一种与绵羊饲料转化率相关的分子标记及其应用的制作方法

本发明属于分子标记制备技术领域，具体涉及zeb2基因片段作为影响绵羊饲料转化率的分子标记及其应用。

背景技术：

随着经济的发展，人们对肉类的需求量越来越大，其中，羊肉为需求量比较大的食材之一。据统计，目前全国绵，山羊存栏3亿只左右(赵有璋.国内外养羊业发展趋势、问题和对策.现代畜牧兽医,2015,(09):63-68)，我国人口众多，但牧场有限，多数羊是在舍饲条件下喂养，对粮食依赖性大，如何最大程度的缓解人畜争食的矛盾，提高羊群饲料转化率，已经变得越来越重要。在不影响动物正常生长的前提下降低饲料投入的遗传改良所涉及的指标即畜禽的饲料利用率。动物的饲料利用率指其对所采食饲粮的利用效率，主要受饲粮以及动物两方面因素的影响。饲料效率(feedefficiency，fe)是饲料转化率(feedconversionration，fcr)的简称，也叫饲料报酬，一般情况下饲料转化率是指动物增重1kg所消耗的饲料量，即料重比(feedintake/gain，f/g)，是长期以来人们使用的衡量饲料利用率高低的一项重要经济指标。另外，增重饲料比(gain/feedintake，g/f)都是表示畜禽增重和日粮采食量之间关系的指标(lancasterpa,carstensge,jrcd,etal.phenotypicandgeneticrelationshipsofresidualfeedintakewithperformanceandultrasoundcarcasstraitsinbrangusheifers.journalofanimalscience,2009,87(12):3887-3896)，饲料转化率在国内外被广泛应用，在肉产品生产中用料肉比，而禽蛋生产中则用料蛋比。要改善饲料转化率就要从提高畜禽增重或肉蛋产量和降低饲料消耗两方面入手(aggreyse,karnuahab,sebastianb,etal.geneticpropertiesoffeedefficiencyparametersinmeat-typechickens.geneticsselectionevolution,2010,42(1):1-5.aggreyse,rekayar.dissectionofkoch'sresidualfeedintake:implicationsforselection.poultryscience,2013,92(92):2600-2605)。研究表明饲料转化率的遗传力为0.26～0.41，属中等遗传力性状，受遗传控制且能够通过选择改良(willemsow,millersp,woodbj.assessmentofresidualbodyweightgainandresidualintakeandbodyweightgainasfeedefficiencytraitsintheturkey(meleagrisgallopavo).geneticsselectionevolution,2013,45(1):1-8)。依据科学的数据，对羊群进行选种选配，遗传改良(莫负涛.不同rfi育肥羔羊生产性能和体组成及消化代谢研究.甘肃农业大学,2016)，是可行的方法之一。如何确定科学依据，是我们要解决的难题之一。目前，大多数指标是跟据动物表型进行分析，从基因层面上对绵羊饲料转化率进行的系统分析还很少。

zeb2，(zinc-fingere-boxbindinghomeobox2),又称smad结合蛋白(smad-interactingprotin1，sip1),属于e盒结合锌指蛋白(zincfingere-boxbindingprotein,zeb)家族。zeb2在人类胚胎中枢神经系统以及周围神经系统均有高水平的表达。此外，zeb2也参与了对肿瘤细胞凋亡、细胞周期以及复制衰老等方面的调控(刘晓蕾.zeb2和smad1相互作用对nanog调控作用研究.西北农林科技大学,2014)。zeb2也是一种转录因子，最初研究认为zeb2在于细胞核内，但是随着研究的深入开展，发现zeb2不但在细胞核内，其在细胞的胞浆以及胞核中都有表达，还参与了细胞的炎症反应以及细胞的形成、生长、分化、凋亡、胚胎发育等多种生命活动调控(段训凰.mir-203和zeb2直接相互作用抑制emt信号通路减少肺腺癌化疗耐药.南方医科大学,2016)。martínezr等利用基因芯片研究发现zeb2基因也对牛的体重有影响(martínezr,bejaranod,gómezy,etal.genome-wideassociationstudyforbirth,weaningandyearlingweightincolombianbrahmancattle.genetics&molecularbiology,2017,40(2):453-459.)。zeb2基因更多是在医学癌症，和肿瘤方面研究，在关于动物生长性状方面的研究比较少，绵羊饲料转化率是由微效多基因影响，本发明通过对zeb2基因进行测序和分析，探讨其不同基因型与绵羊饲料转化率的相关性，旨在为绵羊良种选育方面提供参考依据，为我国优良绵羊品种的培育提供基因工程手段。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一种作为与绵羊饲料转化率相关的分子标记及其应用。本发明的分子标记从绵羊zeb2基因中扩增得到，其具体核苷酸序列如seqidno:1所示。通过克隆绵羊zeb2基因的dna序列并测序，寻找zeb2基因的多态性位点，从而可以建立绵羊饲料转化率相关分子标记的检测方法，并可将该分子标记应用于节粮型优质肉羊新品种的培育中。

