例3和对比例4所述的制备方法制备得到的间充质干细胞冻干粉末中的干细胞因子的活性远不如实施例1，其促进创面愈合的平均时间也较长。对比例2中没有采用如本发明所述的冻干保护剂，而是采用了传统常用的葡萄糖、海藻糖与人血白蛋白组成的冻干粉保护剂，其制备得到的干细胞因子冻干粉中的干细胞因子虽然也具有一定的促进创面愈合效果，但效果也比本发明实施例1中的效果差。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。