一种鉴定单季茭白早晚熟特性的分子标记及其应用、获取方法与流程

本发明属于分子生物学
技术领域：
，具体涉及一种鉴定单季茭白早晚熟特性的分子标记及其应用、获取方法。
背景技术：
：茭白(zizanialatifoliaturcz.)为禾本科多年生宿根草本植物,原产于我国和东南亚地区，是我国的第二大水生蔬菜。茭白在我国早有栽培，西周之前，茭白的种子被作为粮食食用，后因发现其茎部被菰黑粉菌(ustilagoesculenta)感染而形成的菌瘿不仅可以食用，而且肉质肥嫩、口感极佳，而被当成一种蔬菜食用，唐朝末期开始被作为一种蔬菜广泛种植。除了作为蔬菜，茭白也可药用，具有利尿止渴、清热解毒之功效。单季茭是一年一种一收的茭白品种，采收季一般在9月份前后-10月初采收。单季茭是短日性作物，只有在秋季日照转短后才开始孕茭。单季茭一般植株高大，茭白色泽、口感优良，且种植范围较广。在我国，从北京到广州，从台湾到四川均可栽培。早熟的单季茭一般孕茭时间在处暑节气过后-秋分节气这段时间内，也有一些单季茭经过多年选育成为双季栽培的品种(例如美人茭、水珍1号、金茭2号等)。双季栽培的单季茭第一次采收期一般在夏至前这段时间，第二次采收期在9-10月与其他单季茭品种无异。这类早熟单季茭不仅有双季茭“一年两收”的特点，还有双季茭所不具备的茭白个头大，色泽白嫩等特点，因此市场价格比双季茭高。以桐乡市董家茭白合作社为例，6月中下旬采收的美人茭平均收购价格是6月初采收的龙茭2号的2-4倍。因此选育这类早熟的单季茭，可用于双季栽培，不仅能保留单季茭在茭白品质上相对于双季茭的优势，还能提高大田利用率，增加茭农收入。snp标记的原理是：生物体内经常发生单核苷酸变异(缺失，插入，移码)，这种变异的结果成为单核苷酸多态性。尽管snps大多位于非编码区，但与生物体表型有非常密切的关系。随着高通量测序技术的发展，大量的snps被解析出来，也极大地推动了基因组层面评估遗传多样性的研究。由于snp数据量非常庞大，因此基于snp开发的分子标记具有较高的精准度。技术实现要素：针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种鉴定单季茭白早晚熟特性的分子标记及其应用、获取方法的技术方案。本发明通过对茭白内生菰黑粉菌作snp扫描，筛选出多个与单季茭白早晚熟特性相关的分子标记，从而建立起单季茭白早晚熟特性分子标记辅助选择体系，提高单季早熟茭白品种的选择效率，为茭白高效选育奠定基础。所述的一种鉴定单季茭白早晚熟特性的分子标记，其特征在于包括分子标记uese1和uese2，所述分子标记uese1的正向引物uesnpse1-f核苷酸序列如seqidno.1所示，反向引物uesnpse1-r核苷酸序列如seqidno.2所示；所述分子标记uese2的正向引物uesnpse2-f核苷酸序列如seqidno.3所示，反向引物uesnpse2-r核苷酸序列如seqidno.4所示。所述的分子标记在茭白育种中的应用。所述的分子标记在茭白育种中鉴定单季茭白早晚熟中的应用。所述的分子标记的获得方法，其特征在于包括以下步骤：a、单季茭白熟性的鉴定：分批次采集不同地区的单季茭白品种并记录；b、群体分析1)分离培养茭白中的菰黑粉菌；2)ctab法提取菰黑粉菌基因组dna；3)将5个单季茭白的菰黑粉菌基因组dna进行基因组二代重测序；4)扫描得到所有snp；5)筛选出单季茭白早熟品种和晚熟品种菰黑粉菌的差异snp位点；6)选取20个采集自不同地区的茭白分离菰黑粉菌对筛选得到的snp位点进行验证；c、使用其他具有单双季特性的品种鉴定筛选的snp位点并获得图谱；共获得2对具有单双季特性的分子标记uese1、uese2。所述的获得方法，其特征在于步骤a中单季茭早晚熟特性的鉴定具体为：从浙江省桐乡市、浙江省金华市、浙江省余姚市、浙江省杭州市以及江苏省苏州市在8-9月份搜集单季茭白，记录采收期和茭重；采收时选取茭形完整、个头中等、茭叶无病害的茭白。所述的获得方法，其特征在于步骤b的1)中分离培养茭白中的菰黑粉菌具体为：a、将茭白茎部加无菌水磨碎；b、涂布至含羧苄青霉素和卡那霉素的yeps培养基上培养4-6d。