一种羊皮肤组织酵母cDNA文库及其构建方法与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种羊皮肤组织酵母cdna文库及其构建方法。

背景技术：

羊痘是羊感染羊痘病毒后，引起以皮肤痘疹为主要特征的传染病，羊痘病毒主要存在于病羊的皮肤、黏膜的丘疹、脓疱、痂皮内及鼻黏膜分泌物中，在发病羊体温升高时，其血液中存有大量病毒，病羊为传染源，主要通过传染的空气经呼吸道感染，也可以通过损伤的皮肤或黏膜侵入机体。饲养管理人员、护理工具、皮毛产品、饲料、垫草及体外寄生虫都为传染媒介；绵羊中细毛羊比粗毛羊或土种羊易感染，病情严重；羔羊较成羊敏感，病死率高。气候寒冷、雨季、霜冻、枯草期和饲养管理因素都是发病和加重病情的诱因。

绵羊痘临床表现：病羊体温升高达41～42℃，结膜眼睑红肿，呼吸和脉搏加快，鼻流出黏液，食欲丧失，弓背站立，经1～2天后出现痘疹，痘疹多见于皮肤无毛或少毛处，先出现红斑，后变成丘疹再逐渐形成水疱，最后变成脓疱，脓疱破溃后，若无继发感染逐渐干燥，形成痂皮，经2～3周痊愈。发生在舌和齿龈的痘疹往往形成溃疡。有的羊咽喉、支气管，肺脏和前胃或真胃黏膜上发生痘疹时，病羊因继发细菌或病毒感染，而死于败血症。有的病羊见痘疹内出血，呈黑色痘：还有的病例痘疹发生化脓和坏疽，形成深层溃疡，发出恶臭，常为恶性经过，病死率高达20％～50％以上。

山羊痘临床表现：病羊发热，体温升高达40～42℃，精神不振，食欲减退或不食，在尾根、乳房、阴唇、尾内肛门的周围、阴囊及四肢内侧，均可发生痘疹，有时还出现在头部、腹部及背部的毛丛中，痘疹大小不等，呈圆形红色结节、丘疹，迅速形成水疱、脓疱及痂皮，经3～4周痂皮脱落。

羊皮组织病理：表皮内有明显的细胞内及细胞间水肿，空泡形成及气球样变性，真皮有密集的细胞浸润，中央主要由组织细胞和巨噬细胞，周围有淋巴细胞和浆细胞，很少见多形核白细胞浸润。整个损害有许多内皮细胞增生和肿胀的小血管。在真皮血管内皮细胞的胞浆里可以见到嗜酸性包涵体。因此，从基因角度研究羊痘病病理情况，可为病理研究与治愈提供科学依据。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明实施例提供了一种羊皮肤组织酵母cdna文库及其构建方法。

为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供了一种构建羊皮肤组织酵母cdna文库的方法，包括以下步骤：提取羊痘病羊皮组织总rna；

从所述总rna中分离出mrna；

构建酵母双杂交文库；

鉴定所述酵母双杂交文库的质量；

提取所述酵母双杂交文库的质粒，并将文库保存。

作为优选，所述提取羊痘病羊皮组织总rna是采用trizol法提取rna，其中采用液氮研磨羊皮组织。

作为优选，所述分离出mrna的操作过程：使用oligotexmrnakits分离纯化样本的mrna；将提取的mrna溶于depc水中，电泳检测以及测od值。

作为优选，所述构建酵母双杂交文库的操作过程：所述构建酵母双杂交文库的操作过程：用mrna反转录合成cdna；然后加5’接头，其中，设3个读码框，每个读码框连接一份，共3份；对加过接头的cdna均一化处理；用低熔点琼脂糖分离cdna长度；分离的cdna与载体连接；电转化大肠杆菌感受态细胞，最后得到羊皮肤组织酵母cdna文库；其中，所述酵母双杂交文库的扩增引物对为seqidno.1-2。

作为优选，所述鉴定酵母双杂交文库质量的操作过程：

容量的鉴定依据公式：

cfu/ml＝平板上的克隆数/10ul×100倍×1×10³ul；

文库总cfu＝cfu/ml×文库菌液总体积(ml)；

插入片段大小鉴定：挑取平板上的单克隆，pcr扩增，电泳检测pcr产物大小。

作为优选，所述提取所述酵母双杂交文库的质粒的操作过程：将酵母文库菌液进行铺板培养，使用35cm的平板，每块板铺1-2万个克隆子，第二天用培养基洗脱菌株，使用qiagen大抽试剂盒抽提质粒，共提取得到210ug去内毒素的高质量文库质粒；文库保存于-80℃冰箱内，文库质粒直接用于酵母文库筛选。

另一方面，本发明实施例采用上述方法得到一种羊皮肤组织酵母cdna文库。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过提取羊痘病羊皮组织总rna；从所述总rna中分离出mrna；构建酵母双杂交文库；鉴定所述酵母双杂交文库的质量；提取所述酵母双杂交文库的质粒，并将文库保存，可保存2年以上，文库质量可直接用于酵母文库筛选；本发明通过上述方法建立了羊皮肤组织酵母cdna文库，为以后研究羊痘病病例提供科学依据。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的羊皮组织rna电泳图；

