抗-cd20单克隆抗体的制作方法

专利名称：抗-cd20单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗-⑶20单克隆抗体。
背景技术：
⑶20是一种不含有糖链的蛋白，其在人-B淋巴细胞的细胞表面上得到表达。除了 外周血、脾脏、扁桃体和骨髓中的正常B-细胞以外，⑶20在许多恶性肿瘤B-细胞上得到表 达。单克隆抗体指引CD20与其结合的表位非常不同并且已经报道了多种生物应答。此外， 存在许多关于识别CD20的单克隆抗体的报道。其中，利妥西单抗(rituximab)是一种嵌合 的小鼠/人单克隆抗体(C2B8)，其源自通过SB细胞株的免疫获得的小鼠抗体2B8，SB细胞 株是一种人B-细胞(参见专利文献1和2)。利妥西单抗实际上已经以名称Rituxan 用 作治疗低恶性的非霍奇金淋巴瘤(NHL)的治疗剂。从此以后，进一步报道了 Rituxan能有 效对抗许多与B-细胞相关的免疫疾病，例如，恶性肿瘤，如慢性淋巴细胞性白血病(CCL)， 涉及致病性自体抗体的自体免疫疾病，如自体免疫溶血性贫血和原发性血小板减少性紫癜 (ITP)，以及炎性疾病，如类风湿性关节炎(RA)和多发性硬化(参见非专利文献1至4)。已经报道了利妥西单抗结合人补体，导致淋巴细胞世系的B-细胞受到补体依赖 性细胞毒性(CDC)的裂解(参见非专利文献5)，并且利妥西单抗在用于抗体依赖性细胞介 导的细胞毒性(ADCC)的测试中呈现出活性，在氚化胸腺嘧啶结合测试中呈现出生长抑制 活性和细胞凋亡诱导(参见非专利文献6)。具有来自不同动物物种的分子的嵌合分子是抗原性的，并因此通常作为治疗剂是 不理想的，尽管认为是抗-CD20抗体，包括利妥西单抗，不是抗原性的，因为它们靶向并消 除所有类型的B-细胞，包括正常细胞。然而，已经报道了在治疗过程中存在利妥西单抗诱 导中和抗体的情况，尽管只有几个百分比，并且根据其剂量和持续时间，诱导中和抗体的可 能性可以进一步提高。此外，在将待治疗的目标从B-细胞淋巴瘤延伸至RA、IT和MS的过 程中，对抗原性相关的问题存在着提高的关注。出于这些原因，近来对人抗体或含有与人序 列更相似的序列的人源化抗体存在着需求。嵌合抗体产生了它们在血液中具有相对短的半衰期的问题。嵌合小鼠/人抗体 (包括利妥西单抗)的0半衰期(0 1/2)不超过3至4天。已经报道了利妥西单抗在临 床试验中对抗低恶性NHL的功效低于50% (参见非专利文件7)。此外，存在着在NHL治疗 中待给药的利妥西单抗的含量增加的问题，因为利妥西单抗对于CD20抗原的解离常数(Kd 值)为5. 2nM并且结合亲和性不是非常高(参见非专利文件8)。[专利文献1]国际公开No. W094/11026小册子[专利文献2]美国专利No.5，736，137说明书和权利要求书[非专利文献 1] :Coiffier B 等，Blood 1998 ；92 1297-32[非专利文献 2] Edward JC 等，Rheumatology (Oxford) 2001 ；40 :205_11[非专利文献 3] :Zaja F 等，Heamatologica 2002 ；87 189-95[非专利文献 4] :Perrotta S 等，Br J Haematol 2002 ；116 465-7
[非专利文献 5] :Reff 等，Blood 1994 ；83 :435_445[非专利文献 6] :Maloney 等，Blood 1996 ；88 :637a[非专利文献7] :IDEC Pharmaceuticals Corporation News Release ;1998年 12 月8号[非专利文献 8] :Mitchell ER 等，Blood 1994 ；82 :435_445发明公开本发明待解决的问题鉴于上述问题，本发明的主要目的是提供呈现出更适于药物用途的生物活性的 抗-CD20单克隆抗体。解决问题的手段为了实现以上目的，本发明人已经进行了认真的研究来制备对天然状态的人CD20 分子呈现出高结合亲和性的单克隆抗体，由此获得具有卓越特征的抗-CD20单克隆抗体。因 此，本发明人已经发现了可以通过使用SB或Raji细胞作为免疫原来获得呈现出卓越生物活 性的高亲和性单克隆抗体，其中认为SB或Raji细胞是含有高密度CD20抗原的B-细胞株，结 合使用遗传重组修饰以在细胞膜上表达大量CD20的非人动物细胞，由此实现本发明。换句话说，本发明提供了下列各项(1)人源化抗-⑶20单克隆抗体，其含有SEQ ID No 27至30任一中所示L_链和 SEQ ID No 31至34任一中所示H-链的组合；(2)根据以上所述(1)的人源化抗-⑶20单克隆抗体，其含有SEQID No 30中所 示L-链和SEQ ID No 34中所示H-链的组合；(3)根据以上所述(1)的人源化抗-⑶20单克隆抗体，其含有SEQID No 30中所 示L-链和SEQ ID No 31中所示H-链的组合；(4)根据以上所述(1)的人源化抗-⑶20单克隆抗体，其含有SEQID No 29中所 示L-链和SEQ ID No 33中所示H-链的组合；(5)根据以上所述(1)的人源化抗-CD20单克隆抗体，其是通过选自使用日本产 业技术综合研究所的国际专利生物保藏，依据保藏号FERM ABP-10907、FERM ABP-10906和 FERM ABP-10905进行保藏的细胞产生的；(6)生产人源化抗-⑶20单克隆抗体的方法，其包括培养选自使用日本产业技术 综合研究所的国际专利生物保藏，依据保藏号FERMABP-10907、FERM ABP-10906和FERM ABP-10905进行保藏的细胞；(7)用于治疗B-细胞介导的疾病的治疗剂，其含有根据上述⑴至(6)任一项的 人源化抗-CD20单克隆抗体作为活性成分。发明效果本发明提供了单克隆抗体，特别地，人源化单克隆抗体，及其生产方法，其对CD20 抗原的胞外表位呈现出高结合亲和性并具有生物活性，如细胞生长的抑制活性，并且其适 于作为药物使用。本发明还提供了用于治疗涉及B-细胞的疾病的治疗剂，其含有该单克隆 抗体。附图简述

图1是显示用于表达重组抗体的载体pN0W-Ab结构的限制图谱(restrictionmap) 0图2是显示用于表达蛋白的载体pNOW结构的限制图谱。图3a是显示细胞凋亡测试结果的图。图3b是显示细胞凋亡测试结果的图。图3c是显示细胞凋亡测试结果的图。图3d是显示细胞凋亡测试结果的图。图4a是显示抗体浓度和ADCC之间的关系的图(使用RAJI细胞)。图4b是显示抗体浓度和ADCC之间的关系的图(使用WIL2细胞)。图4c是显示抗体浓度和ADCC之间的关系的图(使用SU-DHL4细胞)。图4d是显示抗体浓度和ADCC之间的关系的图(使用RC-K8细胞)。图5a是显示E T比例和ADCC之间的关系的图(使用RAJI细胞)。图5b是显示E T比例和ADCC之间的关系的图(使用WIL2细胞)。图5c是显示E T比例和ADCC之间的关系的图(使用SU-DHL4细胞)。图5d是显示E T比例和ADCC之间的关系的图(使用RC-K8细胞)。图6a是显示⑶C测试结果的图(使用RAJI细胞)。图6b是显示⑶C测试结果的图(使用WIL2细胞)。图6c是显示⑶C测试结果的图(使用SU-DHL4细胞)。图6d是显示⑶C测试结果的图(使用RC-K8细胞)。图7a是显示使用小鼠抗体的细胞凋亡实验的结果的图。图右侧的数字表示抗体 的浓度(Pg/ml)，并且+和-各自表示存在和不存在与山羊抗体的交联(这些表示适用于 图7a至图7d)。所用的细胞是RAJI细胞。图7b是显示使用小鼠抗体的细胞凋亡实验的结果的图。所用的细胞是WIL2细胞。图7c是显示使用小鼠抗体的细胞凋亡实验的结果的图。所用的细胞是SU-DHL4 细胞。图7b是显示使用小鼠抗体的细胞凋亡实验的结果的图。所用的细胞是RC-K8细 胞。图8a是显示使用人源化抗体的细胞凋亡实验的结果的图。图右侧的数字表示抗 体的浓度(Pg/ml)，并且+和-各自表示存在和不存在与山羊抗体的交联(这些表示适用 于图8a至图8d)。所用的细胞是RAJI细胞。图8b是显示使用人源化抗体的细胞凋亡实验的结果的图。所用的细胞是WIL2细 胞。图8c是显示使用人源化抗体的细胞凋亡实验的结果的图。所用的细胞是SU-DHL4 细胞。图8d是显示使用人源化抗体的细胞凋亡实验的结果的图。所用的细胞是RC-K8 细胞。图9a是显示使用人源化抗体的早期细胞凋亡比例的图。将未加入抗体情况中的 值设定为1。图右侧的数字表示抗体的浓度(Pg/ml)，并且+和-各自表示存在和不存在 与山羊抗体的交联(这些表示适用于图9a至图9d)。所用的细胞是RAJI细胞。图9b是显示使用人源化抗体的早期细胞凋亡比例的图。所用的细胞是WIL2细胞。
图9c是显示使用人源化抗体的早期细胞凋亡比例的图。所用的细胞是SU-DHL4 细胞。图9d是显示使用人源化抗体的早期细胞凋亡比例的图。所用的细胞是RC-K8细 胞。
图IOa是显示人源化抗体和嵌合抗体的⑶C活性的图。所用的细胞是Raji细胞。图IOb是显示人源化抗体和嵌合抗体的⑶C活性的图。所用的细胞是SU-DHL4细 胞。图IOc是显示人源化抗体和嵌合抗体的⑶C活性的图。所用的细胞是WiL2细胞。图IOd是显示人源化抗体和嵌合抗体的⑶C活性的图。所用的细胞是RC-K8细胞。图Ila是显示人源化抗体浓度和ADCC之间的关系的图。所用的细胞是RAJI细胞。图lib是显示人源化抗体浓度和ADCC之间的关系的图。所用的细胞是SU-DHL4 细胞。图Ilc是显示人源化抗体浓度和ADCC之间的关系的图。所用的细胞是WiL2细胞。图Ild是显示人源化抗体浓度和ADCC之间的关系的图。所用的细胞是RC-K8细 胞。图12a是显示使用人源化抗体的细胞凋亡实验的结果的图。(XL)表示存在与二抗 (山羊抗人抗体)的交联。所用的细胞是RC-K8细胞。图12b是显示使用人源化抗体的细胞凋亡实验的结果的图。(XL)表示存在与二抗 (山羊抗人抗体)的交联。所用的细胞是SU-DHL4细胞。图12c是显示使用人源化抗体的细胞凋亡实验的结果的图。(XL)表示与存在二抗 (山羊抗人抗体)的交联。所用的细胞是RAJI细胞。图12d是显示使用人源化抗体的细胞凋亡实验的结果的图。(XL)表示与存在二抗 (山羊抗人抗体)的交联。所用的细胞是WIL2NS细胞。图13a是显示使用人源化抗体的细胞凋亡实验的结果的图。(XL)表示与存在二抗 (山羊抗人抗体)的交联。所用的细胞是RC-K8细胞。将未加入抗体诱导的细胞凋亡活性 设定为1。图13b是显示使用人源化抗体的细胞凋亡实验的结果的图。(XL)表示与存在二抗 (山羊抗人抗体)的交联。所用的细胞是SU-DHL4细胞。将未加入抗体诱导的细胞凋亡活 性设定为1。图13c是显示使用人源化抗体的细胞凋亡实验的结果的图。(XL)表示与存在二 抗(山羊抗人抗体)的交联。所用的细胞是RAJI细胞。将未加入抗体诱导的细胞凋亡活 性设定为1。图13d是显示使用人源化抗体的细胞凋亡实验的结果的图。(XL)表示与存在二 抗(山羊抗人抗体)的交联。所用的细胞是WIL2NS细胞。将未加入抗体诱导的细胞凋亡 活性设定为1。图14a是显示人源化抗体的⑶C活性的图。所用的细胞是RC_K8细胞。图14b是显示人源化抗体的⑶C活性的图。所用的细胞是SU-DHL4细胞。图15a是显示人源化抗体的ADCC活性的图。所用的细胞是RC-K8细胞。图15b是显示人源化抗体的ADCC活性的图。所用的细胞是SU-DHL4细胞。