所述的获得方法，其特征在于步骤b的5)中筛选出在单季早熟茭白菰黑粉菌和单季晚熟茭白菰黑粉菌的差异snp位点具体为：a、将所有snp数据标记为a、b两类，代表单季早熟、单季晚熟两个特性；b、计算机自动识别a、b两类所有的snp并归类；输出格式为genotyping*simple-a/b.txt.；数据内容为snp_sitea/b,a代表具有该snp的个数，b代表一类的总个数；c、将数据复制至excel工作表，使用筛选功能，选取只在a类中为1，b类中为0的snp。所述的获得方法，其特征在于步骤b的6)中选取20个采集自不同地区的茭白分离菰黑粉菌对筛选得到的snp位点进行验证具体包括：a、将20个采集自不同地区的茭白进行研磨分离；b、提取全部菰黑粉菌基因组dna；c、针对获得的snp数据设计as-pcr引物；d、选取典型具有早晚熟性的单季茭品种的茭白菰黑粉菌dna进行as-pcr验证，验证获得3个具有多态性的snp位点；针对这3个snp位点设计hrm检测扩增引物；e、将20个茭白菰黑粉菌dna用3对hrm引物扩增，pcr产物用于hrm检测；f、用不同颜色的曲线标记单季茭白早晚熟特性。本发明具有以下有益效果：1)本发明以5个具有不同早晚熟特性的单季茭白的基因组重测序数据为基础，扫描得到snp数据，并且通过有效手段筛选得到单季茭白熟性相关联位点。结合20种不同地区不同熟性的单季茭白菰黑粉菌为对象的鉴定结果，筛选出单季茭早晚熟相关的分子标记。2)研究周期短，以各个地区茭白品种为材料，可以排除环境因子对茭白熟性的干扰。3)snp标记基于基因组重测序数据，具有良好的精准度，且位点丰富，信息量大，筛选的位点更具可靠性。4)茭白育种周期长，选育过程繁琐，通过snp标记筛选早熟单季茭，可以对优良茭白品种提早选择，减少工作量，提高筛选效率。附图说明图1为4个典型具有早晚熟性的单季茭菰黑粉菌3对引物as-pcr多态性结果，筛选具有多态性的位点；图2为实施例3中lightscanner高分辨熔解曲线；图3为3个snp位点在20种单季茭白菰黑粉菌中的分布图。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实验方法种如无特殊说明，均为常规方法。实施例种除实验材料以外其他均可通过商业途径购买获得。实施例1：试验材料及熟性分类以下试验材料分别来源于浙江省金华市农业科学研究院、浙江省丽水市缙云县农业局、浙江省宁波市余姚市农业科学研究所、江苏省苏州市农业科学研究院、浙江省嘉兴市桐乡市董家茭白合作社、浙江省绍兴市嵊州市普惠蔬菜合作社、浙江省台州市黄岩区蔬菜研究所、浙江省杭州市中国计量大学生命科学学院。样品采收时间在2016年9月、2017年9月、2018年9月。表1供试样品品种、熟性及来源实施例2：群体分析1)采用ctab法提取菰黑粉菌基因组dna，用核酸微量测定仪测定dna浓度，并用琼脂糖凝胶电泳检测dna质量。用ddh2o稀释至100ng/μl，置于-20℃保存。2)将确定熟性期的5个单季茭茭白品种的dna送去二代重测序。参考基因组为菰黑粉菌mt型基因组，wgsinsdc:jtlw00000000.1。3)测序数据用gatk、samtools、bwa软件比对至参考基因组，获得snp数据文件。共获得21529个snp位点。4)将所有参与snp扫描的菰黑粉菌样品编号为a、b两类，分别代表单季茭早熟，单季茭晚熟两类。通过提取snp扫描结果中的genotype数据，将a、b两类的snp数据输出为snpca/b格式，a代表在第c个snp位点该类snp个数，b代表该类样品总个数。将输出结果一并粘贴至excel工作表中，运用excel筛选功能，筛选出早熟中为b/b，晚熟中为0/b的snp位点。(在本例中，a为10，b为18，c为20，因此选出snpc1＝(a列＝3/3，b列＝0/2)，共计14个snp位点。实施例3：snp位点鉴定1)在14个筛选得到的snp位点选择合适的snp位点验证：由于参考基因组测序质量问题，需排除在参考基因组较为靠后的contig中的snp位点，经过筛选，共挑选3个snp位点作为验证位点，并设计相关引物。2)as-pcr(等位基因特异性pcr)，as-pcr是利用引物3’端碱基错配能使pcr延伸程序中断致使无扩增产物的原理，在检测snp、等位基因基因型方面有重要作用。