多肽、其生产方法和用途与流程

本发明属于基因工程
技术领域：
，涉及多肽及其制备方法和用途。
背景技术：
：胶原蛋白是广泛分布于人体结缔组织的一类蛋白质，也是人体中含量最多的蛋白质，可以占到蛋白质总量的25％～35％。它的主要功能体现在维护细胞外环境，维持组织器官的正常生理功能，修复肌体损伤等方面。胶原蛋白是天然的生物资源，具有其它高分子材料所望尘莫及的生物组织相容性，对细胞的支撑弹性和可降解性，因此，胶原蛋白可以广泛的应用在医药和化妆品等行业中。然而，天然胶原蛋白无法溶于水，性质不均一，很难被人体利用，往往需要利用化学手段处理之后使用。而且，当前市场上销售的胶原蛋白产品都是取自猪、牛、鱼等动物组织中，很难避免病毒感染，同时无法与人体相容，会导致免疫排斥和过敏症状。如果从人胎盘原料中提取，不仅来源有限，更面临法律的严惩。所以，目前的胶原蛋白只能在化妆品和保健品中使用，根本无法发挥胶原蛋白的原本生物学功能。从结构上来说，人体天然的胶原蛋白的结构非常的复杂，所以才导致人源胶原蛋白极难通过常规手段表达和大量制备。天然胶原分子形成了一种特殊的超螺旋结构，由三条无链内氢键形成而仅受链间氢键支撑的多肽链组成。这种螺旋性的结构是以3个氨基酸残基为基本重复体的左手螺旋，这3个氨基酸残基通常为gly-x-pro。gly对胶原蛋白中氢键的形成是必须的，它本身没有侧链，可以使胶原蛋白紧密堆积。在更高级的结构层次上，胶原超螺旋会进一步缔合成为胶原原纤维。在生物体中，胶原蛋白的合成和修饰从原胶原开始，经历了羟基化、糖基化、相互交联等诸多化学变化，受到了多种生物酶的复杂调控。原胶原除了含有胶原链之外，还含有球状的头部和尾部。没有这些头部和尾部，胶原链就不会折叠成为正确的三螺旋，从而缺乏胶原蛋白的生物学活性。因此，按照原始基因序列制备的胶原蛋白不可能在体外自发的组织形成正确的空间结构。这样的困难严重阻碍了人胶原蛋白的研发和生产。生产胶原蛋白的传统方法是利用酸、碱、酶解法处理动物来源的组织，提取胶原蛋白衍生物。这些方法提取的胶原蛋白本身已经丧失了原本的生物学活性，无法应用于生物医学领域发挥真正的功能。随着现代生物技术的发展，人们不断尝试利用转基因技术，在动物、植物和微生物表达体系中制备重组人胶原蛋白，解决了传统提取工艺的诸多缺点。国外研究机构通过培育含人胶原蛋白基因的小鼠，得到了含有人胶原蛋白的乳汁，但是这样生产的成本过高，生产周期过长，无法投入大规模生产。中国专利发明201210482543.2公开了一种重组人源胶原蛋白以及其生产方法，其中公开了通过接头连接iii型胶原蛋白肽段并且在c端添加稳定序列获得的重组人源胶原蛋白。然而，本领域需要更多的具有更好特性的重组人源胶原蛋白。技术实现要素：本发明提供以下内容：1.多肽，所述多肽包含以seqidno.1所示的序列的n个重复，n为大于等于1的整数，优选地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20、24、或32，其中当n为大于等于2的整数时，各重复序列之间是直接连接的。2.根据项1所述的多肽，其中所述多肽包含以seqidno.2所示的序列或者不含以seqidno.2所示的序列。3.根据项1或2所述的多肽，其中所述多肽包含：a)seqidno.3的氨基酸序列；b)与seqidno.3的氨基酸序列具有90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其保留seqidno.3的氨基酸序列的细胞黏附效果；c)seqidno.3的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，其保留seqidno.3的氨基酸序列的细胞黏附效果；或d)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码seqidno.3的氨基酸序列的多核苷酸序列在严格条件条件下杂交，所述氨基酸序列保留seqidno.3的氨基酸序列的细胞黏附效果，所述严格条件是中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。4.多核苷酸，其编码根据项1-3中任一项所述的多肽。5.表达载体，其包含根据项4所述的多核苷酸，并且任选地包含编码seqidno.4的核酸序列，其中所述编码seqidno.4的核酸序列与所述多肽的编码核酸序列的5’端直接连接，优选所述表达载体包含seqidno.5的核酸序列。6.宿主细胞，其包含根据项5所述的表达载体，其中所述宿主细胞优选是大肠杆菌。7.根据项1所述的多肽的生产方法，其包括：(1)在生产培养基中培养根据项6所述的宿主细胞并生产多肽；(2)收获多肽，并且任选地酶切多肽，优选用tev蛋白酶酶切多肽；和(3)通过ni柱和/或阴离子交换层析纯化多肽；其中任选地所述生产方法不包括另外的除去内毒素的步骤；其中优选地纯化的多肽基本上不含内毒素或者含有5eu/ml以下的内毒素。8.组合物，其包含根据项1所述的多肽，其中所述组合物优选是医疗器材、组织工程产品、化妆品或保健品，优选地所述多肽为多肽的水溶液形式，优选地所述组合物不含防止多肽降解的组分，优选地所述组合物是长期使用的组合物，所述长期使用优选为半年以上的使用。9.根据项1所述的多肽在制备组合物，优选医疗器材、组织工程产品、化妆品、保健品中的用途，优选地所述多肽为多肽的水溶液形式，优选地所述组合物不含防止多肽降解的组分，所述组合物为长期使用的组合物，所述长期使用为半年以上的使用。10.根据项1所述的多肽促进细胞黏附的用途。11.以seqidno.4所示的氨基酸序列或本发明的表达载体在生产根据本发明的多肽中的用途。本发明的多肽的优点：与现有的重组iii型胶原蛋白相比具有更高的细胞黏附性质；在水溶液中具有更高的稳定性，如半年以上的降解情况证明，因此无需添加防止多肽降解的试剂；通过ni柱和阴离子交换层析纯化就可以消除大部分的内毒素，纯化后的多肽产物基本上不含内毒素或者含有5eu/ml以下的内毒素；本发明的多肽从宿主细胞中以更高的产率和纯度获得。附图说明图1：表达产物的质谱出峰结果；图2：不同重组iii型胶原蛋白的细胞黏附活性比较；图3：不同重组iii型胶原蛋白的细胞表达量情况；图4：不同重组iii型胶原蛋白的纯化情况；图5：不同重组iii型胶原蛋白的稳定性情况；图6：不同重组iii型胶原蛋白的残留内毒素情况；图7：重组iii型胶原蛋白te16c结构解析情况。具体实施方式下文提供进一步的描述以便于理解本发明。如本文中使用，“医疗器械”是指直接或者间接用于人体的仪器、设备、器具、体外诊断试剂及校准物、材料以及其他类似或者相关的物品。如本文中使用，“组织工程产品”是指用于组织工程的产品。组织工程是一门以细胞生物学和材料科学相结合，进行体外或体内构建组织或器官的新兴学科。本发明部分基于发明人的下述发现：在大肠杆菌中表达包含多个以seqidno.1为重复序列的多肽时，由于目的蛋白为截短体蛋白，缺乏全长蛋白的铰链区结构，为了提高重组表达多肽的成胶性，往往需要在多肽c末端加入铰链区氨基酸gppgpccggg(seqidno.2)等序列帮助成胶(参考文献：journalofbiochemistry.2004；136:643-649)。因此，设计了包含seqidno.3和seqidno.2的多肽序列，例如seqidno.9的序列t16a，但是却发现t16a这种序列的多肽在摇瓶或者发酵培养的时候，大部分目的多肽形成胶状沉淀无法溶解提纯，所以得率很低。之前，为了解决该问题，通过在各重复序列(seqidno.1)之间增加非胶原氨基酸接头来获得包含多个此重复序列的多肽，并且对于此种多肽的改造也主要集中在接头氨基酸残基和c端铰链区氨基酸，又称为c端稳定序列。