缩写说明Pcmv 巨细胞病毒启动子PAbgh 牛生长激素基因的poly A添加信号Psvd 增强子缺失型猿猴病毒40启动子DHFR 小鼠二氢叶酸还原酶的cDNAPAsv 来自猿猴病毒40的poly A添加信号PBR322ori 大肠杆菌复制起点Ampr 大肠杆菌选择标记(氨苄青霉素抗性)Neor 哺乳动物细胞选择标记(G418抗性)INrbg 兔β球蛋白内含子SPl 抗体轻链信号肽VL 抗体轻链可变区的cDNACk 抗体κ轻链恒定区的cDNASPh 抗体轻链信号肽Vh 抗体轻链可变区的cDNAC γ 1 抗体γ 1重链恒定区的cDNA实施本发明的最佳方式在本说明书和权利要求书中，“抗体”不仅包括完整的抗体，而且还包括对其抗原表现出与完整抗体相当的结合亲和性的片段，如含有原始完整抗体可变区的片段(例如， Fab、F(ab，)2等)。根据本发明的单克隆抗体是对人CD20抗原表现出高亲和性并具有优良生物活性 的单克隆抗体，包括小鼠源单克隆抗体，及其嵌合变体和人源化变体。根据本发明的第一个优选实施方案，提供了具有对抗表达人CD20抗原的细胞的 生长抑制活性和对人CD20抗原高亲和性的单克隆抗体，对Raji细胞(漂浮细胞)的解离常 数(Kd值)不超过产生利妥西单抗的小鼠抗体2B8的Kd值的一半，优选具有1.7至3. 39nM 的Kd值。对于测量解离常数(Kd值)的方法没有特别限制，只要这些方法可以测量关于漂 浮细胞的Kd值即可。然而，在本说明书和权利要求书中，通过下文实施例中所述方法来获 得解离常数。优选本发明的抗体对抗表达人⑶20抗原的细胞的生长抑制活性高于2B8的。生 长抑制活性优选为在缺乏外周血单核细胞时，对于表达人CD20抗原的细胞的体外培养物 的生长抑制活性，更优选，生长抑制活性是由于细胞凋亡诱导引起的。例如，可以使用在Miyamoto Τ, Min W, Lillehoj HS. Avian Dis. 2002 年 1 月-3 月；46(1) :10-6中所述的方法来进行上述的生长抑制活性的测量。根据本发明第一个实施方案的单克隆抗体的特定实例包括小鼠源单克隆抗体，其 中L链可变区的氨基酸序列和H链可变区的氨基酸序列分别列于SEQ ID No:l和9、SEQ ID No 2和10、或SEQ ID No 3和11中，并包括该抗体的嵌合变体或人源化变体。例如，根据Ishida T, Imai K, Nippon Rinsho Vo. 160，No. 3，2002-3 :439_444 中 所述的已知方法，通过将来自小鼠源单克隆抗体可变区的氨基酸序列与来自人免疫球蛋白恒定区的氨基酸序列融合来进行嵌合。
例如，可以根据Ishida T, Imai K, Nippon Rinsho V0I6O, No3，2002-3 :439_444 ； Eduardo A. Padlan, Molecular Immunology, Vol.28-4/5, pp. 489-498,1991 ；Eduardo A.Padlan 等，The FASEB Journal, vol. 9, pl33_139 ；禾口 Tai te Wu, Elvin A. Kabat, Molecular Immunology, Vol. 29-9, ppll41_146，1992中所述的已知方法，通过使用小鼠源 单克隆抗体可变区的CDR氨基酸序列和人免疫球蛋白的氨基酸序列来进行人源化。当进行嵌合或人源化时，可以将来自复数种小鼠单克隆抗体的L链可变区的氨基 酸序列以任意组合与来自H链可变区的氨基酸序列组合。实例包括，例如，结合了具有来自 SEQ ID No :1至3中任一中所示的小鼠源单克隆抗体可变区氨基酸序列的嵌合氨基酸序列 的L链和具有来自SEQ ID No :9至11所示的小鼠源单克隆抗体可变区氨基酸序列的嵌合 氨基酸序列的H链的嵌合抗⑶20单克隆抗体；和结合了具有来自SEQ ID No :1至3任一中 所示的小鼠源单克隆抗体可变区氨基酸序列的人源化氨基酸序列的L链和具有来自SEQ ID No 9至11所示的小鼠源单克隆抗体可变区氨基酸序列的人源化氨基酸序列的H链的人源 化抗⑶20单克隆抗体。根据本发明第二个优选实施方案的抗体是对Raji细胞(其是漂浮细胞)的解离 常数(Kd值)不超过2B8 Kd值的1/8的小鼠源嵌合或人源化单克隆抗体。众所周知，当对人CD20抗原具有高亲和性并且特别是含有人IgGl或IgG3序列或 从其修饰的人Fc序列(包括小鼠源单克隆抗体的嵌合或人源化形式)的抗体结合细胞表 面上的⑶20时，它们通过NK细胞上的Fc γ RIII (⑶16)诱导了效应细胞的激活，导致抗体 依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。众所周知，对人源化CD20抗原具有高亲和性并且特别 是含有人IgG或IgGM序列或人Fc序列的修饰形式(包括小鼠源单克隆抗体的嵌合或人源 化形式)的抗体结合细胞表面上的CD20时，它们诱导了补体的激活，导致补体依赖性细胞 毒性(CDC)。因此，可以预期根据本发明第二个实施方案的抗体具有低或不可检测的生长抑制 活性并呈现出ADCC或CDC。根据本发明第二个实施方案的抗体的特定实例为其中L链可变区的氨基酸序列 和H链可变区的氨基酸序列分别列于SEQ ID No 4和12、SEQ ID No 5和13、SEQ ID No 6 和 14、SEQ ID No :7 和 15、或 SEQ ID No :8 和 16 中的抗体。可以通过与根据第一个实施方案的抗体中相似的方法来进行嵌合或人源化。可 以将来自复数种小鼠单克隆抗体的L链可变区的氨基酸序列以任意组合与来自H链可变 区的氨基酸序列组合。实例包括，例如，结合了来自SEQ ID No :4至8任一中所示的小鼠 源单克隆抗体可变区氨基酸序列的嵌合氨基酸序列的L链和具有来自SEQ ID No:12至 16所示的小鼠源单克隆抗体可变区氨基酸序列的嵌合氨基酸序列的H链的嵌合抗CD20 单克隆抗体；和结合了具有来自SEQ ID No :4至8任一中所示的小鼠源单克隆抗体可变 区氨基酸序列的CDR氨基酸序列的L链和具有来自SEQ ID No 12至16任一中所示的小 鼠源单克隆抗体CDR氨基酸序列的人源化氨基酸序列的H链的人源化抗CD20单克隆抗 体。根据本发明优选的第三个实施方案的抗体属于一组人源化单克隆抗体，其不受 2B8的特定解离常数(Kd值)的限制，包括能有效对抗利妥西单抗对其无效的细胞的人源化单克隆抗体。 这样抗体的实例包括如下组合L-链和H-链的人源化抗⑶20单克隆抗体SEQ ID No 18中所示的L链和SEQ ID No 24中所示的H链；SEQ ID No 18中所示的L链和SEQ ID No 22中所示的H链；SEQ ID No 19中所示的L链和SEQ ID No 22中所示的H链；禾口 SEQ ID No 19中所示的L链和SEQ ID No 23中所示的H链。例如，通过使用以下所述方法的筛选获得杂交瘤克隆，通过从该杂交瘤克隆中选 择能产生具有所需特性的单克隆抗体的克隆，可以制备根据本发明的小鼠源单克隆抗体或 可以用于制备根据本发明的抗体的小鼠源单克隆抗体。例如，作为致敏原(免疫原)，使用了是CD20表达细胞的SB细胞或Raji细胞，和 已经通过重组技术使用例如可购得的CD20 DNA (或其具有相同作用的片段)转化的CHO细 胞(CH0/CD20)，使得在细胞表面上表达CD20。给药了首次免疫、加强免疫和最后免疫，使得 使用递呈致敏原并来源于与待免疫动物属于不同目的动物的细胞株进行至少一次首次免 疫和加强免疫，或使用通过遗传重组在细胞膜表面上递呈致敏原并来源于与待免疫动物属 于相同目的动物的细胞株进行至少一次首次免疫和加强免疫，并且使用其他细胞株进行最 后免疫。其它条件可以与用于制备产生常规单克隆抗体的杂交瘤的方法中的条件相似。根 据已知的方法通过(1)免疫待免疫的动物；(2)从已免疫的动物制备淋巴细胞；(3)制备亲 本细胞；(4)淋巴细胞和亲本细胞的细胞融合；和(5)筛选并克隆来制备生产单克隆抗体的 杂交瘤(参见，例如，Monokuronaru kotai, Seikagaku Jikkenho [Monoclonal Antibody, Biochemical Experiment Method], Ailsa Μ. Campbell 'ΦΜ, ToshiakiOSAffA Hif Tokyo Kagaku Dojin (1989))。使用克隆的杂交瘤制备单克隆抗体的方法可以与用于制备单克隆抗体的常规方 法相似，除了使用用根据本发明产生杂交瘤的方法制备的杂交瘤外。例如，可以使用通过细 胞培养或作为小鼠腹水产生抗体的方法来实现大规模生产。通过制备编码嵌合或人源化抗 体的基因，将该基因插入表达载体并在合适的细胞中表达该表达载体来进行嵌合或人源化 抗体的生产。例如，可以使用用于人免疫球蛋白L链恒定区和H链(κ )恒定区的基因并插入用 于CHO细胞的高表达载体中来嵌合L链可变区和H链可变区的基因。尽管可以使用可购得 的用于生产重组抗体的载体系统，但也可以使用在pNOW-ab中构建的载体，其是二聚体高 表达载体，含有用于L链和H链的多克隆位点(MCS)，其是基于pNOW，是用于哺乳动物细胞 的高表达载体(日本专利3，582，965号公报)。显示这些载体结构的限制图谱示于图1和 图2中。用含有嵌合抗体基因的表达载体来转染CHO细胞，然后选择高生产性的克隆。使 用常规方法从这些克隆中生产抗体。根据本发明第一个实施方案的抗体表现出与利妥西单抗相比相对高的结合亲和 性和优选由于细胞凋亡诱导引起的高生长抑制活性，并因此这些抗体的嵌合或人源化抗体 可以用作用于B-细胞的恶性肿瘤和涉及B细胞的疾病的治疗剂的活性成分。此外，认为根 据本发明的第二个和第三个实施方案的抗体呈现出对抗表达人CD20抗原的细胞的补体依 赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，并因此可以用作用于B-细 胞的恶性肿瘤和涉及B-细胞的免疫疾病的治疗剂的活性成分。因此，本发明还提供了用于涉及B细胞的疾病的治疗剂，该治疗剂含有作为活性成分的本发明嵌合或人源化抗体。 此外，在根据本发明的抗体中，是不需要在细胞凋亡的诱导中需要与二抗交联的 抗体的抗体，并且这些抗体适于药物使用，因为抗体自身能够诱导细胞凋亡，而不需要任何二抗。此外，在本发明中，可以结合两种或更多种类型的根据本发明的抗体。