本例设计了3对as-pcr引物，所有引物已附表2。表2等位基因特异性pcr引物序列表正向引物引物序列(5‘-3‘)反向引物引物序列(5‘-3‘)snpse1-fagtcacatcacatcacactggtccatsnpse1-rtggagactgctggtcaaatgaaattatsnpse2-fgcgacactcacacctccacgtttsnpse2-rgcccctgctcctttcctgaasnpse3-fcatttacccagttttggctatcactctgsnpse3-rtcaaggaaggggaatggttgc3)本例选取4个典型单季茭菰黑粉菌dna作为模板验证上表snp位点的多态性。4)as-pcr体系：1μl菰黑粉菌基因组dna；0.4μm正向引物；0.4μm反向引物；5μl2×taqmasterplusmix；3.2μlddh2o。5)as-pcr程序设置为：94℃预变性5min；94℃变性30s；65℃退火30s；72℃延伸15s；共34个循环；72℃彻底延伸7min；12℃保存。6)将所有pcr产物用2％琼脂糖凝胶电泳，检测条带有无。7)电泳验证结果(如图1所示)：1代表有条带；0代表条带；带*代表该位点在单季茭熟性中具有多态性。8)本例中将3个具有多态性的位点进行进一步的检测，检测方法为hrm曲线(高分辨率熔解曲线)。9)hrm的主要原理是根据dna序列的长度、gc含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。其优势在于成本低廉，单次检测量大，精确度高，检测后的样品可继续用于其他实验，且可以用于区分等位基因纯合子和杂合子。10)本例中针对上述3个snp位点设计3对hrm检测片段扩增引物。所有引物已附表3。表3hrm检测片段扩增引物正向引物引物序列(5‘-3’)反向引物引物序列(5‘-3’)hrmse1-fccaacggtccaatccaacttctghrmse1-rgcacctgtcaagggctgtcahrmse2-factccagcgacactcacacctchrmse2-rgtggcacaccgctagtgatagtchrmse3-faagcctatctggacaccacacttghrmse3-rgcccacactcatctgacactaattg11)本例中使用20种(表1中编号为6-25的茭白品种)具有不同熟性特性的单季茭白菰黑粉菌dna作为模板验证步骤7)中筛选得到的3个多态性snp位点。12)hrm-pcr体系：1μl菰黑粉菌基因组dna；0.6μm正向引物；0.6μm反向引物；7.5μl2×taqmasterplusmix；5.3μlddh2o。13)hrm-pcr程序设置为：94℃预变性5min；94℃变性30s；65℃退火30s；72℃延伸15s；共40个循环；72℃彻底延伸7min；12℃保存。14)向所有pcr产物的孔里加1μl5×evagreen荧光染料，封口1000rpm离心15s，然后加20μl矿物油封闭。15)94℃变性2min，使荧光染料充分结合到dna双链中。16)使用lightscanner高分辨熔解曲线系统检测产物，检测结果如图2所示。17)结果显示，hrmse-1、hrmse-2、对单季茭白熟性特性分型较明显，因此，将hrmse-1、hrmse-2即对应为分子标记uese1、uese2。18)2个snp位点在20种茭白菰黑粉菌中的分布图，如图3所示。序列表<110>中国计量大学<120>一种鉴定单季茭白早晚熟特性的分子标记及其应用、获取方法<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>引物(primer)<400>1ccaacggtccaatccaacttctg23<210>2<211>20<212>dna<213>引物(primer)<400>2gcacctgtcaagggctgtca20<210>3<211>22<212>dna<213>引物(primer)<400>3actccagcgacactcacacctc22<210>4<211>23<212>dna<213>引物(primer)<400>4gtggcacaccgctagtgatagtc23当前第1页12