令人惊讶地，发明人解析了seqidno.1的晶体结构之后发现，seqidno.1这个区域在无铰链区参与的前提下，可以形成非常稳定的胶原三聚体结构。因此，发明人继续改造多肽序列，发现当表达以seqidno.5所示的序列(其包含以seqidno.4所示的序列和以seqidno.3所示的序列)的多肽时可以大量获得以包含seqidno.3所示的序列的多肽，再也不需要c端稳定序列的参与。而且，此时多肽在重组表达的同时不会过早形成胶体结构而影响后期蛋白纯化。此外，发明人还惊讶地发现与中国专利发明201210482543.2中的重组人源胶原蛋白(seqidno.6)相比，本发明的多肽在水溶液中更稳定，并且可以从宿主细胞中以更高的产率和纯度获得，在通过ni柱和阴离子交换柱纯化后具有显著更低的内毒素。gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprsgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprsgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprsgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprspefgppgpccggg(seqidno.6)。在本发明中，使用的seqidno.1重复序列为gergapgfrgpagpngipgekgpagergap(seqidno.1)。本发明的多肽可以包含多个以seqidno.1所示的重复序列，条件是重复序列之间不含接头。在本文中，接头可以是1个以上的氨基酸残基。本发明对重复序列的数目没有限制，只要其能够实现粘附实施例中验证的特性即可。优选地，重复序列的数目是16个，即包含以seqidno.3所示的序列的多肽：gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergap(seqidno.3)本发明的多肽序列可以包含c端序列gppgpccggg(seqidno.2)。本领域技术人员在表达包含多个重复序列的多肽时通常考虑添加该序列来增加表达多肽的稳定性。优选地，多肽序列可以不包含该c端序列gppgpccggg(seqidno.2)，保持了序列和人源iii型胶原蛋白的序列一致性，不引入额外的氨基酸。本发明的多肽序列在表达时应当在其n端增加enlyfq(seqidno.4)序列，其可以通过tev蛋白酶切除而直接获得seqidno.3的序列。优选地，enlyfq(seqidno.4)序列与n端直接连接，即(seqidno.5)：enlyfqgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergap(seqidno.5)。在本发明中，多肽为重组iii型胶原蛋白，它们在本文中与重组人源胶原蛋白可互换使用。在本发明中，重组人源胶原蛋白可以通过本领域中常规的方法进行。例如，可以如下步骤生产：(1)大肠杆菌基因工程菌的构建；(2)大肠杆菌基因工程菌的发酵培养；(3)重组人源胶原蛋白的诱导和表达；以及(4)重组人源胶原蛋白的纯化和任选的酶切。在步骤(1)中，大肠杆菌基因工程菌的构建可以如下进行：(1)得到目的基因片段；(2)将得到的目的基因片段插入pet-32a表达载体中得到重组表达质粒；(3)将重组表达质粒转入大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)中，筛选得到阳性大肠杆菌基因工程菌。在步骤(2)与(3)中，大肠杆菌基因工程菌的发酵培养和重组人源胶原蛋白的诱导和表达可以如下进行：(1)从lab平板中挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，置于10ml的lb培养基中37℃，220rpm培养12-16小时；(2)将菌液按照1：100接种到2×yt培养基中放大培养，37℃培养约3小时，待od600在0.4-0.6时，加入终浓度为0.5mmiptg进行诱导，16℃继续培养20小时，离心收集菌体。在步骤(4)中，重组人源胶原蛋白多肽的纯化和酶切可以如下进行：(1)用磷酸盐缓冲液(40mmnah2po3，500mmnacl，ph7.8)重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；(2)利用ni-nta亲和柱结合重组人源胶原蛋白，10mm咪唑漂洗杂蛋白后，加入tev蛋白酶4℃，16h柱上酶切，最后获得目的胶原蛋白多肽。宿主细胞可以是真核细胞，例如真菌和酵母，原核细胞，例如肠杆菌科细菌。应当理解，本领域技术人员可以通过用其它表达菌株替换上述大肠杆菌菌株作为宿主细胞。本发明还提供了核酸分子，所述核酸分子包括编码本发明的多肽的核酸序列。核酸可以是dna或cdna。核酸分子可以主要由编码本发明所述肽的核酸序列组成，或可以仅由编码本发明所述的肽组成。此类核酸分子可以用本领域已知的方法合成。由于遗传密码的简并性，本领域技术人员应理解，不同核酸序列的核酸分子可以编码相同的氨基酸序列。本发明还提供了载体，所述载体中包括本发明所述的核酸序列。合适的载体是载体构建领域已知的，包括启动子的选择和其他调控元件，例如增强子元件。本发明所述的载体包括适合引入细胞的序列。例如，载体可以是表达载体，在该载体中，所述多肽的编码序列受到它自身顺式作用调控元件的控制，载体的设计便于宿主细胞的基因整合或基因替换等。本领域普通技术人员应理解，在本发明中，术语“载体”包括dna分子，例如，质粒、噬菌体、病毒或其他载体，它含有一个或多个异源的或重组的核酸序列。合适的噬菌体和病毒载体包括，但不限于：λ-噬菌体、embl噬菌体、猿猴病毒、牛疣病毒、epstein-barr病毒、腺病毒、疱疹病毒、小鼠肉瘤病毒、鼠类乳癌病毒、慢病毒等。本发明的多肽包含以seqidno.3所示的序列或以seqidno.3所示的序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸的序列，只要本发明的多肽保留seqidno.3的氨基酸序列的细胞黏附效果。“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个。氨基酸添加指在氨基酸序列，例如seqidno:3的c端或n端添加氨基酸，只要本发明的多肽保留seqidno.3的氨基酸序列的细胞黏附效果。氨基酸取代指在氨基酸序列，例如seqidno:3的序列的某个位置的某个氨基酸残基被其他氨基酸残基替代，只要本发明的多肽保留seqidno.3的氨基酸序列的细胞黏附效果。氨基酸插入指在氨基酸序列例如seqidno:3的序列的适当位置插入氨基酸残基，插入的氨基酸残基也可以全部或部分彼此相邻，或插入的氨基酸之间都不彼此相邻，只要本发明的多肽保留seqidno.3的氨基酸序列的细胞黏附效果。在本文中氨基酸的插入位置不在各重复序列之间。氨基酸缺失指可以从氨基酸序列，例如seqidno：3的序列中删除1、2或3个以上氨基酸，只要本发明的多肽保留seqidno.3的氨基酸序列的细胞黏附效果。在本发明中，取代可以是保守氨基酸取代，指与seqidno：3的氨基酸序列相比，有3个，更佳地2个氨基酸或1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成肽。这些保守性变异肽可以根据表1进行氨基酸替换而产生。