具体地，本发明的技术方案如下所述：

一方面，本发明提供了一种与绵羊饲料转化率相关的分子标记，该分子标记对通过对绵羊zeb2基因进行扩增而获得，具体的，该分子标记的核苷酸序列如seqidno:1所示，即agcagcaacaacagcaatgaggacgagctcaaggtgggaaaagtaaagaaggggccatacttgatgaggccacacatcttccagtagtttccattccagcaggccacttgctctgtgcggttctgggatcacaaccgggtgtaatgagaagagtcctggactcggttcaggaaactctggcttctggccccccagccctgccatccaatcatagcctggccatggcacatcccctaacctctctggacctcatgtccctagctgtaaaatgtagggattgaatgggggttgcaaactggtggctgacagatgtgtttggtttggctcacagagtatcttaaacacattcgaattggttgccaatattttaaaattgggcagtttcactcgcagagtcagatttcaagcacctctggagagctcggaagatatgacatctctggcctacattgatgcctggaaaggccgtgagagaactcctcctgcttccccttggaaggatagctccccaccacgcctcaccagcttggtctgtgtagatatttggtgtgcgaacctgaccctttccaaaggtctgtcccaccttgaattctactattccacatctgatttgcttcactattcaaaatataccaaatccttagyggtttccacatccatgtgcatgcatgccaagtcacttcagtcctgtctgactctgtgaccctatggactgtagcctactaggctctactgtccatgggtttctccaggcaagaatactagagcgagctgtcatgccctccttcagaggatcttcccaacccaggggctgaaccacagtctcttatgtctcctgcattggcagataggttctttacccctagcgccacctgggaagcccctctccatccacagcagactgctaagttatttgtctgtacgttaagtatcatgtaaaggctgggagtgtgttaggtcaaacaaatcagccccatttgggacaaatgcttatttgaaatctgatgacaaggtgatatttaaggttgccacaggaagggtttggcttctgacagttgtctactcagaaaactgtatgagtttattatagattatcccaaaactgataacttaaaaacccaaagcaaataatataaatcccttcagttaatatagcattttttccatatcgcccactaaactaacatttctaattttctgtttggatgttagatatgtaaactttttctgttcatgtgattgcaagcaaattatgttgactacgttctgtcttcttcaaaggtaaagcagttacatcattctagaagttcagacttttataaagcctgtgtgcgtagtcactcggtcatgtccaactctttgcgaccccatattctgtagcccaccaggctcctctgttcataggattctccaggcaagaatactggagtcggttgtcattc，其中第645位的y表示t或c，由于上述序列在第645位碱基处有一个t/c突变，从而导致了绵羊zeb2基因在该位点的t/c多态性。

第二方面，本发明提供了一种检测上述分子标记的引物对，任何可特异性扩增本发明分子标记或包含上述多态性位点的片段的引物均适用于对该分子标记进行检测，优选地，所述检测分子标记的引物对的核苷酸序列为：

正向引物m-f：agcagcaacaacagcaat(seqidno:2)；

反向引物m-r：gaatgacaaccgactcca(seqidno:3)。

此外，本发明的引物对可以为kaspar引物对，所述kaspar引物对可针对分子标记的正义链进行设计，也可以针对反义链进行设计；在分子标记序列及多态性位点明确的基础上，对具体kaspar引物的可通过常规手段进行设计。

第三方面，本发明提供了一种检测上述分子标记的试剂盒，所述试剂盒中包含了本发明第二方面的引物对；优选地，所述引物对的核苷酸序列如seqidno:2和seqidno:3所示。

进一步的，本发明的试剂盒中包含了bpu10i限制性内切酶。

第四方面，本发明提供了一种检测与绵羊饲料转化率相关的分子标记的方法，所述分子标记的核苷酸序列如seqidno:1所示，所述方法包括利用本发明的引物对或试剂盒对绵羊zeb2基因进行检测，具体的，本发明的检测方法包括如下步骤：

a)利用本发明的引物对、或包含上述引物对的试剂盒，对绵羊基因组dna进行扩增；优选地，所述引物对的核苷酸序列如seqidno:2和seqidno:3所示；

b)对步骤a)获得的扩增产物的多态性位点进行鉴定。

其中，在步骤b)中，任何snp分型方法均可适用于本发明中分子标记的检测，上述snp分型的方法包括但不限于直接测序法、探针法、基因芯片法、高分辨率溶解曲线法、限制性内切酶法。