涉及B-细胞的疾病包括，但不限于，例如，非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血 病、急性淋巴细胞白血病、类风湿性关节炎、自体免疫溶血性贫血、原发性血小板减少性紫 癜、全身性红斑狼疮、抗磷脂抗体综合征、干皮性骨化症、克罗恩病、真皮炎和多发性硬化寸。可以通过已知的用于药物制备的技术来生产治疗剂。对其他配制成分没有特别限 制。剂量等可以参考关于已知的Rituxan来确定。在进一步的实施方案中，本发明提供了结合了 SEQ ID NO :27至30任一中所示的 L-链和SEQ ID NO 31至34任一中所示的H-链的人源化抗-⑶20单克隆抗体(在此称为 抗体1782，系列1782的抗体等)。在这些抗体中，作为优选抗体举例说明的是其中结合了 SEQ ID NO :30中所示的L-链和SEQ ID NO :34中所示的H-链的人源化抗-CD20单克隆抗 体(克隆ff)；结合了 SEQ ID NO 30中所示的L-链和SEQ ID NO 31中所示的H-链的人 源化抗-⑶20单克隆抗体(克隆fv)；和SEQ ID NO 29中所示的L-链和SEQ ID NO :33中 所示的H-链的人源化抗-CD20单克隆抗体(克隆ss)。这些人源化抗体，其也源自小鼠，可 以如上所述人源化。系列1782的人源化抗体对于自身诱导的细胞凋亡具有弱的活性，但是在交联条 件下，呈现出等于或高于Rituxan (C2B8)的细胞凋亡诱导活性。人源化抗体1782呈现出不 仅对抗RAJI、WIL2NS和SU-DHL4细胞而且还对抗RC-K8细胞(其是Rituxan-抗性株)的 ⑶C活性。特别地，如实施例中详述的，系列1782的克隆ff和fv具有高⑶C活性并呈现出 明显高于Rituxan的抗SU-DHL4细胞的⑶C活性。将Kd值和CDC活性的结果放在一起，系 列1782的克隆ff是优选的，因为其具有最高的亲和性，相对高的CDC活性以及对抗RC-K8 株(Rituxan抗性株)的⑶C活性。系列1782的克隆fv也是优选的，因为其具有最高的⑶C 活性，此外，对RC-K8株(Rituxan抗性株)也是有效的。特别地，因为系列1782的克隆 具有非常高的亲和性，可以将其RI标记，以将其用于涉及B-细胞疾病的靶向治疗。此外， 系列1782的克隆fv是优选的，因为其具有对抗SU-DHL4细胞的高CDC活性，克隆ss是优 选的，因为其具有对抗RC-K8的高ADCC活性。根据本发明的人源化抗-⑶20单克隆抗体的1782系列还可以用作用于治疗B-细 胞的恶性肿瘤和涉及B-细胞的免疫疾病的治疗剂的活性成分。因此，在进一步的实施方案 中，本发明提供了用于治疗B-细胞的恶性肿瘤和涉及B-细胞的免疫疾病的治疗剂，其中治 疗剂含有系列1782的抗体作为活性成分。治疗剂给药的方法和含量可以由本领域技术人 员容易地确定。上述疾病举例说明了作为涉及B-细胞的疾病。下文中将参照实施例更详细地描述本发明。然而，本发明并不限于这些实施例。实施例1(1)制备用于敏化小小鼠的免疫剂体外培养SB细胞和Raji细胞，其是表达⑶20的B-细胞株。
分别使用特特异的弓丨物 hCD20-S-GK-Not :aatgcggccgccaccatgacaacacccaga aattc(SEQ ID No 25)禾口 hCD20_E_Xba :gctctagattaaggagagctgtcattttc(SEQ ID No: 26)克隆编码完整 CD20 分子的 DNA(Multiple Choice cDNA human spleen, Origene Technologies, Inc. ,6 Taft Court, SuitelOO, Rockville,MD20850) 将该 DNA 插入用于哺 乳动物细胞的高表达载体PNOW中(图1)，并将构建的载体用于转化CHO细胞。使用FACS 分析鉴定在细胞表面上表现出高水平⑶20表达的重组CHO细胞(⑶20/CH0细胞)。使用 FITC-标记的抗-CD20单克隆抗体进行染色，并且当细胞获得SB细胞5倍或更高倍数的荧 光强度时，将该细胞选择作为高表达细胞。(2)制备免疫原 用补充10% FCS的RPMI 1640培养基培养SB或Raji细胞。用补充800 μ g/ml G418的CHO-S-SFM II培养基(Gibco,目录号12052-098)培养CD20/CH0细胞。将这些培 养过的培养基在1，IOOrpm下离心5分钟，将细胞悬浮于Dulbecco’ s PBS (-)中并再次离 心。将该洗涤步骤再重复一次，并将生理盐水溶液加入细胞中，以制得用于免疫的悬浮液 (细胞数1-3χ107 个/ml)。(3)免疫将这些免疫原制剂通过腹膜内给药7至11周龄的雌性Balb/c小小鼠。以不同的 天数间隔重复给药2-3次SB或⑶20/CH0细胞后，使用不同类型的细胞(⑶20/CH0或Raji 细胞)进行最后免疫。对于每一次这些免疫，所给药的细胞数目为1-3χ107个细胞/小小 鼠°所使用的免疫原组合显示于表1中。(4)细胞融合在最终免疫后3天，从2只小小鼠制备脾细胞，并根据0i，V. Τ.和 L. A. Herzenberg, 1980,见Selected Methods in Cellular Immunology, B. Mishell 禾口 S. Μ. Shiigi 编辑(Freeman and Co. San Francisco, CA)，p. 351 中所述的方法在 PEG-1500 存在下与小鼠骨髓瘤细胞(NS-I)融合。(5)初筛和二筛用其上附有⑶20/CH0或CHO细胞(亲本株)的96孔平板进行细胞ELISA，以选择 其中产生了抗体与CD20特异性反应的孔。用其上附有相同的CD20/CH0细胞的96孔平板 接受使用利妥西单抗(C2B8)的竞争反应，以选择与C2B8的相似表位反应的抗体(孔)。这些筛选的结果显示于表1中。(6)细胞 ELISA将附于聚-L-赖氨酸覆盖的96孔平板(AsahiTechoglass Corporation,目录号 1-023-018)上的⑶20/CH0或CHO细胞(亲本株)用于细胞ELISA。将150 μ 1封闭缓冲液 (含有0. 2%明胶、0. 5% BSA的PBS溶液)导入各孔中，并使板在37°C下静置1小时。使 用150nM NaCl,0. 05%吐温20的水溶液将平板洗涤5次，然后将100 μ 1样品(培养物上清 液的稀释液)导入各孔中。在37°C下进行1小时的初次反应。洗涤后将100μ1标记抗体 (HRP标记的抗小鼠IgG (H+L)兔抗体(Jackson Lab.，编号315-035-003)或HRP标记的抗小 鼠IgG(Fcy)兔抗体(Jackson Lab，编号315-035-008))的稀溶液导入各孔中，并在37°C 下进行1小时的二次反应。在制备用于初次反应和二次反应的反应溶液中使用同样的封闭溶液。洗涤后将100 μ 1显色液(OPD)导入各孔中，并在30分钟后加入50 μ 1 4Ν H2SO4以 终止反应。测量492nm处的吸光率。(7)细胞ELISA中的竞争反应制备样品(培养物上清液的稀释液)和嵌合抗体(10-40ng/ml)的混合溶液。在如上所述在细胞ELISA中进行封闭反应后，将100 μ 1每种混合溶液导入各 孔中，并在37°C进行1小时的初次反应。洗涤后，将100 μ 1标记抗体(HRP标记的抗人 IgG (H+L)兔抗体(Jackson Lab.，编号309-035-082))的稀释液导入各孔中，并在37°C下进 行1小时的二次反应。洗涤后，将ΙΟΟμΙ显色液(OPD)导入各孔中，并在30分钟后，加入 50 μ 1 4Ν H2SO4以终止反应。测量492nm处的吸光率。由于标记的抗体只与嵌合抗体反应，因此初次反应中加入样品中的抗体与嵌合抗 体之间的任何竞争导致了测量值的降低。(8)克隆使用了有限稀释法。将培养细胞接种于96孔板后，对含有单个克隆的孔的培养物 上清液进行细胞ELISA，由此选择产生特异性抗体的克隆。(9)制备纯化的抗体在补充10% FCS的RPMI 1640培养基中培养产生特异性抗体的克隆。当细胞密度达到大约5xl05个细胞/ml时，用无血清培养基ASF-104N(Ajinomoto)替换该培养基。2至 4天后，将培养过的培养基离心，以收集培养物上清液。将蛋白G柱用于纯化抗体。用150mM NaCl透析单克隆抗体洗脱液。通过0. 2 μ m滤器将透析的溶液过滤除菌，以获得待测试的抗 体样品(抗-人CD20小鼠单克隆抗体)。表1 选定孔的数目-A 其中产生抗体与CD20/CH0细胞反应但不与CHO细胞反应的孔选定孔的数目-B 在A中选定的孔中，其中产生抗体经历与参照抗体(C2B8)的竞 争反应的孔由8个代表性克隆产生的单克隆抗体的L-链V-区的氨基酸序列(SEQ ID No 1-8)和H-链V-区的氨基酸序列(SEQ ID No 9-16)如下所示。1K0924 的 H-链 V-区的序列(SEQ ID No 11) QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTF TSYNIHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTSDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARMSTMITGF DYffGQGTTLTVSS1K1228 的 H-链 V-区的序列(SEQ ID No 16) QVQLQQPGAELVKPGASVKVSCKASGFTF TSYNLHWVKQTPGQGLVWIGAIYPGNGDTSYNQKFRGKATLTADISSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYYGYDAM DYffGQGTSVTVSS1K1422 的 H-链 V-区的序列(SEQ ID No 9) QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCRASGYTFT NYNMHWIKQTPGQGLEWIGAIYPGSGDTSYNRKFKGKATLTADTSSSTAYMQFSSLTSADSAVYYCARFTYYYGGTY GAMDYffGQGTSVTVSL1K1791 的 H-链 V-区的序列(SEQ ID No 10) QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTF TNFGVNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPSYADDFKGRFAFSLEASANTAYLQINNLKNDDMSTYFCTRRTNYYGTS YYYAMDYffGQGTSVTVSS1K1712 的 H-链 V-区的序列(SEQ ID No 12) QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGFTF TSYNLHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGSGDTSYNQQFKGKATLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYCCARSAMISTGN WYFDYffGQGTTLTVSS1K1402 的 H-链 V-区的序列(SEQ ID No 13) QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGFTFTSY匪HWVKQTPGQGLEWIGGIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARFYYYGSMG AMDYffGQGTSVTVSS1K1736 的 H-链 V-区的序列(SEQ ID No 14) QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTF TTYNLHWVKQTPGQGLEWIGGIYPGNGDTSYNQKFKVKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARffIYYGNYE GTLDYffGQGTSVTVSS1K1782 的 H-链 V-区的序列(SEQ ID No 15) QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTF TSYWMHWVKQRPGQGLEWIGYITPSTGYTDYNKKFKDKATLTADRSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCARSGPYFDVW GAGTTVTVSS1K0924 的 H-链 V-区的序列(SEQ ID No 3) :QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVS YMHWYQQRPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYYFTISRVEAEDAATYYCQQWNSNPPTHGGGTKLEIK1K1228 的 H-链 V-区的序列(SEQ ID No 8) :EIILTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSYY LRWYQQKPGFSPKVLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGNTVPLTFGSGTKLEIK1K1422 的 L-链 V-区的序列(SEQ ID No 1) QIVLTQSPPIMSASLGEEITLTCSASSRVS YMLWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWTSNPCTFGGGTKLEIK1K1791 的 L-链 V-区的序列(SEQ ID No 2) :STVMTQTPKFLLVSA⑶RVTITCKASQSVS NDVAWYQQKPGQSPKVLIYFASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTINTVQAEDLAVYFCQQDYSSPLTFGAGTKLELK1K1712 的 L-链 V-区的序列(SEQ ID No 4) :QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVS YMDWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDTATYYCQQWTFNPPTFGSGTKLEIK1K1402 的 L-链 V-区的序列(SEQ ID No 5) :QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVS YMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTITRVEAEDAATYYCQQWTFNPPTFGAGTKLELK1K1736 的 L-链 V-区的序列(SEQ ID No 6) :QIVLSQSPAILSSSPGEKVTMTCRASSSVS YMLWYQQKPGSSPEPWIYATSNLASGVPARFSGGGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTFNPPTFGGGTKLEIK1K1782 的 L-链 V-区的序列(SEQ ID No 7) DILLTQSPAILFVSPGERVSLSCRASQNIG TSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESFSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNSWPFTFGSGTKLEIK实施例2对于一些所得到的克隆，测定了它们的单克隆抗体基因可变区的碱基序列。此外， 如下所述，测量了抗体结合亲和性并对由它们产生的单克隆进行了生物特性测试。(1)结合亲和性的测量使用了源自在细胞表面表达目标抗原的人B细胞的漂浮Raji细胞和源自不表 达⑶20抗原的人T细胞的漂浮Jurkat细胞。将两种类型的细胞在CO2培养箱(SANYO MC0-175M)中于37°C和5% CO2浓度下，使用补充10%胎牛血清(FCS) (BIOLOGICAL IND,目 录号04-001-1A，批号815242 ；为了使补体组分失活在56°C预热30分钟)的RPM11640培 养基(NACALAI TESQUE Inc.，目录号30264-85，批号L4K2844)中培养。通过每周2次亚培 养来维持细胞。用Burker-Turk血球计(Erma Inc.，目录号03-303-1)来进行细胞数目的测量。将亚培养后3至4天的汇合细胞的培养过的培养基在室温下用多用途冷冻离心 机LX-120(T0MY Co.，Ltd.)在3000rpm下离心3分钟。除去上清液并收集细胞。选择在该 步骤中所用的转速和时间，使得重复离心分离并除去上清液后的细胞数目保持不变。为了 除去培养基和残留在细胞表面上的FCS (洗涤)，将收集的细胞悬浮于Dulbecco’ s磷酸缓冲盐水中(-)(无 Ca 和 Mg，PBS (-)，(NaCl =Wako,目录号 191-01665 ；Na2HPO4 =Wako,目录号 197-02865，批号 ASF2635 ；KCl =Wako,目录号 163-0334T，批号 CEQ7122 ；KH2PO4 =Wako,目录 号169-0425，批号ELG7616))，并在3000rpm下离心3分钟2次以除去上清液。洗涤后将细 胞悬浮于PBS中的BSA溶液中(Wako目录号013-07492，批号PKH3483)，并调节至5xl06 个细胞/ml的细胞密度。将作为一抗的待测试抗体或阳性对照抗体(2B8)的分别以15、30、50、75、100、 125、150、200ng(l. 5-5 μ 1)的量注入 1. 5ml 试管中(BMEquipment Co.，Ltd.，BM-环锁管， 目录号BM-15)。同时，准备四支未加抗体的试管。对每一种待测试的抗体制备三份样品。 向每份样品中加入100 μ 1 (5x10s个细胞)1 % BSA的PBS溶液(Wako,目录号013-07492，批 号ΡΚΗ3483)，并混合，并在室温下振荡反应1小时。
反应后，将反应液在室温下使用高速冷冻离心机ΜΧ-100 (TOMY)在3，OOOrpm下离 心3分钟。收集细胞后，将细胞悬浮于200 μ 1 PBS中并在3，OOOrpm下离心三分钟以除去 上清液。将这些程序重复两次以除去残留在细胞表面上的未反应的一抗。加入相对于结合细胞的一抗而言过量(500ng)的FITC-标记的抗小鼠IgG(H&L) 二抗[缀合荧光素的山羊抗小鼠IgG(H&L)，亲和性纯化的二抗，Chemicon,目录号AP124F， 批号24021014]，接着加入100 μ 11% BSA-PBS溶液(500ng/100 μ 1)。将该混合物在室温下 振荡1小时，同时避光，并检测结合细胞的一抗。反应后，将混合物在3，OOOrpm下离心3分 钟以收集细胞。为了除去残留在细胞表面上的任何未反应的FITC-标记的抗小鼠IgG(H&L) 抗体，将细胞悬浮于200 μ 1 PBS中并在3，OOOrpm下离心3分钟以除去上清液。将这些程 序重复两次。将由此收集的细胞悬浮于100 μ 1 PBS中，并转移至平底96孔平板中(Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.，ELISA PLATE,目录号 8496F)。使用 Typhoon 9210 图像分析仪 (Amersham Bioscience)在以下检测条件下测量二抗的荧光强度荧光模式600V，526SP/ 绿色(532nm)；焦距底面上 +3mm。使用 100 μ 1 加入了 0,12. 5、25、50、75、100、125、 150ngFITC-标记二抗的PBS来制备用于构建标准曲线的对照。检测后，使用图像分析软件Image Quant (AmershamBioscience)将图像数字化，并 使用ExceKMicrosoft)分析。通过测量只在细胞和FITC-标记的二抗之间的反应来测定 平板、PBS溶液和非特异性结合细胞的FITC-标记二抗的背景值，并从每个样品的荧光强度 值中减去四个点的平均值。通过这种方式，获得了来自结合细胞的FITC-标记二抗的荧光 量。通过测量各种浓度的用作对照的FITC-标记二抗的荧光量来构建标准曲线，并计算结 合细胞的二抗量(摩尔数或重量)。假定每种一抗和FITC-标记的二抗以1 2的比率反 应，计算结合细胞的一抗量。通过从加入量中减去结合量来确定悬浮液中游离一抗的量。将 抗体浓度转化成摩尔浓度时，单克隆抗体的分子量为150，000。观察到随着加入的一抗量增加，结合反应变得饱和，并且荧光强度达到了恒定值。 使用斯卡查德分析来计算细胞表面上的抗原数目和解离常数(Kd值)(请参阅Scatchard， G. ；Ann. N. Y. Acad.Sci.,51 660-672,1949, New Cultured Cell Experimental Methods inMolecular Biology Research (分子生物学研究中新培养细胞实验方法)，Yodosha Co., Ltd. , Jikken Igaku separate volume, Bio Manual UP Series 修订的第二版，p212 至 217)。数值为各样品三个值的平均。