最初的残基代表性的取代优选的取代ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；lys；argglnasp(d)gluglucys(c)sersergln(q)asnasnglu(e)aspaspgly(g)pro；alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；pheleuleu(l)ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)leu；val；ile；ala；tyrleupro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；alaleu如本文所使用的，术语“中等严格条件”，“中-高严格条件”，“高严格条件”或“非常高严格条件”描述了核酸杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指导参见currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，n.y.(1989)，6.3.1-6.3.6，其通过引用并入本文。在该文献中描述了含水的和非含水的方法，且可以使用任一种。例如，具体的杂交条件如下：(1)低严格性杂交条件在6x氯化钠/柠檬酸钠(ssc)中，在约45℃，然后在至少50℃，在0.2xssc，0.1％sds中洗涤2次(对于低严格性条件，可以将洗涤温度升高到55℃)；(2)中等严格性杂交条件在6xssc，在约45℃，然后在60℃，在0.2xssc，0.1％sds中洗涤1次或多次；(3)高严格性杂交条件在6xssc，在约45℃，然后在65℃，在0.2xssc，0.1％sds中洗涤1次或多次；且优选地(4)非常高的严格性杂交条件是0.5m磷酸钠，7％sds，在65℃，然后在65℃，在0.2xssc，1％sds中洗涤1次或多次。实施例提供以下实施例来阐述本发明。本领域技术人员应当理解实施例仅仅是例示性的而非限制性的。本发明仅仅由所附权利要求书的范围限定实施例1：重组人源胶原蛋白多肽的构建及表达te16c基因表达载体的构建及表达1.实施例1中使用的人源胶原蛋白te16c全长蛋白序列为seqidno.5所示的序列，全长486aa，对应的基因全长1458bp。针对大肠杆菌的密码子进行了密码优化(核苷酸序列:gaaaacctgtatttccagggtgaacgtggtgcaccaggttttcgtggtccggcaggtccgaatggaattccgggtgagaaaggaccggctggtgagcgtggtgcgccgggtgaacgtggagcgcctggttttcgtggcccagcaggtccgaacggtattcctggtgaaaaaggtccggcgggagagcgtggtgcaccgggtgaacgcggtgcaccgggatttcgtggtccagcaggaccgaatggtatccctggtgaaaaaggaccggcaggtgagcgtggagcgccaggtgaacgtggcgcaccgggttttcgtggaccggcaggcccgaatggtattccgggtgaaaaaggcccggcaggtgaacgtggtgccccgggtgaacgtggtgcgcctggatttcgtggcccggcaggaccgaacggtatccctggagaaaaaggtcctgcaggtgagcgcggtgcgccgggcgagcgtggtgcccctggttttcgcggtccggcaggccctaatggtattcctggagaaaaaggccctgcaggtgaacgcggagcaccgggtgagcgtggcgcacctggttttcgtggtcctgcaggcccgaacggtattccgggcgaaaaaggtccagcaggtgaacgtggtgctccgggtgaacgtggtgcacctggatttcgcggtcctgctggtccgaatggtattccaggtgaaaaaggtccggcaggagagcgtggagcaccgggagaacgtggtgcaccgggctttcgtggtccggccggtcctaacggtatcccaggtgaaaaaggtccggccggcgagcgtggcgcccctggtgagcgtggtgctcctggttttcgtggtccggctggtccgaacggaattcctggtgagaaaggtccggctggcgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggtttccgtggtccggcgggtcctaatggtatcccgggtgaaaaaggtccggcaggtgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggttttcgcggaccggcaggacctaatggtattccgggagaaaaaggacctgcgggtgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggttttcgtggtccggcaggtcctaatggaattcctggagagaaaggacctgcaggtgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggttttcgtggtccggcaggtccaaatggtattccgggtgaaaaaggtccggcaggtgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggttttcgtggtccggcaggtccgaatggcattcctggtgaaaaaggtccggcaggtgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggttttcgtggtccggcaggtccgaatggtattccgggtgaaaaaggtccggcaggtgaacgtggtgcaccg，seqidno.7)后，委托上海华津生物科技有限公司进行基因片段的合成，并将合成后的te16c基因片段通过bamhi(neb公司货号：r0136l)和xhoi(neb公司，货号：r0146l)的酶切位点插入pet32a表达载体。2.将该构建成功的表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)(merck公司)。具体过程为：1：取1μl的该质粒于100μl的大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)中，冰上静置30min。2：将该混合物于42℃水浴锅中热激90s，然后迅速置于冰上静置2min。3：向该混合物中加入600μl无抗性的lb，37℃，220rpm条件下培养1h。4：取200μl该菌液均匀的涂布在含有氨苄青霉素抗性的lb平板上(10g/l蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化钠，15g/l琼脂，100μg/ml氨苄抗生素)。5：将平板倒置培养于37℃温箱中，培养约20h待长出清晰可见的菌落。3.从转化好的lb平板中挑取单克隆菌落于10mllb(含100μg/ml氨苄抗生素)培养基中培养12h-16h后，再按照1:100的比例转接到2×yt培养基(16g/l蛋白胨，10g/l酵母提取物，5g/l氯化钠)中进行扩大培养，37℃，220rpm培养至菌液od600在0.4-0.6时，加入终浓度为0.5mmiptg(sigma公司，货号：i5502-1g)进行诱导表达，诱导条件为18℃、180rpm培养20h。最后离心收集菌体，保存于-20℃或者立即进入下步纯化。4.