抗猪戊型肝炎病毒ORF2蛋白单克隆抗体及其制备与应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种抗猪戊型肝炎病毒orf2蛋白单克隆抗体及其制备与应用。

背景技术：

戊型肝炎病毒(hepatitisevirus，hev)属戊型肝炎病毒科戊型肝炎病毒属，是通过消化道传播的无包膜单股正链rna病毒。戊型肝炎虽然是自限性疾病，但其病死率高于甲型与乙型肝炎，在孕妇中甚至可达20％-30％。

哺乳动物hev主要分为4个基因型，但仅有一个血清型。其中基因3型和4型hev为人畜共患病毒，猪和野鹿是其主要的自然储存宿主。目前已有关于人误食了hev感染的猪和野鹿食品而感染暴发戊型肝炎病例的报道。除了猪以外，其他已知的动物源宿主还包括禽类、大鼠、兔、猫鼬、山羊，潜在的动物宿主包括狗、猫、猴等。

猪hev不稳定易降解，难以从载毒标本中分离，而迄今为止仍没有有效的细胞培养模型。因此，对该病毒感染的诊断主要是通过病毒rna的核酸检测和血清中抗病毒抗体的检测。目前，识别猪hev衣壳蛋白的抗体报道较少。仅有少数几株单抗，其识别构象表位，主要应用于病毒感染宿主细胞后病毒的检测，并发现具有一定的中和效应。但是上述单抗是应用人hev衣壳蛋白作为免疫原制备的，其对猪hev衣壳蛋白的亲和力仍有待深入的研究。

目前对于猪血清中hev抗体的检测多用间接elisa，其要求高纯度的包被抗原并极易产生非特异性结果。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测猪戊型肝炎病毒orf2蛋白的单克隆抗体制备及应用方法，利用阻断elisa检测猪血清中抗hev抗体，从而提高对猪血清中抗hev抗体检测的特异性和灵敏性。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种猪戊型肝炎病毒中国山东分离株(hepatitisevirus,hev,chn-sd-shev,genbanknumberkf176351)衣壳蛋白，所述蛋白由猪戊型肝炎病毒中国山东分离株的orf2蛋白c端267个氨基酸构成，其氨基酸序列(qlfysrpvvsangeptvklytsvenaqqdkgiaiphdidlgesrvviqdydnqheqdrptpspapsrpfsvlrandvlwlsltaaeydqttygsstnpmyvsgtvtfvnvatgaqgvsrsldwskvtldgrplttiqqysktfyvlplrgklsfweagttkagypynynttasdqilienaaghrvcistyttnlgsgpvsiaavgvlaphtalavledtvdyparahtfddfcpecralglqgcafqstvaelqrlkmkvgktrey.)与seqidno.1相同。

本发明还提供一株分泌抗猪戊型肝炎病毒orf2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株命名为1e4，微生物保藏号为：cctccno:c2018250；保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址湖北武汉，武汉大学。

作为本发明的另一方面，本发明还提供了一种杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，识别猪hevorf2蛋白序列上第625至628个氨基酸(⁶²⁵eptv⁶²⁸)命名为1e4。

优选的，对所述单克隆抗体进行辣根过氧化物酶的标记，命名为hrp-1e4。

作为本发明的另一方面，本发明还提供一种用于制备杂交瘤细胞株1e4的蛋白，其特征在于，所述蛋白是原核表达的重组蛋白，命名为shev-orf2-c，作为包被抗原，其氨基酸序列与seqidno.1相同。

本发明还提供一种制备权利要求5所述蛋白的方法，通过原核表达所述蛋白。

本发明还提供了单克隆抗体在制备检测猪戊型肝炎病毒的药物中的应用。

本发明具有以下技术效果：

本发明提供了一种抗猪hevorf2蛋白单克隆抗体，该单抗用hrp标记后，可利用其建立阻断elisa方法，建立的方法可显著提高对猪血清中hev抗体检测的特异性和灵敏性。

附图说明

图1为sds-page分析目的蛋白sorf2-c纯化与单克隆抗体1e4的纯化图；其中泳道m：蛋白maker；条带1-2：纯化后的sorf2-c蛋白和单克隆抗体1e4。

图2为间接elisa检测hrp标记后1e4的效价图；

图3为利用hrp-1e4建立的阻断elisa与间接elisa检测56份阳性血清样品的结果比较图；56份血清样品来源于5头攻毒chn-sd-shev后在0,7,14,21,28,35,42,49和56dpi收集到的猪血清。实线与虚线分别代表阻断elisa与间接elisa的cut-off值。