8个代表性克隆产生的单克隆抗体和阳性对照抗体(2B8)的测量结果显示于以下 的表3中。(2)生物学特性测试(a)细胞凋亡诱导测试 使用流式细胞术(Armexin V/PI染色)测量测试抗体诱导细胞凋亡的能力。使用 了阳性对照(2B8)和阴性对照(抗CD3单克隆抗体(BDPharMingen))。使用MEBCYT0细胞 凋亡试剂盒(MBL，目录号4700，批号20)进行测试。将Raji细胞离心，并悬浮于补充10% (灭活)FBS(ICN，目录号2916754，批号 8005C)的新鲜RPMI 1640培养基中(Sigma,目录号R8758，批号44K2416)，并将Iml体积的 密度为5xl05个细胞/ml的溶液导入12孔平板的每个孔中。将12孔/抗体用于测试，并 将抗体接入代表性的孔中，以使得终浓度为2yg/ml或4yg/ml(3孔X2种浓度X2个时 间点，共12孔)。在培养开始后的第一天和第二天，收集含有约2xl05个细胞的培养过的培 养基，离心后用PBS洗涤细胞一次。然后，将细胞悬浮于85 μ 1结合缓冲液中。在与10 μ 1 Annexin V-FITC和5 μ 1 PI充分混合后，将混合物在室温下反应15分钟，同时避光。使 用流式细胞术进行测量(FACS Calibur, Becton Dickinson)，并使用CellQuest进行分析 (Becton Dickinson)。6个代表性克隆产生的单克隆抗体、阳性对照抗体(2B8)和阴性对照抗体(抗 CD3)的测量结果显示于以下的图3a至图3d中。尽管通常认为28B具有高的诱导细胞凋亡 的能力，但通过1K17系列(用⑶20/CH0和Raji细胞免疫)的细胞融合获得的克隆lkl791 产生的单克隆抗体和通过1K14系列(用SB细胞和⑶20/CH0细胞免疫)细胞融合获得的 克隆lkl422产生的单克隆抗体与2B8比较时表现出高的诱导细胞凋亡的能力。(b)细胞生长抑制测试在补充10% FCS的RPMI 1640中制备细胞浓度为5xl04个细胞/ml的Raji细 胞悬浮液，以100 μ 1/孔的体积加入96孔平板中并培养。24小时后，向每孔中加入体积 为50 μ 1/孔的抗体溶液，使抗体浓度为1 μ 1/ml，并继续培养。在加入抗体后72小时时， 以 10 μ 1/孔加入显色剂 Cell Counting Kit-8 (Donin Kagaku，目录号 343-07623，批号 SG076)，再继续培养4小时，然后在492nm处测量吸光率。来自如上所述的6个克隆的单克隆抗体、阳性对照抗体(2B8)和阴性对照的吸光 率测量结果显示于以下的表2中，其特性显示于表3中。细胞生长抑制测试表2 单克隆抗体的特性表3 (c)抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)在该系列的实验中，测量了通过抗-⑶20嵌合抗体的Fc区是否激活了效应细胞，
并由此裂解淋巴瘤细胞系的细胞。在补充10%灭活FCS的RPMI1640培养基中(培养基)，于37°C和5% CO2浓度下
培养和维持源自人B细胞的四种细胞Raji、WiL2-NS、SU-DHL4和RC-K8。
在这些实验中，用含有10% FCS的RPMI1640洗涤每种类型的细胞，并在37°C下与 钙黄绿素反应15分钟，由此使钙黄绿素结合活的细胞，然后将细胞数目调节至4xl05个细 胞/ml。因为钙黄绿素只保留在具有正常细胞膜的细胞中，因此可以将其用于只染色活细 胞。使用含有10% FCS的RPMI1640将作为抗⑶20嵌合抗体的利妥西单抗(C2B8)和6种 类型嵌合抗体(Ik0924、lkl402、lkl422、lkl712、lkl736 和 lkl791)调节至 20 μ g/ml、4 μ g/ ml和0. 8 μ g/ml。通过从健康对象采取血液并立即将血液铺在Ficoll上，接着离心来收集 淋巴细胞级分，从而获得效应细胞后，将效应细胞调节至5xl06个细胞/ml、IxlO6个细胞/ ml 和 0. 2xl06 个细胞/ml。在总的100 μ 1中，将25 μ 1调整了浓度的细胞悬浮液、25 μ 1各种抗⑶20嵌合抗 体溶液(各自的终浓度分别为5、1和0.2yg/ml)和50 μ 1用于各种抗体浓度的效应细胞 (各自的E T比率为25 1、5 1和1 1)在96孔平板中充分混合，并于37°C和5% CO2浓度下在培养箱中反应4小时。如下制备了三种样品其中用含有10% FCS的RPMI1640 取代抗体溶液和效应细胞的第一种样品，以计算细胞的自发溶解；其中用含有10% FCS的 RPMI1640取代抗体溶液的第二种样品，将其用于计算只有效应细胞的抗体依赖性活性；和 其中用20%曲通(Triton)X-IOO取代抗体溶液的第三种样品，将其用于计算最大溶解。在反应后，如果细胞已经被裂解了，那么细胞膜已经破裂并且钙黄绿素已经从细胞中释放出来。基于此，使用Quencher来淬灭释放至反应溶液中的钙黄绿素的荧光，然后 使用荧光分析仪来测量荧光量。检测后，使用图像分析软件(Amersham Bioscience)将图像数字化，并使用以下的 等式来计算每种样品的裂解率。等式1裂解率(％)=((自发裂解)_(样品))/((自发裂解)_(最大裂解))xl00图4a至图4d显示了效应细胞如NK细胞的数量和目标细胞的数量的比例(E T 比例)为25 1时，对于每种细胞类型的抗体浓度和细胞毒性活性之间的关系。图5a至 图5d显示了抗体浓度为5 μ g/ml时，对于每种细胞类型的E T比例和细胞毒性活性之间 的关系。如图4a至图4d所示，在E T比例为25 1的条件下，所有类型的细胞在加入 抗体时表现出细胞毒性活性。换言之，抗体参与细胞毒性。此外，除WiL2-NS以外的细胞株 在0. 2 μ g/ml的抗体浓度下(在0. 2 μ g/ml时出现饱和)表现出相当于1 μ g/ml和5 μ g/ ml的活性，并且活性达到最大值后就保持不变，表明在抗体量小于补体依赖性细胞毒性活 性所需的抗体量时提供了这些作用。如图5a至图5d中所示，认识到从抗体浓度为5 μ g/ml时E T比例对细胞毒性 活性的作用看，细胞毒性活性取决于E T比例浓度而增加。从这看，可以推断出细胞毒性 是由效应细胞的作用而引起的。(d)补体依赖性细胞毒性(⑶C)在该系列实验中，测量了在含补体血清的存在下，抗CD20嵌合抗体是否能够裂解 淋巴瘤细胞系的细胞。在补充10%灭活FCS的RPMI1640中(培养基)于37°C和5% CO2浓度下在培养 箱中培养和维持四种源自人B细胞的细胞Raji、WiL2-NS、SU-DHL4和RC-K8。
在这些实验中，在含有10% FCS的RPMI1640中洗涤每种类型的细胞，将细胞数目 调节至2-3xl06个细胞/ml。使用含有10% FCS的RPMI1640，将作为抗⑶20嵌合抗体的 C2B8(利妥西单抗))和6种类型的嵌合抗体(Ik0924、lkl402、lkl422、lkl712、lkl736和 lkl791)调节至 20、4 和 0. 8 μ g/ml 在总的100 μ 1中，使用漩涡混合器将55 μ 1具有调节浓度的细胞悬浮液、25 μ 1各 种抗CD20嵌合抗体溶液(终浓度分别为5yg/ml、lyg/ml、0.2yg/ml)和20 μ 1采自五个 健康对象的混合血清或其灭活血清充分混合，并于37°C和5% CO2浓度下在培养箱中反应2 小时。制备其中25 μ 1抗体溶液由补充10% FCS的RPMI1640替代的样品，作为用于背景计
算的样品。反应后，使用PI (碘化丙啶)将死细胞染色，并通过FACS (Becton Dickinson)进 行分析。作为数值，直接使用死细胞获得的群，从其中减去背景值和加入灭活血清的样品的值。图6a至图6d显示了每种细胞类型的抗体浓度和的细胞毒性活性之间的关系。如图6a至图6d中所示，所有6种类型的抗体都在Raji、WiL2_NS和SU-DHL4中 显示出活性。此外，可以证实浓度依赖性，并且在5 μ g/ml浓度下比较时，相对于其它抗体， lkl791显示出特别高的活性，接着为Ikl736、lkl422和lkl712显示出高活性。在该浓度 下，在Raji和Wil2-NS细胞中可以认识到lkl791诱导了接近由其他抗体诱导水平的约两 倍水平的细胞毒性，其它抗体也表现出等于或高于利妥西单抗的活性。另一方面，发现认为利妥西单抗对其没有效果的RC-K8细胞在各种抗体之间显示 出明显的差别。利妥西单抗、lkl402和lkl712显示出几乎没有或没有对抗RN-K8的活性。 相反，lkl791显示出非常高的活性，并在5 μ g/ml浓度时显示出大约为50%的细胞毒性。 lkl791之后，lk0924显示出大约为25%的细胞毒性，lkl422和lkl736显示出大约为10% 的细胞毒性。从以上可以看出，证实了用作这些测试对象的6种嵌合抗体表现出等于或强于利妥西单抗的CDC活性。实施例3(1)结合亲和性的测量在CO2培养箱中在37°C和5% CO2浓度下用补充10%灭活FCS的RPMI1640培养 基培养源自人B细胞的Raji细胞。通过每周亚培养两次来维持这些细胞。将亚培养后三至四天的细胞(含有大约IxlO6个细胞/ml)在室温下1，OOOrpm离 心5分钟。将细胞悬浮于PBS(-)中并再以1，OOOrpm离心5分钟，以除去上清液。将这些 程序重复两次用于洗涤细胞。通过使各自的抗⑶20抗体(作为阳性对照抗体的小鼠抗体2B8、嵌合抗体和人 源化抗体C2B8)与Raji细胞充分混合，并将混合物在室温下接受反应一小时，来进行与一 抗的反应。在反应中，各自的抗CD20抗体具有1. 33,2. 67,4. 00,5. 33,6. 67,8. 00,9. 33、 10. 67、12. 00、13. 33、14. 67、16. OOnM的12个终浓度，细胞数目为5xl06个细胞，并且反应溶 液使用了 BSA/PBS溶液，将其注入1. 5ml管中至100 μ 1的终体积。每一种待测试的抗 体制备三个样品，还准备了 4支不加抗体的试管，作为用于背景计算的样品。反应后，在室温下将混合物以3，OOOrpm离心3分钟以除去未反应的一抗，并收集细胞。