用磷酸盐缓冲液(ph7.8)(40mm磷酸二氢钠，500mm氯化钠)约50ml重悬(1l)菌体沉淀，利用高压破菌仪器(新芝生物)进行破菌后，13000rpm离心30min，使可溶性蛋白与包涵体充分分离。5.用5倍柱体积的结合缓冲液(bindingbuffer)(40mmnah2po3，500mmnacl，ph7.8)平衡ni-nta(qiagen公司，货号：30210)亲和柱。然后加入蛋白上清于4℃条件下孵育0.5-1h，使目的重组蛋白充分结合到柱材上。再用200ml含有10mm咪唑(sigma公司)的洗涤缓冲液(washingbuffer)(10mm咪唑，40mmnah2po3，500mmnacl，ph7.8)漂洗杂蛋白。最后加入适量具有his标签的tev蛋白酶(sigma,t4455)，于4℃孵育16h后，收集穿流液，即为去除载体蛋白的目的胶原蛋白。所得产物透析过夜，冻干为干粉待用。6.所得te16c蛋白利用sds-page检测纯度。具体过程为：取纯化后的蛋白液40μl，加入10μl5×的蛋白上样缓冲液(250mm的tris-hcl(ph:6.8)，10％sds,0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇)，置于100℃沸水中煮10min，然后每孔10μl加入sds-page蛋白胶中，电压80v跑2h后，用考马斯亮蓝染色液(0.1％考马斯亮蓝r-250，25％异丙醇，10％冰醋酸)进行蛋白染色20min，再利用蛋白脱色液(10％醋酸，5％乙醇)进行脱色。最后与人天然胶原蛋白相对照测量蛋白活性。hc16基因表达载体的构建及表达1.实施例1中使用的对照用人源胶原蛋白hc16全长蛋白序列为seqidno.6所示的序列，全长501aa，对应的基因全长1503bp。针对大肠杆菌的密码子进行了密码优化(核苷酸序列:ggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatctccggaattcggcccgcctggtccttgttgtggcggcggc，seqidno.8)后，委托上海华津生物科技有限公司进行基因片段的合成，并将合成后的hc16基因片段通过bamhi(neb公司货号：r0136l)和xhoi(neb公司，货号：r0146l)的酶切位点插入pet32p表达载体。2.将该构建成功的表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)(merck公司)。具体过程为如上述。3.从转化好的lb平板中挑取单克隆菌落于10mllb(含100μg/ml氨苄抗生素)培养基中培养12h-16h后，再按照1:100的比例转接到2×yt培养基(16g/l蛋白胨，10g/l酵母提取物，5g/l氯化钠)中进行扩大培养，37℃，220rpm培养至菌液od600在0.4-0.6时，加入终浓度为0.5mmiptg(sigma公司，货号：i5502-1g)进行诱导表达，诱导条件为18℃、180rpm培养20h。最后离心收集菌体，保存于-20℃或者立即进入下步纯化。4.用磷酸盐缓冲液(ph7.8)(40mm磷酸二氢钠，500mm氯化钠)约50ml重悬(1l)菌体沉淀，利用高压破菌仪器(新芝生物)进行破菌后，13000rpm离心30min，使可溶性蛋白与包涵体充分分离。5.用5倍柱体积的结合缓冲液(bindingbuffer)(40mmnah2po3，500mmnacl，ph7.8)平衡ni-nta(qiagen公司，货号：30210)亲和柱。然后加入蛋白上清于4℃条件下孵育0.5-1h，使目的重组蛋白充分结合到柱材上。再用200ml含有10mm咪唑(sigma公司)的洗涤缓冲液(washingbuffer)(10mm咪唑，40mmnah2po3，500mmnacl，ph7.8)漂洗杂蛋白。最后加入适量具有his标签的prescissionprotease(简称ppase)(sigma,sae0045)蛋白酶，于4℃孵育16h后，收集穿流液，即为去除载体蛋白的目的胶原蛋白。所得产物透析过夜，冻干为干粉待用。6.所得hc16蛋白利用sds-page检测纯度。具体过程为：取纯化后的蛋白液40μl，加入10μl5×的蛋白上样缓冲液(250mm的tris-hcl(ph:6.8)，10％sds,0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇)，置于100℃沸水中煮10min，然后每孔10μl加入sds-page蛋白胶中，电压80v跑2h后，用考马斯亮蓝染色液(0.1％考马斯亮蓝r-250，25％异丙醇，10％冰醋酸)进行蛋白染色20min，再利用蛋白脱色液(10％醋酸，5％乙醇)进行脱色。最后与人天然胶原蛋白相对照测量蛋白活性。如中国专利发明201210482543.2中相同的方法验证hc16蛋白，显示正确的蛋白质大小。包含重复序列和c端稳定序列的多肽t16a的构建及表达1.实施例1中使用的人源胶原蛋白t16a，其与te16c基因或hc16基因的区别在于，t16a同时包含无接头氨基酸的seqidno.3和铰链区氨基酸seqidno.2，全长490aa，序列为：gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgppgpccggg(seqidno.9)其对应的基因全长1470bp。针对大肠杆菌的密码子进行了密码优化(核苷酸序列:ggtgaacgtggtgcaccaggttttcgtggtccggcaggtccgaatggaattccgggtgagaaaggaccggctggtgagcgtggtgcgccgggtgaacgtggagcgcctggttttcgtggcccagcaggtccgaacggtattcctggtgaaaaaggtccggcgggagagcgtggtgcaccgggtgaacgcggtgcaccgggatttcgtggtccagcaggaccgaatggtatccctggtgaaaaaggaccggcaggtgagcgtggagcgccaggtgaacgtggcgcaccgggttttcgtggaccggcaggcccgaatggtattccgggtgaaaaaggcccggcaggtgaacgtggtgccccgggtgaacgtggtgcgcctggatttcgtggcccggcaggaccgaacggtatccctggagaaaaaggtcctgcaggtgagcgcggtgcgccgggcgagcgtggtgcccctggttttcgcggtccggcaggccctaatggtattcctggagaaaaaggccctgcaggtgaacgcggagcaccgggtgagcgtggcgcacctggttttcgtggtcctgcaggcccgaacggtattccgggcgaaaaaggtccagcaggtgaacgtggtgctccgggtgaacgtggtgcacctggatttcgcggtcctgctggtccgaatggtattccaggtgaaaaaggtccggcaggagagcgtggagcaccgggagaacgtggtgcaccgggctttcgtggtccggccggtcctaacggtatcccaggtgaaaaaggtccggccggcgagcgtggcgcccctggtgagcgtggtgctcctggttttcgtggtccggctggtccgaacggaattcctggtgagaaaggtccggctggcgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggtttccgtggtccggcgggtcctaatggtatcccgggtgaaaaaggtccggcaggtgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggttttcgcggaccggcaggacctaatggtattccgggagaaaaaggacctgcgggtgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggttttcgtggtccggcaggtcctaatggaattcctggagagaaaggacctgcaggtgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggttttcgtggtccggcaggtccaaatggtattccgggtgaaaaaggtccggcaggtgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggttttcgtggtccggcaggtccgaatggcattcctggtgaaaaaggtccggcaggtgaacgtggtgcaccgggtgaacgtggtgcaccgggttttcgtggtccggcaggtccgaatggtattccgggtgaaaaaggtccggcaggtgaacgtggtgcaccgggcccgcctggtccttgttgtggcggcggc，seqidno.10)后，委托上海华津生物科技有限公司进行基因片段的合成，并将合成后的t16a基因片段通过bamhi(neb公司货号：r0136l)和xhoi(neb公司，货号：r0146l)的酶切位点插入pet32p表达载体。2.将该构建成功的表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)(merck公司)。具体过程如上述。3.从转化好的lb平板中挑取单克隆菌落于10mllb(含100μg/ml氨苄抗生素)培养基中培养12h-16h后，再按照1:100的比例转接到2×yt培养基(16g/l蛋白胨，10g/l酵母提取物，5g/l氯化钠)中进行扩大培养，37℃，220rpm培养至菌液od600在0.4-0.6时，加入终浓度为0.5mmiptg(sigma公司，货号：i5502-1g)进行诱导表达，诱导条件为18℃、180rpm培养20h。最后离心收集菌体，保存于-20℃或者立即进入下步纯化。4.用磷酸盐缓冲液(ph7.8)(40mm磷酸二氢钠，500mm氯化钠)约50ml重悬(1l)菌体沉淀，利用高压破菌仪器(新芝生物)进行破菌后，13000rpm离心30min，使可溶性蛋白与包涵体和胶原蛋白胶体充分分离。5.用5倍柱体积的结合缓冲液(bindingbuffer)(40mmnah2po3，500mmnacl，ph7.8)平衡ni-nta(qiagen公司，货号：30210)亲和柱。然后加入蛋白上清于4℃条件下孵育0.5-1h，使目的重组蛋白充分结合到柱材上。再用200ml含有10mm咪唑(sigma公司)的洗涤缓冲液(washingbuffer)(10mm咪唑，40mmnah2po3，500mmnacl，ph7.8)漂洗杂蛋白。最后加入适量具有his标签的prescissionprotease(简称ppase)(sigma,sae0045)蛋白酶，于4℃孵育16h后，收集穿流液，即为去除载体蛋白的目的胶原蛋白。所得产物透析过夜，冻干为干粉待用。6.所得t16a蛋白利用sds-page检测纯度。具体过程为：取纯化后的蛋白液40μl，加入10μl5×的蛋白上样缓冲液(250mm的tris-hcl(ph:6.8)，10％sds,0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇)，置于100℃沸水中煮10min，然后每孔10μl加入sds-page蛋白胶中，电压80v跑2h后，用考马斯亮蓝染色液(0.1％考马斯亮蓝r-250，25％异丙醇，10％冰醋酸)进行蛋白染色20min，再利用蛋白脱色液(10％醋酸，5％乙醇)进行脱色。最后与人天然胶原蛋白相对照测量蛋白活性。包含重复序列和接头氨基酸的多肽t16b的构建及表达1.实施例1中使用的人源胶原蛋白t16b，其与te16c基因或hc16基因的区别在于，t16b在带接头氨基酸的seqidno.6基础上去掉了铰链区氨基酸seqidno.2，全长486aa，序列为：gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprsgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprsgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergaprsgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergap(seqidno.11)其对应的基因全长1458bp。针对大肠杆菌的密码子进行了密码优化(核苷酸序列:ggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacctagatccggcgagcgtggtgcacctggttttcgtggccctgcaggcccgaatggcatcccgggtgaaaaaggcccggcaggcgaacgtggcgcccctggtgaacgcggcgcacctggtttccgtggcccggcaggtcctaacggtatcccgggcgaaaagggtcctgcaggcgagcgtggcgccccgggtgaacgcggtgcccctggctttcgcggtcctgccggccctaacggcattccgggtgagaaaggtcctgccggtgagcgcggtgcccctggtgagcgcggcgcaccgggctttcgtggcccggccggtcctaatggtattcctggcgagaagggtccggcaggtgaacgcggtgcacct，seqidno.12)；委托上海华津生物科技有限公司进行基因片段的合成，并将合成后的t16b基因片段通过bamhi(neb公司货号：r0136l)和xhoi(neb公司，货号：r0146l)的酶切位点插入pet32p表达载体。2.将该构建成功的表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)(merck公司)。具体过程如上述。3.从转化好的lb平板中挑取单克隆菌落于10mllb(含100μg/ml氨苄抗生素)培养基中培养12h-16h后，再按照1:100的比例转接到2×yt培养基(16g/l蛋白胨，10g/l酵母提取物，5g/l氯化钠)中进行扩大培养，37℃，220rpm培养至菌液od600在0.4-0.6时，加入终浓度为0.5mmiptg(sigma公司，货号：i5502-1g)进行诱导表达，诱导条件为18℃、180rpm培养20h。最后离心收集菌体，保存于-20℃或者立即进入下步纯化。4.用磷酸盐缓冲液(ph7.8)(40mm磷酸二氢钠，500mm氯化钠)约50ml重悬(1l)菌体沉淀，利用高压破菌仪器(新芝生物)进行破菌后，13000rpm离心30min，使可溶性蛋白与包涵体和充分分离。5.用5倍柱体积的结合缓冲液(bindingbuffer)(40mmnah2po3，500mmnacl，ph7.8)平衡ni-nta(qiagen公司，货号：30210)亲和柱。然后加入蛋白上清于4℃条件下孵育0.5-1h，使目的重组蛋白充分结合到柱材上。再用200ml含有10mm咪唑(sigma公司)的洗涤缓冲液(washingbuffer)(10mm咪唑，40mmnah2po3，500mmnacl，ph7.8)漂洗杂蛋白。