图4为阻断elisa的cut-off值以及利用阻断elisa与不同病毒血清的交叉反应图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1目的蛋白猪戊型肝炎病毒orf2蛋白c端267个氨基酸(sorf2-c)的原核表达

(1)重组目的蛋白的表达与纯化

以猪hevorf2全长质粒为模板，根据orf2蛋白c端267个氨基酸设计引物扩增片段后，通过限制性内切酶bamhⅰ和hindⅲ双酶切后，将其连接在同样利用上述酶双酶切后的pet-21b载体上，然后转化至克隆菌trans5α，培养后提取质粒保存。

将上述保存的sorf2-c阳性重组质粒转化大肠杆菌表达宿主菌bl21(de3)，提取单菌落接种于5ml含氨苄抗性的lb培养基中，在37℃，225rpm条件下过夜振荡培养。次日按1:20的比例接种到新鲜的lb培养基，37℃，225rpm振荡培养至od600nm值至0.6左右，加入异丙基-β-d硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度为1mmol/l，继续培养，在加入iptg6小时后收集大肠杆菌菌液，5000rpm离心10min，弃掉上清。

(2)重组目的蛋白的纯化

将离心后的沉淀超声裂解后，溶解包涵体，按照ni-nta(invitrogen)说明书进行目的蛋白的纯化，sds-page分析蛋白的纯化效果，结果如图1所示，结果显示得到了较纯的目的蛋白，其中泳道m：蛋白maker；条带1-2：纯化后的sorf2-c蛋白和单克隆抗体1e4，每个条带的上样量约为7.5μg，单克隆抗体重链和轻链相对分子质量分别约为50ku和25ku，sorf2-c蛋白约为40ku。

实施例2抗猪戊型肝炎病毒sorf2-c蛋白的单克隆抗体的制备及hrp标记

(1)蛋白的乳化：

将纯化的靶蛋白与完全和不完全弗氏佐剂按照1:1(v/v)混合进行乳化。

(2)免疫程序：

选择6-8周的babl/c小鼠作为免疫动物，每次免疫前尾部静脉采血，两次免疫间隔为2周，第一次用弗氏完全佐剂，蛋白剂量为75μg/只，腹腔注射，总剂量200μl/只。第二次用弗氏不完全佐剂，蛋白剂量仍为75μg/只。参考第二次相同的剂量和方式进行第三次免疫，融合前加强免疫一次。

(3)细胞融合：

断颈处死免疫好的balb/c小鼠，无菌取免疫小鼠的脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞按5:1在1ml50％peg下融合，然后利用hat培养基进行选择培养。

(4)阳性细胞的筛选及亚克隆：

以提纯的靶蛋白为抗原(200ng/well)包板，吸取细胞培养上清以间接elisa方法筛选阳性的细胞克隆，结果显示阳性孔，继续做亚克隆，同时扩大培养并冻存。采用有限稀释法对所选择的杂交瘤细胞进行2次亚克隆，筛选到一株阳性杂交瘤细胞株为1e4，该杂交瘤细胞株于2018年12月03xx日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北武汉，武汉大学，保藏编号为cctccno:c2018250。

(5)单克隆抗体腹水的制备及纯化：

收集培养至生长期的杂交瘤细胞，用0.01mpbs(含k+，ph7.2)洗两次后计数然后每只小鼠腹腔注射个细胞(体积为0.5ml)的细胞悬液。接种后7-10天，观察小鼠活动缓慢，腹部明显胀大，用注射器针头插入腹腔内，收集腹水。将腹水放入25ml的小烧杯中，逐滴加入等体积的饱和硫酸铵，慢慢搅拌2h后，10000rpm离心后沉淀，沉淀用0.01m的pbs(ph7.2)重悬，然后用proteing亲和层析柱进一步纯化单克隆抗体，见图1。

(6)hrp标记纯化后的单克隆抗体：

1)材料准备

a)辣根过氧化酶(hrp)：货号为cat.p8375,typeⅵ，sigma。

b)0.1mnaio4：称取0.214gnaio4，溶于10ml四蒸水中。

c)1mm醋酸钠缓冲液(ph4.4)：称取0.1361g结晶乙酸钠溶于1l四蒸水中，用冰乙酸调ph至4.4。

d)0.2m碳酸盐缓冲液(ph9.5)：将0.32gna2co3,0.586gnahco3溶于50ml四蒸水中，调ph为9.5。

e)0.02m碳酸盐缓冲液(ph9.5)：分别配制0.02mna2co3和0.02mnahco3于200ml的试剂瓶中，慢慢加入0.02m的na2co3，调ph至9.5。

f)nabh4(4mg/ml)

g)0.01mpbs(ph7.2)

h)igg：利用milliporeconcentrator将纯化的igg浓缩至10mg/ml.