将100 μ 1体积的在1 % BSA/PBS溶液中以5 μ g/ml的浓度制得的FITC-标记的二 抗加入试管中，使得FITC标记的二抗相对于结合细胞的一抗是过量的，并且在悬浮后，将 混合物在室温下反应一小时，同时避光。所用的FITC-标记二抗对于小鼠抗体为山羊抗小鼠IgG(H&L)_FITC，对于嵌合抗 体或人源化抗体为山羊F(ab，)2片段[sic]抗人IgG(FcY)-FITC。反应后，将混合物在室温下以3，OOOrpm离心3分钟。除掉未反应的FITC-标记的 二抗，并收集细胞。通过将细胞悬浮于200 μ 1 PBS中并再次离心来洗涤细胞。将细胞悬浮于100 μ 1 PBS中，并转移至平底96孔平板中。用Typhoon9210图像 分析仪(Amersham Bioscience)测量二抗的荧光强度。检测后，用图像分析软件Image Quant (AmershamBioscience)将图像数字化，并使 用Excel (Microsoft)分析。计算相同的测试抗体的平均值，并且从每种测试抗体的值中减 去从用于背景计算的样品(其中仅有细胞和FITC-标记的二抗反应)获得的平均值，由此 估算从平板、PBS溶液和与细胞非特异性结合的FITC-标记的二抗得到的背景值。此外，通 过测量仅含有0,12. 5、25、50、75、100、125和150ng/100y 1量的FITC-标记二抗的溶液产 生的荧光量来制备标准曲线。将该标准曲线用于测定结合细胞的二抗的摩尔数。假定每种 一抗和FITC-标记的二抗以1 5比率反应，计算了结合细胞的一抗的量。通过从加入量 中减去结合量来计算游离一抗的量。将这些值用于斯卡查德分析，由此计算解离常数Kd。结果显示于以下的表4中。(2)细胞凋亡诱导测试用Armexin V-FITC细胞凋亡试剂盒在以下两种反应条件下检测最初的细胞凋亡 第一种条件是其中测量了抗CD20抗体单独诱导对抗源自人B细胞株的细胞的细胞凋亡 (无交联的条件)，第二种条件是其中测量了通过加入识别抗CD20抗体Fc区的二抗诱导的 细胞凋亡(交联)。通过在补充10%灭活FCS的RPMI1640(培养基)中，在37°C和5% CO2浓度下培 养源自人B细胞的四种细胞Raj ji、WiL2-NS、SU-DHL4和RC-K8细胞。通过每周亚培养两 次来维持这些细胞。亚培养后三至四天，将细胞培养物(大约IxlO6个细胞/ml)在室温下以1，OOOrpm 离心5分钟，以收集细胞。将各自的抗CD20抗体(作为阳性对照抗体的小鼠抗体2B8，嵌合抗体和人源化抗 体C2B8 ；作为阴性对照的抗CD2单克隆抗体)与悬浮于新鲜培养基中的细胞充分混合，并 且将混合物在37°C和5% CO2浓度的培养箱中反应1. 5小时。在反应中，各自的抗⑶20抗 体具有0. 2、1和5 μ g/ml三种终浓度，细胞密度为IxlO6个细胞/ml，并且反应溶液使用了 培养基，并将其以250 μ 1的体积置于1. 5-ml试管中，并接受反应。对于每种待测试的抗体， 制备三种样品。反应后在室温下以1，200rpm将混合物离心3分钟，以除去未反应的抗体并收集细 胞。在无交联的条件下，将250μ1的新鲜培养基加入细胞中。在交联的条件下，将 250 μ 1识别抗-⑶20抗体Fc区的二抗(其含量是⑶20抗体含量的5倍)加入细胞中。混合后，将混合物在37°C和5% CO2浓度的培养箱中再反应三小时。所用的二抗对于小鼠抗体 为山羊抗小鼠IgG Fcy片段，对于嵌合和人源化抗体为特异性的山羊抗人IgG Fcy片段。
反应后，将混合物在室温下以3，OOOrpm离心3分钟以除去未反应的二抗并收集细 胞。通过将细胞悬浮在250 μ 1 PBS中并再次离心来洗涤细胞。用于检测的试剂使用了 MEBCYT0细胞凋亡试剂盒-AnnexinV_FITC，PI-(MBL,目录 号4700，批号21)。将细胞悬浮于85μ 1结合缓冲液后，加入5μ 1 Annexin V-FITC和5μ1 碘化丙啶(PI)(终浓度为0. 5mg/ml)并充分混合，将混合物在室温下避光反应15分钟。使用流式细胞术(EPICS ALTRA :BECKMAN COULTER)测量总数为20，000的细胞并 进行分析(Expo32 :BECKMAN COULTER)。结果显示于图7a至图9d中。(3)制备生产人源化抗体的细胞株(a) DNA 合成基于SEQ ID No 17-24中所示的氨基酸序列，以常规程序设计并合成对CHO细胞 密码子优化的DNA。(b)制备构建体使用作为表达载体的pNOW构建了 16种用于人源化1K1791的表达构建体。制得 了用于人源化 1K1791 的表达构建体。pN0ff-aa 1791 kgUpN0ff-af 1791 kgUpNOff-as 1791 kgU pN0ff-avl791kgU pN0ff-fal791kgU pNOff-ff 1791kgU pNOff-fs 179 IkgU pN0ff-fvl791kgU pN0ff-sal791kgU pNOff-sf 1791kgU pN0W_ssl791kgl、pN0ff-svl791kgU pN0ff-val791kgU pN0W-vfl791kgl、pN0W-vsl791kgl、pN0W-vvl791kgl。(c)使用化学试剂的转染和选择使用转染试剂将用于人源化1K1791的表达构建体各自引入CHO DG44cdB中。将 其中引入各种基因的IxlO6个CHO DG44cdB细胞悬浮于100ml选择培养基中，接种于5块 96孔平板中(200 μ 1/孔)，在37°C和5%二氧化碳气氛下培养3至4周。转染试剂Qiagen，Effectene转染试剂，目录号301427。选择培养基:ISCHO-CD w/ 水解产物 /4mM GlutaMAX/0. 8mg/ml G418。(d)高表达细胞株的选择1)从存在克隆的孔中回收上清液，使用斑点印迹测定法测量所产生的抗体量。2)将表现出高抗体产量的克隆转移至24孔平板种，在培养大约5天后，回收上清 液，并使用夹心ELISA来测量所产生的抗体量。3)选择两个表现出高表达水平的克隆并转移到T75培养瓶中。(e)小规模培养将所选择的用于16种构建体的两个克隆在含有30ml选择培养基的T75培养瓶中培养。(4)人源化抗体生产株的培养和纯化在含有IS CHO-CD的水解产物/补充了 4nM GlutaMax (Invitrogen,目录号 35050-061)和 200yg/ml G418 (Sigma,目录号 A1720-5G)的水解产物培养基(Irvine Scientific,目录号91119)中，在37°C和5% CO2浓度的CO2培养箱中培养生产抗体的细胞 株(遗传重组的CH0-DG44细胞)。通过每周亚培养两次来维持这些细胞。
在开始亚培养后大约2周的细胞培养物在室温以3，500rpm离心5分钟以收集上 清液，随后使用0. 45 μ m注射器滤器过滤，并用50mM Tris-HCl, pH7. 0平衡。
将上清液装载至Hi Trap蛋白质A HP柱(GE Healthcare,目录号17-0402-01)中， 然后使用50mM Tris-HCl，pH7. 0洗涤。使用0. IM柠檬酸pH4. 0获得洗脱液。收集400 μ 1 的级分并用40μ 1(对应于级分体积的10/l[sic])的IM Tris-HCl, pH 9.0中和。使用 Slyde-A Lyzer IOK透析盒(PIERCE，目录号66453)对100倍体积的PBS进行透析2次，每 次2. 5小时，然后再进行一次15-18小时的透析。使用0. 22-μ m注射器滤器将纯化的样品 过滤，接着使用 VIVA SPIN 50，000 MWCO PES(VICASCIENCE,目录号 VS0231)进行浓缩。使 用BECKMANCOULTER DU530从A280值计算抗体浓度。所用的产生抗体的细胞株为CHO细胞hzl791-fvl0、hzl791-ff34、hzl791_sf43和 hzl791-SS32，这些细胞株依据布达佩斯条约的规定，分别于平成18年(2006)3月1日以保 藏号FERM BP-10543、FERMBP-10544、FERM BP-10545和FERM BP-10546保藏于国际专利生物 保藏单位日本产业技术综合研究所，Tsukuba Central6, l-l-lHigashi，Tsukuba, Ibaraki，日本。下文描述了从这些细胞株获得的人源化抗⑶20单克隆抗体H链V区和L链V区 的氨基酸序列(SEQ ID No:17-24)(下划线的氨基酸不同于相应的小鼠抗体的那些)。人源化Ikl791序列L-链 V-区的序歹Ij (SEQ ID No 20)Ven 1791:STVMTQSPDSLAVSLGERVTINC KASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKVLIY FASNRYTGVPDRFSGSGYGTDFTFTISSVQAEDVAVYFC QQDYSSPLTFGAGTKLELKH-链 V-区的序歹Ij (SEQ ID No 24)Ven 1791 :QIQLVQSGPELKKPGASVKISCKASGYTFT NFGVNffVKQAPGKGLKffMG WINTYTGEPSYADDFKG RFAFSLDASVSTAYLQISSLKAEDTSTYFCTR RTNYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSSL-链 V-区的序歹Ij (SEQ ID No 17)abb 1791 :STVMTQSPDSLAVSLGERATINC KS SQSVSNDVAWYQQKPGQSPKVLIY FASNRYSGVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQDYSSPLTFGAGTKLEIKH-链 V-区的序歹Ij (SEQ ID No 21)abb 1791 :QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT NFGVNffVRQAPGKGLEffMG WINTYTGEP SYAQGF1G RFVFSLDASVSTAYLQISSLKAEDTATYFCTR RTNYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSSL-链 V-区的序歹Ij (SEQ ID No 19)sdr 1791:STVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSNSNDVAWYQQKPGQSPKVLIY FASNRYSGVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQDYSSPLTFGAGTKLEIKH-链 V-区的序歹Ij (SEQ ID No 23)sdr 1791 :QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT NFGVNffVRQAPGKGLKffMG WINTYTGEPSYAQGFTG RFAFSLDASVSTAYLQISSLKAEDTATYFCTR RTNYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS
L-链 V-区的序歹Ij (SEQ ID No 18)fra 1791STVMTQSPSFLSASVGDRVTITC KASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKVLIY FASNRYTGVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQDYSSPLT
FGAGTKLEIKH-链 V-区的序歹Ij (SEQ ID No 22)fra 1791 :QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFT NFGVNffVKQAPGKGLKffMG WINTYTGEPSYADDFKG RFAFSLDASASTAYLQISSLKAEDMTYFCTR RTNYYGTSYYYAMDY WGQGTTVTVSS在该系列实验中，关于获自结合四种AbbL、FraL, SdrL, VenL和四种AbbH、FraH, SdrHJenH产生的全部16个序列组合中各两个克隆进行了实验。从以上结果看，可以基于 它们的Kd值，将这些克隆分类成4组，如表5中所示。从每组选择一个克隆并用于进一步 的实验中。在本说明书和权利要求书中，例如，提及人源化抗体1791的克隆fv时，意味着其 中结合了 ￡ral791 的 L-链(SEQ ID NO 18 中所示的 L-链)禾Π Ven 1791 的 H-链(SEQ ID NO :24中所示的H-链)的抗体克隆(进行下划线标注用于解释)。这同样适用于其他克隆。对照c2B8I 组Kd=>20nMII 组Kd = 10-20nMIII 组Kd = 8-10nMIV 组Kd=<8nM 表4人源化抗体结合解离常数
表5人源化抗体的结合解离常数
这些使用8种小鼠抗体的细胞凋亡实验的结果显示于图7a至图7d中。发明人能 够将8种小鼠抗体以及已知的CD20抗体2B8和2H7相对于四种类型的细胞分成2类(不 包括一些例外)。A 组m0924、ml422、ml791、m2B8B 组ml228、ml402ml712、ml782、m2H7(然而，对于SU-DHL4细胞，m0924包括在B组内)。换言之，A组包括表现出通过自身足以诱导细胞凋亡的能力并且即使在与二抗交 联的情况下也具有大约相同的细胞凋亡诱导能力水平的抗CD20抗体，而B组包括表现出通 过自身不足以诱导细胞凋亡的能力并且在交联条件下具有很大程度提高的诱导细胞凋亡 能力的抗-⑶20抗体。此外，属于A组的抗体呈现出与2B8抗体相当的亲和性，而属于B组的抗体则表现出高于2B8的亲和性。因此，可以推断A组的抗体更适于用作药物，因为它们 不需要二抗的存在来诱导细胞凋亡并且能够通过自身来诱导细胞凋亡。现在转向细胞类型，结果表明RAJI、WIL2-NS、RCK8在30至40%的范围中具有最 高的细胞凋亡比例，而SU-DHL4细胞在一些情况中表现出不低于80%的最大比例。四种人源化抗体的结果显示于图8a至图9d中。与小鼠抗体相似，将人源化1791抗体的四个克隆相对于所有四种类型的细胞分
成两组。A 组fvl0、ff34B 组sf43、ss32、C2B8呈现出与C2B8相当亲和性的A组抗体fvlO和ff34在没有交联的条件下具有与 C2B8几乎相同的细胞凋亡活性，并在交联情况下具有明显提高的活性。尽管B组的sf和ss 抗体比A组的抗体表现出更大的解离常数和更弱的亲和性，但这些抗体独立表现出比C2B8 略强的细胞凋亡活性。关于抗⑶20抗体诱导对抗B细胞的细胞凋亡的能力，当它们呈现出充分的通过自 身诱导细胞凋亡的能力时，在交联条件下的细胞凋亡比例基本上是相同。然而，当它们由于 抗体类型、不饱和的条件等而未呈现出足够的通过自身诱导细胞凋亡的能力时，可能在交 联条件下细胞凋亡活性将提高。图9a至图9d是显示早期细胞凋亡(％ )的图，其中将实验当天“无Ab”(未加入 抗体)条件下的早期细胞凋亡比例设定为1。人源化抗体1791的四个克隆(克隆fv、ff、sf和ss)对抗Raji、SU-DHL4、WiL_2 和RCK8细胞的细胞凋亡活性概括于表6中。表6人源化抗体-1791克隆的细胞凋亡活性 使用Raji细胞、SU-DHL4细胞、WiL_2细胞和RCK8细胞，对人源化抗体1791的克 隆fv、ff、Sf和SS测量了⑶C活性。各自的结果显示于表7中。包括利妥西单抗(C2B8)和克隆1791(cl791)作为对照。表7根据本发明的人源化抗体的⑶C活性 表7中的结果显示克隆ff和fv表现出等于或强于利妥西单抗的⑶C活性。此外， sf对WiL2和RCK8细胞显出示极强的⑶C活性。还进行了实验来研究抗体浓度和CDC活性之间的关系。将所用的抗体纯化至比按 照实施例2所述制备的抗体更高的纯度。按照以下所述的程序来进行纯化。在含有补充了4mM GlutaMax (Invitrogen,目录号 35050-061)和 200 μ g/ml G418 (Sigma，目录号 A1720-5G)的水解产物的 IS CHO-CD/w 培养基(Irvine Scientific, 目录号91119)中，在37°C和5% CO2浓度下，在CO2培养箱中培养生产抗体的细胞株(遗 传重组的CH0-DG44细胞)。通过每周亚培养两次来维持该细胞。将亚培养后大约2周的 细胞培养物在室温下以3，500rpm离心5分钟以收集上清液，随后使用0. 45 μ m注射器滤 器过滤并用50nM Tris-HCl, ρΗ7.0平衡。将上清液装载至Hi Trap蛋白质A HP柱上(GE Healthcare,目录号 17-0402-01)，然后使用 50mM Tris-HCl, ρΗ7· 0 洗涤。使用 0. IM 柠檬 酸，ΡΗ4. 0，获得洗脱液。收集400 μ 1的级分并用40 μ 1 (对应于级分体积的10/1 [sic]) IM Tris-HCl, pH9. 0 中和。使用 Slyde-A-LyzerlOK 透析盒(PIERCE 目录号 66453)对 100 倍 体积的PBS进行透析2次，每次2. 5小时，然后再进行一次15-18小时的透析。使用VIVASPIN50, 000MWC0 PES(VIVASCIENCE,目录号 VS0231)浓缩透析过的样 品。将样品装载于用PBS平衡的HiLoadl6/60superdex 200制备级柱上(GE Healthcare, 目录号17-1069-01)。使用0. 22 μ m注射器滤器过滤纯化的样品，并用VIVASPIN50，000MWC0 PES (VIVASCIENCE,目录号 VS0231)浓缩。使用 BECKMAN C0ULTERDU530 从 A280 值计算抗体 浓度。图IOa至图IOd显示了人源化抗体fv、ff、sf和ss以及嵌合抗体clkl79对Raji、 SU-DHL4、WiL-2和RCK8细胞的浓度和⑶C活性之间的关系。在所有实验系统中，5 μ g/ml 或更高浓度下的人源化抗体fV、fT、sf和ss的CDC活性等于或高于利妥西单抗(C2B8)的。 特别地，尽管利妥西单抗呈现出对抗RC-K8细胞的低CDC活性，但根据本发明的人源化抗体 1791的四个克隆呈现出利妥西单抗至少约4倍高的对抗RC-K8细胞的⑶C活性。还检测了fv、ff、sf 和 ss 对抗 Raji、SU-DHL4、WiL-2 和 RCK8 细胞的 ADCC 活性。抗体浓度和ADCC之间的关系显示于图Ila至图Ild中(E T比例为25)。根据本发明的 人源化抗体1791的四个克隆fv、ff、sf和ss的ADCC活性等于或高于Rituxan (C2B8)的。 这些ADCC活性结果还证明了根据本发明的人源化抗体系列1791的功效。实施例4 获得另一种类型的人源化抗-CD20单克隆抗体(人源化抗体1782)从没有通过自身诱导细胞凋亡并具有高亲和性的抗体组中选择系列1782作为具 有最高亲和性的抗体，并接受人源化。获得人源化抗体1782的克隆并根据之前实施例中所 述的程序检测其特性。还根据之前实施例中所述的程序检测了所得到的人源化抗体的特性。基于SEQ ID NO ,21至34中的氨基酸序列，涉及了对CHO细胞密码子优化的DNA， 并以常规程序合成。使用PNOW作为表达载体构建了 16种用于人源化1K1782的表达构建 体。这些构建体如下pN0W-aal782kgl、pN0ff-af 1782kgl, pN0ff-as 1782kgU pN0W_avl782kgl、 pN0ff-fal782kgU pNOff-ff 1782kgU pNOff-fs 1782kgU pNOff-fv 182IkgU pN0W_sal782kgl、 pNOff-sf 182IkgU pN0W_ssl782kgl、pN0ff-svl782kgU pNOff-va 1782kgU pNOff-vf 1782kgU pN0ff-vsl782kgl 和 pN0W_vvl782kgl。此外，根据实施例3中所述的程序进行了使用化学剂的转染和选择，用于选择高 表达细胞株，小规模培养和培养产生人源化抗体的细胞株并纯化人源化抗体。所用的生产抗体的细胞株是CHO 细胞 hzl782_ss21、hzl782_fv02、hzl782-ffl4 和 hzl782-sf23，其中细胞株 hzl782_ss21、hzl782-fv02 和 hzl782_ffl4 依据布达佩斯条 约的规定，分别于平成19年(2007)8月31日以保藏号FERM ABP-10907、FERM ABP-10906 和FERMABP-10905保藏于国际专利生物保藏单位日本产业技术综合研究所，Tsukuba Central6,1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, El*。以下描述了获自这些细胞株的人源化抗-⑶20单克隆抗体的H-链V-区和L-链 V-区的氨基酸序列(SEQ ID NO 17至24)。人源化lkl782的序列L-链 V-区的序歹Ij (SEQ ID No 27)Ven 1782 DILLTQSPATLSLSPGERATLSC RASQNIGTSIHWYQQKPGQSPRLLIK YASESFSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFADYYC QQSNSffPFTFGSGTKLEIKH-链 V 区的序列(SEQ ID No :31)Ven 1782 QVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFT SYffMHffVKQAPGQGLEffIG YITPSTGYTDYNKKFKDKATLTADRSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR SGPYFDVWGAGTTVTVSSL-链 V-区的序歹Ij (SEQ ID No 28)abb 1782 DIVLTQSPATLSLSPGERATLSC RASQNIGTSIHWYQQKPGQSPRLLIK YASESFTGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFADYYC QQSNSffPFTFGSGTKLEIK