最后加入适量具有his标签的prescissionprotease(简称ppase)(sigma,sae0045)蛋白酶，于4℃孵育16h后，收集穿流液，即为去除载体蛋白的目的胶原蛋白。所得产物透析过夜，冻干为干粉待用。6.所得t16b蛋白利用sds-page检测纯度。具体过程为：取纯化后的蛋白液40μl，加入10μl5×的蛋白上样缓冲液(250mm的tris-hcl(ph:6.8)，10％sds,0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇)，置于100℃沸水中煮10min，然后每孔10μl加入sds-page蛋白胶中，电压80v跑2h后，用考马斯亮蓝染色液(0.1％考马斯亮蓝r-250，25％异丙醇，10％冰醋酸)进行蛋白染色20min，再利用蛋白脱色液(10％醋酸，5％乙醇)进行脱色。最后与人天然胶原蛋白相对照测量蛋白活性。实施例2：te16c蛋白的质谱检测实验方法蛋白样品经dtt还原和碘代乙酰胺烷基化处理后，加入胰蛋白酶酶解过夜。酶解后得到的肽段再经c18ziptip脱盐后，与基质α-cyano-4-hydroxycinnamicacid(chca)混合点板。最后用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪maldi-tof/tofultraflextremetm,brucker,germany进行分析(肽指纹图谱的技术可以参考：proteinj.2016；35:212-7)。数据库检索是通过从本地mascot网站上ms/msionsearch页面处理的。蛋白质鉴定结果是根据酶解后所产生的肽段的一级质谱得到的。检索参数：trypsin酶解，设两个漏切位点。设定半胱氨酸的烷基化为固定修饰，甲硫氨酸的氧化为可变修饰。鉴定所用的数据库为ncbprot。质谱出峰结果如图1所示。表1：质谱检出分子量及对应多肽观察值mr(预期值)肽2246.23232246.1424gapgergapgfrgpagpngipgek2246.23232246.1424gapgfrgpagpngipgekgpager1738.87311738.9095gpagergapgergapgfr1678.90031678.8659gapgfrgpagpngipgek1660.84011661.8607gpagpngipgekgpager1171.59661171.6295gapgergapgfr1093.56361093.5784gpagpngipgek检出多肽片段的覆盖率gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgergapgfrgpagpngipgekgpagergap待定蛋白te16c序列中有98.8％以上的序列可以被质谱检出，检测结果非常可信。待定蛋白的质谱特征峰为2246.2323、2246.2323、1738.8731、1678.9003、1660.8401、1171.5966、1093.5636，得出结论te16c蛋白得到正确表达。实施例3：重组iii型胶原蛋白的性质检测胶原蛋白的活性检测方法可以参考文献jumingyao,satoshiyanagisawa,tetsuoasakura,design,expressionandcharacterizationofcollagen-likeproteinsbasedonthecelladhesiveandcrosslinkingsequencesderivedfromnativecollagens,jbiochem.136,643-649(2004)。具体实施方法如下：1、利用紫外吸收法检测待测蛋白样品的浓度，包括对照人胶原蛋白(sigma，c7774)、对照旧iii型胶原蛋白hc16、新iii型胶原te16c蛋白、对照用t16a蛋白和t16b蛋白样品。具体为分别测定样品在215nm和225nm下的紫外光吸收，利用经验公式c(μg/ml)＝144x(a215-a225)计算蛋白质浓度，注意需在a215<1.5的情况下检测。该方法的原理是测定肽键在远紫外光下的特征吸收，不受生色团含量的影响，干扰物质少，操作简便，适合检测考马斯亮蓝不显色的人胶原蛋白及其类似物。(参考文献为walkerjm.theproteinprotocolshandbook,secondedition.humanapress.43-45.)。检测完蛋白浓度后，用pbs将所有待测蛋白浓度调整到0.5mg/ml。2、向96孔板中加入100μl各种蛋白溶液和空白pbs溶液对照，室温静置60min。3、每孔中加入105个培养状态良好的3t3细胞(来自清华大学童佩老师)，37℃孵育60min。4、每孔用pbs清洗4次。5、用ldh检测试剂盒(roche，04744926001)检测od492nm的吸光度。根据空白对照的数值，可以计算出细胞的贴壁率。计算公式如下：细胞贴壁率＝(测试孔-空白孔)×100％/(阳性孔-空白孔)。细胞的贴壁率即可以反应胶原蛋白的活性。蛋白的活性越高，越能在短时间给细胞提供优质的外环境，帮助细胞贴壁。结果参见图2。图2的结果表明，两种人重组胶原蛋白(即iii型胶原蛋白hc16和iii型胶原te16c)与商品化的人胶原蛋白相比，皆具有更好的黏附活性，而且本发明的重组iii型胶原蛋白te16c实现了最强力的细胞黏附活性。而作为对照用的t16a和t16b的两种构建方式得到的蛋白，细胞黏附活性均低于本发明的te16c蛋白。实施例4：重组iii型胶原蛋白的表达和纯化te16c蛋白表达和纯化1.根据实施例1中的步骤1-5，获得去除载体蛋白的目的胶原蛋白te16c，透析到阴离子交换柱的a液(10mmna2co3，ph10.5，10mmnacl)中。2.用5倍柱体积的a液(10mmna2co3，ph10.5，10mmnacl)平衡阴离子交换柱(hitrapqhpcolumn，5ml，gehealthcarebiosciences)。然后将透析后的te16c蛋白上柱，收集穿过的蛋白峰，即为纯化后的te16c蛋白。所得产物透析过夜，冻干为干粉待用。3.用5倍柱体积的b液(10mmna2co3，ph10.5，1mnacl)洗脱阴离子交换柱，将杂质蛋白和内毒素洗下柱子。以同样的方式处理hc16蛋白、包含重复序列和c端稳定序列的多肽t16a和包含重复序列和接头氨基酸的多肽t16b。图3显示了重组iii型胶原蛋白的表达情况。iii型胶原蛋白hc16提纯之后，1l菌液可以得到8mg左右的纯蛋白。iii型胶原蛋白te16c提纯之后，1l菌液可以得到15mg以上左右的纯蛋白。而作为对照用的t16a和t16b的两种构建方式得到的蛋白，表达量也均没有本发明中的te16c蛋白高。特别注意的是，t16a的构建方式由于蛋白纯化中形成了大量的胶体结构，上清中的可溶蛋白量非常低。图4显示了重组iii型胶原蛋白的纯化情况。iii型胶原蛋白hc16在ni柱和阴离子交换之后纯度在95％左右，而iii型胶原蛋白te16c可以通过ni柱和阴离子交换柱快速纯化到超过99％的纯度。而作为对照用的t16a和t16b的两种构建方式得到的蛋白，纯度虽然较高，但是得率都不高，远低于本发明中的te16c蛋白。实施例5：重组iii型胶原蛋白在水溶液中的稳定稳定性研究1.根据实施例4，获得纯化后的te16c蛋白、hc16、t16a和t16b蛋白，然后对生理盐水(0.9％nacl)透析。收集透析后的蛋白溶液，用0.22μm的滤膜过滤除菌，然后在4-8℃的环境中长期静置。2.在不同的时间点，比如1月，2月，3月，半年，1年等，收集te16c蛋白和hc16蛋白的水溶液，利用sds-page(参考实施例1的方法)检测纯度。