图2是本发明实施例1提供的羊皮组织mrna电泳图；

图3是本发明实施例1提供的文库插入片段的pcr电泳图；

图4是本发明实施例1提供的酵母文库涂平板生长实物图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。

本发明涉及的专业术语解释如下：

酵母双杂交系统：由fields和song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生物转录因子，如gal4、gcn4、等都含有两不同的结构域：dna结合结构域(dna-bindingdomain)和转录激活结构域(transcription-activatingdomain)。前者可识别dna上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。

实施例1

构建羊皮肤组织酵母cdna文库：

1、采用trizol法提取羊痘病羊皮组织总rna：以液氮研磨样本，研磨至粉末状，向粉末状样本中加入20mltirozl，振荡混匀；室温静置5min，向样本中加入4ml酚氯仿，振荡混匀，样本总重量12000g，在4℃条件下离心10分钟，将上层液相转移到新的管子中，向新管中加入与上层液相等体积的异丙醇，振荡混匀；在4℃条件下以12000rpm转速离心15分钟后弃上清；向弃上清后的沉淀物中加入75％乙醇5ml洗涤2次，晾干后溶于500uldepc水，即获得羊痘病羊皮组织总rna；上述rna电泳图如图1所示，提取的总rna总量为306ug。

2、采用oligotexmrnakits(qiagen)分离纯化样本的mrna：将上述提取的总rna进行沉淀，重悬于500ul的depc水中，加入500ul70℃预热的obb，用移液器混匀，70℃水浴3min，然后立即置于20-30℃水浴10min，再于室温14000g离心2分钟，用移液器小心移去液体部分；用400ulow2重悬沉淀，用移液器轻轻混匀，转移到1.5ml离心柱上，14000g离心1分钟；转移过滤柱到一新的1.5ml离心管中，加入100ul70℃预热的depc水，用移液器吹打混匀，14000g离心1分钟；转移过滤柱到一新的1.5ml离心管中，加入400ulow2，14000g离心1分钟；重复上步，再用水洗脱一次，合并两次的洗脱液，加入60ul的2m乙酸钠及600ul无水乙醇，颠倒混匀，置于-80℃15min；在4℃，14000rpm高速冷冻离心15min，去上清；用75％乙醇洗涤沉淀，4℃14000rpm高速冷冻离心10min，去上清；在空气中晾干沉淀，最后溶于8ul的depc水中，取1ul电泳检测以及测od值；电泳检测图如图2所示；经过检测分离出的mrna质量可以满足文库要求，上述mrna总量为5.3ug。

3、酵母双杂交文库构建：

(1)合成cdna第一链：将上述分离得到的样品mrna转移到200ulpcr管中；按下表在0.2mlrnasefreetube中配置引物反应体系：

mrna7μl

3’rtprimer(30pmol)1μl

dntps(10mm)1ul

将反应管置于pcr仪上，65℃处理5min，立即置于冰上；在上步反应进行的过程中，按下表在一个新的0.2mlrnasefreetube中配置第一链反应体系，并置于冰上待用：

5xrtbuffer4μl

0.1mdtt2ul

rt酶5μl(invitrogen)

待引物反应管降至45℃后，维持在45℃孵育2min，加入上述第一链反应体系中混匀，避免产生气泡；将该反应管继续如下程序以合成第一链cdna:50℃60min。

(2)合成cdna第二链：

在上述反应液中按下表加入各成分：

16℃，2小时；

加入t4dnapolymerase2ul，16℃，5min，

加入0.5medta(ph8.0)10ul，

加入酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)160ul，充分混匀30sec；14000rpm，室温离心5min，小心将上清取到新的离心管中，乙醇沉淀，溶于34uldepc水中。

加5’接头(3个读码框，每个读码框连接一份，共3份)：

按照以下体系建立反应：

混匀后16℃，16-24小时，获得cdna。

合成cdna的扩增引物的核苷酸序列如seqidno.1-2，测序引物为seqidno.3-4，文库克隆的测序实例1序列如seqidno.5，实例2序列如如seqidno.6。

(3)均一化处理：将上步合成的cdna分别进行乙醇沉淀，最终溶解在14uldepc水中，取12ul进行后续反应(以下均一化处理3份平行实验)；加入4ul4x杂交buffer，98℃2min，68℃5小时；将pcr管保持在68℃，加入4ul5xdsnbuffer，然后加入0.2ul的dsn酶(1u/ul)，置于68℃反应3分钟；加入10uledta，混匀，加入等体积的酚氯仿抽提一次；将抽提产物进行乙醇沉淀，溶于80uldepc水中；取1ul保存；