2)hrp标记单克隆抗体

a)称取5mghrp于玻璃试管中，加入1.25ml四蒸水，混匀后，加入新鲜配制0.25ml0.1mnaio4室温下，避光，缓慢搅拌20min。

b)4℃透析过夜，透析袋外液体为1mm醋酸钠缓冲液(ph4.4)。

c)加入25μl0.2m碳酸盐缓冲液(ph9.5)，然后加入100μl浓度为10mg/ml的igg，室温，避光，缓慢搅动2h。

d)加入100μl新鲜配制的nabh4(4mg/ml)，混匀后4℃静置2h。

e)4℃透析过夜，透析袋外液体为0.01mpbs(ph7.2)。

f)从透析袋中取出hrp-igg，加入等体积的甘油，然后加入浓度为1mg/ml的bsa，分装保存于-20℃。

3)hrp-1e4的效价测定

hrp-1e4梯度稀释(10^-1至10^-4)后，通过间接elisa与纯化的sorf2-c蛋白反应。当od450nm值为0.3时，hrp-1e4的滴度为10^-2，结果如图2所示。hrp-1h5作为无关单克隆抗体对照(hrp-1h5为以禽hevorf2蛋白免疫小鼠后，通过细胞融合、亚克隆筛选及单抗的筛选与纯化后得到的单克隆抗体)。

实施例3猪戊型肝炎病毒特异性抗体阻断elisa诊断方法的建立

(1)阻断elisa方法最佳反应条件优化

1)溶液配制

a)包被缓冲液液：0.01mpbs(500ml，ph＝7.2±0.1)：nacl4.25g，nah2po4·2h2o0.178g，na2hpo4·12h2o1.386g，溶解定容至500ml，测量ph值在7.1-7.3，常温可保存一周；

b)洗涤液(pbst)：每1l0.01mpbs(ph＝7.2±0.1)加入5mltween-20，充分混匀；

c)封闭液：将2.5g脱脂奶粉溶解于100mlpbst中，短期保存于4℃，长期保存于-20℃；

d)底物tmb(显色液)：a液(1l)：称取66.5063g柠檬酸钾(potassiumcitrate)，用800ml四蒸水溶解并用浓盐酸调节ph值至4.0,加入3-4μlh2o2，定容至1l，4℃保存。b液(30ml)：称取0.2956g四甲基联苯胺(tmb)，0.0633g四丁基硼氢化铵(tbabh)溶于30ml二甲基乙酰胺(dma)，4℃避光保存。使用时将a液和b液以39:1比例混合，现配现用；

e)终止液：3m浓h2so4。

2)包被抗原和被阻断抗体最佳浓度确定

按棋盘方阵法进行，将猪hev的重组蛋白sorf2-c分别用包被缓冲液稀释至终浓度2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml，4℃包被过夜，然后用pbst(含0.05％tween-20的0.1mpbs)洗板，加入含2.5％脱脂奶粉的pbst(封闭液)，200μl/孔，室温孵育1h，洗涤后加入用pbst按1:100、1:1000、1:10000稀释的hrp-1e4单克隆抗体，进行间接elisa，室温孵育1h，洗涤板后，加入tmb(100μl/孔)室温显色15分钟，然后加入3mh2so4终止反应，酶标板测od450nm值。结果如下表1所示，结果显示，包被抗原稀释至8μg/ml，hrp-1e4单抗稀释至1:1000为最佳工作浓度，此时od450nm的值约为1.0。

表1抗原包被浓度和单克隆抗体稀释度初次优化

3)待检猪血清的最佳稀释度确定

按照上述优化的抗原和hrp-1e4单抗的最佳工作浓度进行elisa反应，加入封闭液洗涤后，先分别加入1:10，1:20和1:40稀释的猪hev抗体阳性和阴性猪血清，室温孵育1h，洗板后，加入最佳工作浓度的hrp-1e4单抗，然后按照上述方法加入100μl显色液和50μl终止液，然后进行读数。结果如下表2所示，结果显示，根据阴性和阳性猪血清的阻断率，1:20稀释猪血清为最佳稀释比例。