H-链 V-区的序歹Ij (SEQ ID No 32)Abb 1782 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SYffMHffVRQAPGQGLEffMG YITPSTGYTDYNQKFQGRVTLTADRSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR SGPYFDVWGAGTTVTVS S
L-链 V 区的序列(SEQ ID No 29)sdr 1782 DILLTQSPATLSLSPGERATLSC RASQNVGTSLHWYQQKPGQSPRLLIK YASERFTGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFADYYC QQSNSffPFTFGSGTKLEIKH 链 V-区的序列(SEQ ID No 33)sdr 1782 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SYffMHffVKQAPGQGLEffIG YITPSTGYTDYNQKFQGKATLTADRSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR SGPYFDVWGAGTTVTVSSL-链 V 区的序列(SEQ ID No 30)fra 1782 DILLTQSPATLSVSPGERATLSC RASQNIGTSIHWYQQRPGQSPRLLIK YASESFSGIPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDIADYYC QQSNSffPFTFGSGTKLEIKH-链 V-区的序歹Ij (SEQ ID No 34)fra 1782 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SYffMHffVKQAPGQGLEffIG YITPSTGYTDYNKKFKDKATLTADRSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR SGPYFDVWGAGTTVTVSS在说明书和权利要求书中，提及人源化抗体1782的克隆fv时，意思是其中结合了 fral782 的 L-链(SEQ ID NO 30 中所示的 L-链)和 Venl782 中所示的 H-链(SEQ ID NO 31中所示的H-链)的抗体。这同样适用于其他克隆。(a)人源化抗体1782的亲和性测量参照实施例3中的结果，发明人假定了人源化抗体1782的克隆也分成四组，并且 选择了属于各组的ss、sf、ff和fv。测量了这些抗体、Rituxan (C2B8)和人源化抗体2f2对 抗⑶20的Kd值。结果显示于表8中。在说明书和权利要求书中，例如，提及人源化抗体1782的克隆sf时，意思是其中 结合了 sdrl782的L-链(SEQ ID NO 29中所示的L-链)和fral782中所示的H-链(SEQ ID NO :34中所示的H-链)的抗体(进行下划线标注用于解释)。这同样适用于其他克隆。表8人源化抗体1782克隆的结合解离常数(Kd) 根据之前的实施例检测了这些人源化抗体的Kd值。所用的细胞是Raji细胞。一 抗的检测使用了 FITC-标记的蛋白A，并且对一抗和蛋白A的结合比例为1 3的假定进行 了分析。
人源化抗体1782的克隆ff呈现出最低的Kd值，这低于Rituxan和人源化抗体 2f2的那些。即，发现了人源化抗体1782的克隆ff对⑶20具有最高的亲和性。
(b)人源化抗体1782的细胞生长抑制活性测定了人源化抗体1782的四个克隆fv、ff、sf和ss的细胞凋亡诱导活性、⑶C活 性(％ )和ADCC活性。根据之前实施例中所述的程序测量这些活性。(bl)人源化抗体1782的细胞凋亡诱导活性使用RC-K8、SU-DHL4、RAJI和WIL2NS细胞测量了人源化抗体1782的细胞凋亡诱 导活性。结果显示于图12a至图12d中(在图中)，右侧的数字表示抗体浓度，而XL表示存 在与二抗(山羊抗人抗体)的交联。图13a至图13d显示了将无加入抗体条件下诱导细胞凋亡的能力设定为1时，人 源化抗体-1782克隆的细胞凋亡诱导活性。人源化抗体的系列1782呈现出弱的通过自身诱导细胞凋亡的能力，但在交联条 件下细胞凋亡诱导活性等于或高于Rituxan(C2B8)的。结果概括于表9中。人源化抗体-1782克隆的细胞凋亡诱导活性(在表中，XL表示与二抗(山羊抗人 抗体)交联的存在)。表 9 (b2)人源化抗体1782的CDC活性首先使用RC-K8和SU-DHL4细胞测量了人源化抗体1782的克隆fv和ff的CDC活性。结果显示于图14a和图14b中。发现了在0.1和lyg/ml抗体浓度下的活性之间没 有太大差别。人源化抗体1782的克隆fv和ff呈现出对抗这些细胞类型中任一种的高⑶C 活性。在抗Rituxan的RC-K8细胞的情况中，fv具有最高的CDC活性。在SU-DHL4细胞的 情况中，人源化抗体1782的克隆fv和ff呈现出高⑶C活性，这高于Rituxan的。使用RAJI、WIL2NS、SU-DHL4和RC-K8细胞测量了人源化抗体1782的四个克隆fv、 ff> Sf和SS的⑶C活性。结果概括于表10中。表10人源化抗体-1782克隆的⑶C活性 这些人源化抗体-1782克隆呈现出对抗RC-K8细胞的⑶C活性，RC-K8细胞是抗 Rituxan的，以及对抗RAJI、WIL2ND和SU-DHL4细胞的CDC活性。特别地，克隆ff和fv具 有高⑶C活性并呈现出明显高于Rituxan的对抗SU-DHL4细胞的⑶C活性。将Kd值和CDC活性的结果放在一起看，优选克隆ff，因为其具有最高的亲和性，相 对高的⑶C活性以及对抗Rituxan抗性株RC-K8的⑶C活性，以及克隆fv也是优选的，因 为其具有最高的⑶C活性，并且此外，其对抗Rituxan抗性株RC-K8也是有效的。特别地， 因为克隆ff具有非常高的亲和性，可以将其RI标记，以用于涉及B-细胞疾病的靶向治疗。(b3)人源化抗体1782的ADCC活性首先使用RC-K8和SU-DHL4细胞测量了人源化抗体1782的克隆fv和ff的ADCC 活性。结果显示于图15a和图15b中。发现了在0.1和lyg/ml抗体浓度下的活性之间没 有太大差别。在RC-K8细胞的情况中，克隆ff具有高于克隆fv和Rituxan的ADCC活性。 在SU-DHL4细胞中，克隆fv呈现出与Rituxan相当的ADCC活性，而克隆ff具有相对低的 ADCC活性。使用RAJI、WIL2NS、SU-DHL4和RC-K8细胞测量了人源化抗体1782的四个克隆fv、 ff> Sf和SS的ADCC活性。结果概括于表11中。表11人源化抗体-1782克隆的ADCC活性
克隆fv是优选的，因为其具有对抗SU-DHL4细胞的高ADCC活性，以及克隆ss也 是优选的，因为其具有对抗RC-K8细胞的高ADCC活性。工业应用性根据本发明，提供了抗CD20单克隆抗体，特别是人源化抗体，及其生产方法，和含 有这些抗体的用于治疗涉及B-细胞疾病的治疗剂，抗体在其天然状态对人CD20分子具有 高结合亲和性并表现出适合作为药物用途的生物学活性。因此，本发明适用于制造用于治 疗癌症的药物、癌症研究等领域。序列表的自由文本SEQ ID NO 17 人源化抗体abb 1791的L链V区序列SEQ ID NO 18 人源化抗体fra 1791的L链V区序列SEQ ID NO 19 人源化抗体sdr 1791的L链V区序列SEQ ID NO 20 人源化抗体Ven 1791的L链V区序列SEQ ID NO 21 人源化抗体abb 1791的H链V区序列SEQ ID NO 22 人源化抗体fra 1791的H链V区序列SEQ ID NO 23 人源化抗体sdr 1791的H链V区序列SEQ ID NO 24 人源化抗体Ven 1791的H链V区序列SEQ ID NO :25 引物SEQ ID NO :26 引物SEQ ID NO 27 人源化抗体 Ven 1782 的 L-链 V 区SEQ ID NO 28 人源化抗体 abb 1782 的 L-链 V 区SEQ ID NO 29 人源化抗体 sdr 1782 的 L-链 V 区SEQ ID NO 30 人源化抗体 fra 1782 的 L-链 V 区SEQ ID NO 31 人源化抗体 Ven 1782 的 H-链 V 区SEQ ID NO 32 人源化抗体 abb 1782 的 H-链 V 区SEQ ID NO 33 人源化抗体 sdr 1782 的 H-链 V 区SEQ ID NO 34 人源化抗体 fra 1782 的 H-链 V 区[序列表]
权利要求
人源化抗-CD20单克隆抗体，其含有SEQ ID NO27至30任一中所示的L-链和SEQ ID NO31至34任一中所示的H-链的组合。
2.根据权利要求1的人源化抗-⑶20单克隆抗体，其含有SEQIDN0:30中所示的L-链 和SEQ ID NO 34中所示的H-链的组合。
3.根据权利要求1的人源化抗-⑶20单克隆抗体，其含有SEQIDN0:30中所示的L-链 和SEQ ID NO 31中所示的H-链的组合。
4.根据权利要求1的人源化抗-⑶20单克隆抗体，其含有SEQIDN0:29中所示的L-链 和SEQ ID NO 33中所示的H-链的组合。
5.根据权利要求1的人源化抗-CD20单克隆抗体，其是通过选自使用日本产业技术 综合研究所的国际专利生物保藏，依据保藏号FERMABP-10907、FERM ABP-10906和FERM ABP-10905进行保藏的细胞产生的。
6.生产人源化抗-CD20单克隆抗体的方法，其包括培养选自使用日本产业技术综合研 究所的国际专利生物保藏，依据保藏号FERMABP-10907、FERM ABP-10906和FERM ABP-10905 进行保藏的细胞。
7.用于治疗B-细胞介导疾病的治疗剂，其含有根据权利要求1至6任一项的人源化 抗-CD20单克隆抗体作为活性成分。
全文摘要
打算提供具有对抗具有人CD20抗原的细胞的生长抑制活性的单克隆抗体，其通过使用表达人C20抗原的人B细胞系作为免疫原和源自非人动物的细胞系来生产抗体，该非人动物不同于待免疫的动物并且已经用人CD20DNA转化，并提供通过上述单克隆抗体的嵌合或人源化获得的单克隆抗体。这些单克隆抗体显示出适于用作药物的生物活性。
文档编号A61K39/395GK101848999SQ20078010142
公开日2010年9月29日 申请日期2007年9月6日 优先权日2007年9月6日
发明者内山进, 福井希一 申请人:国立大学法人大阪大学