按照以下体系建立反应

在pcr反应体系：

(4)cdna长度分离：使用低熔点琼脂糖电泳cdna，切胶回收1kbp以上的条带，乙醇沉淀后溶于14ul水中。

(5)cdna与载体的连接：

infusion重组反应：

按照以下体系建立重组反应体系：

混匀后置于50℃，30min，于重组反应体系中加入2ul的proreinasek,37℃，15min；75℃，10min，补水到100ul。

依次加入下列试剂：

glycogen(20μg/μl)1μl，

7.5mnh4oac50μl，

100％ethanol375μl；

混合均匀并置于-80℃不少于1小时；于4℃，16000rpm离心30min；小心去上清，加入150ul的70％乙醇，于4℃，16000rpm离心3min；重复此步骤一次，去尽上清，避免触动cdna沉淀，在室温，将cdna晾干5-10min；用10ul的depc水重悬cdna沉淀，用枪吹吸30-40次；瞬时离心2s收集cdna，立即置冰上。

(6)电转化大肠杆菌感受态细胞：每2ul的重组产物转化50ul感受态细胞；将1mm电转杯(bio-rad)置于-80℃预冷30min；在冰上，将2ul重组产物和50ul感受态细胞加入电转杯，置冰上45min；于电转化仪(bio-rad)上电击，电击后迅速向电转杯中加入lb培养基1ml，然后取入到新的15ml离心管，置于37℃，225-250rpm培养至少1小时；培养结束后，将培养物稀释10，100，1000，10000倍，分别取10ul稀释液涂平板，剩余培养物可4℃保存过夜，或者加入甘油至终浓度20％存于-80℃。

(7)酵母文库的构建文库质量鉴定：

库容量的鉴定：取转化后细菌原液10ul稀释100倍后，从中取出10ul涂布lb平板(含氨苄抗性)，第二天计数；

cfu/ml＝平板上的克隆数/10ul×100倍×1×10^3ul；

文库总cfu＝cfu/ml×文库菌液总体积(ml)；

插入片段大小鉴定：挑取平板上的单克隆，pcr扩增，电泳检测pcr产物大小。

pgadt7-rec双杂交文库：

库容量：1.05*10^7cfu，详细计算如下：

在10ul原始电转化菌稀释100倍后，取10ul涂板，共长了约210个克隆子，则库容量为：2310/10*100*1000＝2.1*10^6cfu/ml，共计5ml的转化后原始菌液，则总库容量为：2.1*5*10^6cfu＝1.05*10^7cfu插入片段电泳图如图3所示；从电泳图来看，插入片段平均长度在1.5kbp左右，文库阳性率为100％。平板图如图4所示。

(8)酵母文库质粒提取：将酵母文库菌液，进行铺板培养，使用35cm的平板，每块板铺1-2万个克隆子，第二天用培养基洗脱菌株，使用qiagen大抽试剂盒抽提质粒，共提取得到210ug去内毒素的高质量文库质粒。

(9)文库保存和文库筛选：文库保存于-80℃冰箱内，可以保存2年以上，文库质粒可以直接用于酵母文库筛选。

本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。

以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110>申请人名称：塔里木大学

<120>一种羊皮肤组织酵母cdna文库及其构建方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>34

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

taatacgactcactatagggcgagcgccgccatg34

<210>2

<211>33

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gtgaacttgcggggtttttcagtatctacgatt33

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

taatacgactcactatagggc21

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gtgaacttgcggggtttttc20

<210>5

<211>1230

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gtgggaattgagaaaaatacgacgtaccagattacgctcatatgacaagtttgtacaaaa60

aagttgggcccagactgttcttcggattgtggtgctcgggatctgggattacattgaaaa120

caagatagaggtgtttgacggggcagtgatcatcctgtccttggccccgatggtggcgtc180

cactgtggccaatgggccccggagcccttgggatgccatcagcctcatcattatgttccg240

gatctggcgggtgaagagggtgattgatgcctacgtcctgccggtgaaggtggagatgga300

gatggtcatccagcagtatgagaaggccaaggccatccaagacgagcagctggagagact360

gacgcagatctgtcaagagcaagggtttgagatccggcagctgcgggcacacctggctca420

gcaggacttggacctggcagcggagcgggaggcggcgcttcaggccccgcacgtgctcag480

ccagccgcgcagccgctacaaggtggtggaggccggcacgtgggccgaggagacagcggc540

cgagagcgttgtggaggagctgcagcctgcgcaagaagccacggtgaaagatgacatgaa600

cagctacatcagccagtactacaatgggcccagcagtgacagcggcgtcccagagccagc660

tgtgtgcgtggtcaccacggctgccatcgacatccaccagcccaacgtctcgtctgacct720

cttttccgtcgacgtgcccctgaagctcggcagcgatggcaccggtgccagcgccagctc780

cgagagcgccacccgctccacgcgcagctcggggcacccgggcccagagtgacagcagtc840

agacgctgggcttctccacggactgcagcgctgcccgcgaggagctgtcccccaggccca900

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<210>6

<211>342

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

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