在本发明的分子标记序列和多态性位点已知的情况下，针对该多态性位点设计相应的探针，以及利用上述snp分型方法对分子标记和多态性位点进行检测均属于本领域中较为常规且成熟的技术，针对该多态性位点设计的探针也可包含于本发明的第三方面的试剂盒中。

更为具体的，本发明中利用上述引物对检测与绵羊饲料转化率相关分子标记的方法，包括如下步骤：

a)以绵羊血液为样品提取基因组dna，利用seqidno:2和seqidno:3所示的引物对绵羊zeb2基因进行pcr扩增；

b)对上述pcr扩增产物进行测序和序列分析，从而通过多态性位点的碱基类型确定基因型。

此外，本发明还涉及利用限制性内切酶检测与绵羊饲料转化率相关分子标记的方法，包括如下步骤：

a)以绵羊血液为样品提取基因组dna，利用seqidno:2和seqidno:3所示的引物对绵羊zeb2基因进行pcr扩增；

b)对上述pcr扩增产物进行测序和序列分析，从而通过多态性位点的碱基类型确定基因型。

bpu10i的识别位点为5＇-cc^▼tnagc-3＇，从而当本发明分子标记中多态性位点为c时，可以被限制性内切酶bpu10i所识别，进而将扩增的pcr产物切割成长度分别为645bp和797bp的两个片段，当分子标记中仅含有多态性位点t时，不能被限制性内切酶bpu10i所识别，扩增的pcr产物为单一的长度为1442bp的条带。

第五方面，本发明提供了上述分子标记、引物对或试剂盒或检测方法在绵羊饲料转化率检测中的应用，通过在待测绵羊中检测本发明的分子标记，并分析多态性位点的类型，从而可以确定绵羊对饲料转化率的高低，进而筛选出高饲料转化率的绵羊。

第六方面，本发明提供了上述分子标记、引物对、试剂盒或检测方法在绵羊育种中的应用，通过利用本发明的引物对或试剂盒对绵羊zeb2基因进行扩增和检测，确定待测样品的基因型，从而可以从中选育出节粮型绵羊品种。

寻找基因的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。本发明通过对绵羊zeb2进行pcr扩增和测序，发现在扩增片段的第645位存在一个t/c多态性位点，并通过检测137只湖羊的多态性和建立的最小二乘模型，确定了一种与绵羊饲料转化率相关的分子标记，该分子标记可以用于节粮型绵羊的选育和节粮型优质肉羊新品种的培育，为绵羊饲料转化率的遗传改良提供了有效的基因工程手段，具有重大的实际应用价值。

本发明通过对分子标记的序列特征进行分析，惊奇的发现可利用限制性内切酶bpu10i结合rflp对不同的基因型进行检测，为本发明的分子标记的检测提供了一种操作简便、成本较低的操作方法。

附图说明

图1.本发明中用于作为分子标记的绵羊zeb2基因扩增片段的凝胶电泳图。其中，1～8泳道：zeb2基因扩增片段；m泳道：dl2000marker。

图2.本发明中绵羊zeb2基因突变位点测序结果。其中，箭头指示的位点为多态性位点。

图3.本发明中绵羊zeb2基因扩增片段bpu10i-rflp的3种基因型和电泳结果。其中，cc表示cc基因型，ct表示ct基因型，tt表示tt基因型，m表示dl2000marker。

具体实施方式

下面结合实施例详细介绍本发明，本发明的优点将会随着描述而更为清楚。应理解，本发明要求保护的范围不受所述具体实施方式的限制，本发明提供的具体实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制，本领域技术人员参照说明书的描述对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，这些无需创造性劳动的改进和替换也应落入本发明所附权利要求书的保护范围之内。