表2待检猪血清稀释比例选择

4)阻断elisa最佳反应条件

根据上述步骤2)和3)确定的最佳浓度来确定阻断elisa最佳反应条件，具体步骤为：

a)在96孔酶标板上每孔加入终浓度为8μg/ml重组蛋白sorf2-c，100μl，4℃包被过夜，pbst洗板；

b)每孔中加入含2.5％脱脂奶粉的pbst(封闭液)，200μl/孔，室温孵育1h，pbst洗板；

c)每孔加入100μl1:20稀释的待检猪血清，双孔复检，同时设立标准阳性照和标准阴性对照，室温孵育1h，pbst洗板；

d)每孔加入100μl1:1000稀释的hrp-1e4，室温孵育1h，pbst洗板；

e)每孔加入100μltmb显色液，室温孵育15min，每孔加入50μl3mh2so4终止反应；

f)自动酶标仪读数od450nm，计算阻断率(pi(％)＝[1-(阳性血清的od450nm/阴性血清的od450nm)]×100％.)。

(2)临界值的确定

取230份用商业试剂盒(万泰生物，北京)检测呈阴性的猪血清和56份临床收集的猪hev抗体阳性血清样品(间接elisa检测阴性)，利用上述步骤4)确定的阻断elisa的反应条件进行检测，并计算阻断率，计算血清样品的平均阻断率(x)为6.4％，标准差(s)为3.5％。根据公式：临界值＝6.4％+3(或2)×3.5％，计算得出阴阳性判定标准的临界值为16.9％。当样本阻断率≥16.9％时为阳性，当阻断率＜13.4％时为阴性。当13.4％＜样本阻断率＜16.9％判断为可疑，需重复检测，如果仍低于16.9％，则判为阴性。

(3)阻断elisa的重复性试验

56份由商业elisa试剂盒检测呈阳性的临床血清的od450nm由高到低被分为6组(0.3-0.4，0.4-0.5，0.5-0.6，0.6-0.7，0.7-0.8，大于0.8)，每组中抽取一份样本来测定阻断elisa的重复性。用相同批次和不同批次的3个elisa板进行批间和批内重复性试验，计算变异系数。结果见下表3，结果显示，6份血清在批间和批内实验中的变异系数均小于10％，证明该阻断elisa检测方法具有良好的重复性。

表3阻断elisa的重复试验结果

(4)阻断elisa反应的交叉反应实验

按照上述步骤4)确定的阻断elisa反应条件，对现存已知的40份猪蓝耳病病毒(prrsv)，17份猪瘟病毒(csfv)，37份猪圆环病毒(pcv)的阳性血清进行检测，同时以56份猪hev阳性血清作为阳性对照。结果如图4所示，结果显示，除猪hev抗体阳性猪血清为阳性反应外，其与均为阴性应，证明该阻断elisa方法可特异性检测猪hev抗体，不与其他几种猪病的阳性血清发生反应。

(5)阻断elisa的敏感性和特异性试验

2542份临床猪血清样本用于测定所建立的阻断elsia方法与wangetal.建立的间接elisa方法的一致性，其中结果不一致的血清继续用于测定阻断elsia与蛋白质免疫印迹(westernblot)以及商业试剂盒(万泰生物，北京)的一致性，计算公式为：一致性(％)＝(b+d)/(a+c)×100％。结果见下表4，结果显示，阻断elisa与间接elisa、westernblot以及商业试剂盒的一致性分别为93.23％，92％和95％，kappavalue均大于0.45％。

表4一致性比较

注：一致性(％)＝(b+d)/(a+c)×100；kappa值被用于测定阻断elisa和其它方法的一致性，其值大于0.45被认为有差异显著。(+/-分别表示用特定elisa方法检测结果为阳性+或阴性-，a,b，c和d是用于一致性公式的对应计算项的表示。)

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110>西北农林科技大学

<120>抗猪戊型肝炎病毒orf2蛋白单克隆抗体及其制备与应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>267

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

glnleuphetyrserargprovalvalseralaasnglygluprothr

151015

vallysleutyrthrservalgluasnalaglnglnasplysglyile

202530

alaileprohisaspileaspleuglygluserargvalvalilegln

354045

asptyraspasnglnhisgluglnaspargprothrproserproala

505560

proserargpropheservalleuargalaasnaspvalleutrpleu

65707580

serleuthralaalaglutyraspglnthrthrtyrglyserserthr

859095

asnpromettyrvalserglythrvalthrphevalasnvalalathr

100105110

glyalaglnglyvalserargserleuasptrpserlysvalthrleu

115120125

aspglyargproleuthrthrileglnglntyrserlysthrphetyr

130135140

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145150155160

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165170175

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180185190

thrasnleuglyserglyprovalserilealaalavalglyvalleu

195200205

alaprohisthralaleualavalleugluaspthrvalasptyrpro

210215220

alaargalahisthrpheaspaspphecysproglucysargalaleu

225230235240

glyleuglnglycysalapheglnserthrvalalagluleuglnarg

245250255

leulysmetlysvalglylysthrargglutyr

260265