图5显示了在半年的时间点，hc16、te16c、t16a和t16b电泳图像。iii型胶原蛋白hc16在水溶液中不太稳定，1个月之后就存在明显的降解，半年的降解就非常严重了。但是iii型胶原蛋白te16c结构稳定，在水溶液中放置半年仍保持90％以上的蛋白为完整的全长蛋白存在，只有少量发生了降解情况。而作为对照用的t16a和t16b的两种构建方式得到的蛋白，也都发生了不同程度的降解，其中t16b的降解情况更为严重，它们的稳定性都远低于本发明中的te16c蛋白。实施例6：重组iii型胶原蛋白的内毒素检测te16c蛋白、hc16蛋白、t16a蛋白和t16b蛋白的内毒素检测1.根据实施例4，准备纯化的te16c蛋白、hc16蛋白、t16a蛋白和t16b蛋白。2.准备试剂，包括鲎试剂(湛江安度斯生物有限公司，λ＝0.015eu/ml)和稀释剂i(湛江安度斯生物有限公司)。3.将内毒素标准品稀释为e1、e0.5、e0.25、e0.125、e0.0625。使用稀释剂i对样品进行5、8、16、32、50、100、200、300、400倍稀释，其它为检测用水稀释，使样品终浓度分别为10、16、32、64、100、200、400、600、800倍。4.将内毒素标准品和稀释的蛋白样品加入鲎试剂中进行观察。结果同时与阴性和阳性对照比较。计算出样品内毒素。图6显示了重组iii型胶原蛋白残留内毒素情况。iii型胶原蛋白hc16结构不太均一，容易与内毒素结合，因此在ni柱和阴离子交换之后残留内毒素约为100eu/ml左右，而新iii型胶原蛋白te16c可以通过ni柱和阴离子交换柱快速纯化到5eu/ml以下的内毒素。而作为对照用的t16a和t16b的两种构建方式得到的蛋白，也和内毒素结合较紧，不容易去除内毒素。实施例7：重组iii型胶原蛋白的解析1._te16c的序列中含有的人iii型胶原蛋白pro488到gly510的区段，根据此区域序列合成若干多肽(北京中美泰和公司)进行广泛的晶体筛选，比如gfrgpagpngipgekgpagerg多肽。2.将多肽用水溶解成为15mg/ml的溶液，用悬滴法进行晶体生长，其中池液的配方为30％(w/v)peg400,0.1mnaacetateph4.6,0.1mcadmiumchloride。将多肽溶液和池液各取1μl混合，然后和1ml的池液封闭在一起。3.大约一周之后，液滴中逐渐长出多肽的单晶，捞出后用液氮快速冷却保存。4.将收集好的多肽晶体送往上海光源的bl-18u1线站进行x射线晶体衍射数据的收集，同时利用线站配套的计算器进行数据分析和结构的解析。通过蛋白质晶体学的方法，我们解析得到了新iii型胶原蛋白te16c中含有的人iii型胶原蛋白pro488到gly510区域的高分辨率三维结构，如图7所示。证实这段区域形成了非常稳定的三聚体结构。因此，不需要再额外添加gppgpccggg的c末端序列，就可以拥有完整的胶原蛋白的结构和功能。序列表<110>山西锦波生物医药股份有限公司<120>多肽、其生产方法和用途<130>c18p3125<160>12<170>patentinversion3.5<210>1<211>30<212>prt<213>人<400>1glygluargglyalaproglypheargglyproalaglyproasngly151015ileproglyglulysglyproalaglygluargglyalapro202530<210>2<211>10<212>prt<213>人工序列<220><223>c端序列<400>2glyproproglyprocyscysglyglygly1510<210>3<211>480<212>prt<213>人工序列<220><223>te16c<400>3glygluargglyalaproglypheargglyproalaglyproasngly151015ileproglyglulysglyproalaglygluargglyalaproglyglu202530argglyalaproglypheargglyproalaglyproasnglyilepro354045glyglulysglyproalaglygluargglyalaproglygluarggly505560alaproglypheargglyproalaglyproasnglyileproglyglu65707580lysglyproalaglygluargglyalaproglygluargglyalapro859095glypheargglyproalaglyproasnglyileproglyglulysgly100105110proalaglygluargglyalaproglygluargglyalaproglyphe115120125argglyproalaglyproasnglyileproglyglulysglyproala130135140glygluargglyalaproglygluargglyalaproglyphearggly145150155160proalaglyproasnglyileproglyglulysglyproalaglyglu165170175argglyalaproglygluargglyalaproglypheargglyproala180185190glyproasnglyileproglyglulysglyproalaglygluarggly195200205alaproglygluargglyalaproglypheargglyproalaglypro210215220asnglyileproglyglulysglyproalaglygluargglyalapro225230235240glygluargglyalaproglypheargglyproalaglyproasngly245250255ileproglyglulysglyproalaglygluargglyalaproglyglu260265270argglyalaproglypheargglyproalaglyproasnglyilepro275280285glyglulysglyproalaglygluargglyalaproglygluarggly290295300alaproglypheargglyproalaglyproasnglyileproglyglu305310315320lysglyproalaglygluargglyalaproglygluargglyalapro325330335glypheargglyproalaglyproasnglyileproglyglulysgly340345350proalaglygluargglyalaproglygluargglyalaproglyphe355360365argglyproalaglyproasnglyileproglyglulysglyproala370375380glygluargglyalaproglygluargglyalaproglyphearggly385390395400proalaglyproasnglyileproglyglulysglyproalaglyglu405410415argglyalaproglygluargglyalaproglypheargglyproala420425430glyproasnglyileproglyglulysglyproalaglygluarggly435440445alaproglygluargglyalaproglypheargglyproalaglypro450455460asnglyileproglyglulysglyproalaglygluargglyalapro465470475480<210>4<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>n端序列<400>4gluasnleutyrphegln15<210>5<211>486<212>prt<213>人工序列<220><223>具有n端序列的te16c<400>5gluasnleutyrpheglnglygluargglyalaproglyphearggly151015proalaglyproasnglyileproglyglulysglyproalaglyglu202530argglyalaproglygluargglyalaproglypheargglyproala354045glyproasnglyileproglyglulysglyproalaglygluarggly505560alaproglygluargglyalaproglypheargglyproalaglypro65707580asnglyileproglyglulysglyproalaglygluargglyalapro859095glygluargglyalaproglypheargglyproalaglyproasngly100105110ileproglyglulysglyproalaglygluargglyalaproglyglu115120125argglyalaproglypheargglyproalaglyproasnglyilepro130135140glyglulysglyproalaglygluargglyalaproglygluarggly145150155160alaproglypheargglyproalaglyproasnglyileproglyglu165170175lysglyproalaglygluargglyalaproglygluargglyalapro180185190glypheargglyproalaglyproasnglyileproglyglulysgly195200205proalaglygluargglyalaproglygluargglyalaproglyphe210215220argglyproalaglyproasnglyileproglyglulysglyproala225230235240glygluargglyalaproglygluargglyalaproglyphearggly245250255proalaglyproasnglyileproglyglulysglyproalaglyglu260265270argglyalaproglygluargglyalaproglypheargglyproala275280285glyproasnglyileproglyglulysglyproalaglygluarggly290295300alaproglygluargglyalaproglypheargglyproalaglypro305310315320asnglyileproglyglulysglyproalaglygluargglyalapro325330335glygluargglyalaproglypheargglyproalaglyproasngly340345350ileproglyglulysglyproalaglygluargglyalaproglyglu355360365argglyalaproglypheargglyproalaglyproasnglyilepro370375380glyglulysglyproalaglygluargglyalaproglygluarggly385390395400alaproglypheargglyproalaglyproasnglyileproglyglu405410415lysglyproalaglygluargglyalaproglygluargglyalapro420425430glypheargglyproalaglyproasnglyileproglyglulysgly435440445proalaglygluargglyalaproglygluargglyalaproglyphe450455460argglyproalaglyproasnglyileproglyglulysglyproala465470475480glygluargglyalapro485<210>6<211>501<212>prt<213>人工序列<220><223>hc16<400>6glygluargglyalaproglypheargglyproalaglyproasngly151015ileproglyglulysglyproalaglygluargglyalaproglyglu202530argglyalaproglypheargglyproalaglyproasnglyilepro354045glyglulysglyproalaglygluargglyalaproglygluarggly505560alaproglypheargglyproalaglyproasnglyileproglyglu65707580lysglyproalaglygluargglyalaproglygluargglyalapro859095glypheargglyproalaglyproasnglyileproglyglulysgly100105110proalaglygluargglyalaproargserglygluargglyalapro115120125glypheargglyproalaglyproasnglyileproglyglulysgly130135140proalaglygluargglyalaproglygluargglyalaproglyphe145150155160argglyproalaglyproasnglyileproglyglulysglyproala165170175glygluargglyalaproglygluargglyalaproglyphearggly180185190proalaglyproasnglyileproglyglulysglyproalaglyglu195200205argglyalaproglygluargglyalaproglypheargglyproala210215220glyproasnglyileproglyglulysglyproalaglygluarggly225230235240alaproargserglygluargglyalaproglypheargglyproala245250255glyproasnglyileproglyglulysglyproalaglygluarggly260265270alaproglygluargglyalaproglypheargglyproalaglypro275280285asnglyileproglyglulysglyproalaglygluargglyalapro290295300glygluargglyalaproglypheargglyproalaglyproasngly305310315320ileproglyglulysglyproalaglygluargglyalaproglyglu325330335argglyalaproglypheargglyproalaglyproasnglyilepro340345350glyglulysglyproalaglygluargglyalaproargserglyglu355360365argglyalaproglypheargglyproa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