实施例1zeb2基因的扩增

(1)引物设计

以绵羊zeb2基因dna(genbank收录号：nc_019459.2)为模板，利用primer5.0软件设计一对引物m-f和m-r，引物序列如下

zeb2：

m-f：5＇-agcagcaacaacagcaat-3＇(seqidno:2)，

m-r：5＇-gaatgacaaccgactcca-3＇(seqidno:3)。

(2)pcr产物的扩增和测序

以绵羊基因组为模板，采用m-f和m-r引物进行pcr扩增，将纯化后的pcr产物与pmd-18t载体(购自宝生物工程大连有限公司)在4℃水浴过夜连接；无菌状态下取100～120μl感受态细胞于1.5mlependorff管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，后冰浴3～4min，加入400μl无抗生素的lb液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μl涂布于异丙基硫代－β-d－半乳糖苷(iptg)x-gal的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。挑取平板上的单菌落，接种于2-3mllb液体培养基中，37℃300r/min培养过夜。用1.5mlep管12000r/min条件下离心收集菌体，利用收集的菌体提取质粒并通过pcr进行验证，验证后的重组质粒采用双脱氧末端终止法在dna自动测序仪上进行测序，序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成，测序结果显示得到一条长度为1442bp的dna序列，即seqidno:1。

dna序列同源性检索鉴定：

通过美国国家生物技术信息中心(ncbi，nationalcenterforbiotechnologyinformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的blast(basiclocalalignmentsearchtool)软件，将测序后获得的dna序列与genbank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该dna序列的功能信息。检索结果表明所测序列与绵羊zeb2基因dna(genbank收录号：nc_019459.2)的部分序列同源性达99％。

实施例2、pcr-rflp检测方法的建立

(1)pcr扩增和序列分析

以绵羊基因组dna为模板，利用实施例1的引物对扩增绵羊zbe2基因，pcr反应总体积20μl，其中绵羊基因组dna约100ng，含1倍的缓冲液(购自promega公司)，1.5mmol/lmgcl2，dntp终浓度为150μmol/l，引物终浓度为0.4μmol/l，2utaqdna聚合酶(promega)。pcr扩增程序是：94℃3min，94℃30s，62℃30s，然后72℃90s，循环35次，最后72℃延伸5min。pcr反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，得到特异扩增片段(图1)，通过对该扩增片段测序发现，该片段的长度为1442bp，具体核苷酸序列如seqidno:1所示，其中在第645位存在一个t/c多态性位点，通过对该序列进一步分析发现，上述片段的多态性位点处存在一个bpu10i酶切位点(cc^▼tnagc)(图2)，从而可根据rflp对不同的基因型进行检测。

(2)pcr-rflp检测条件

pcr产物酶切反应体积是10μl，其中10×buffer1μl，pcr产物3～5μl，限制性内切酶bpu10i为0.3μl(10u)，用h2o补足10μl，将样品混匀后离心，37℃水浴4h，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。对该位点两个纯合子的酶切结果显示，当第645bp位置是t时，bpu10i酶切后检测结果只有1个片段，长度是1442bp(定为等位基因t)，当第645bp位置是c时，bpu10i酶切之后，产生2个片段，长度分别为797bp和645bp(定为等位基因c)，当该位点为杂合子时，酶切之后可同时产生3个片段，以上三种不同基因型的检测结果如图3所示。

(3)本发明的分子标记在绵羊饲料转化率标记性状关联分析中的应用

试验共检测了137只湖羊的多态性，确定其基因型，并建立如下所述的最小二乘模型，进行基因型与饲料转化率进行关联分析。

yijlk＝μ+genotypei+breedi+sexl+pk+combinationm+εijlkm

其中，yijkl是性状观察值，μ为总体均数，genotypei为基因型效应，breedj为品种效应，sexl为性别效应，pk为批次效应，combinationm为组合的效应，εijlmk为随机误差，假定εijlmk相互独立，服从n(0，σ²)分布。

本发明中，绵羊饲料转化率的测定方法是根据试验羊只的平均日增重与平均日采食量，按照如下公式计算饲料转化率：饲料转化率(feedconversionrate，fcr)＝平均日采食量(kg/d)/平均日增重量(kg/d)(易国强.利用二代测序挖掘鸡拷贝数变异及影响饲料效率的候选基因[d].中国农业大学，2015)。

基因型检测结果表明在137个个体中cc基因型有15个，ct基因型有51个个体，tt基因型有71个个体。基因型与性状关联分析的结果如表1所示，结果表明，c.645c>t突变位点与湖羊饲料转化率显著相关(p<0.05)。其中cc基因型个体的饲料转化率显著高于tt型个体(p<0.05)。tc型个体的饲料转化率低于cc型个体，高于tt型个体，tc型个体与cc型和tt型个体间的差异不显著，随着c等位基因数的增加其个体饲料转化率增大，由此可知c等位基因为优势等位基因。

表1绵羊zeb2基因多态性与饲料转化率关联分析

注：同列数据间角标不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，标相同字母表示差异不显著(p>0.05)。

sequencelisting

<110>甘肃农业大学

<120>一种与绵羊饲料转化率相关的分子标记及其应用

<130>20181215

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1442

<212>dna

<213>绵羊

<223>yistorc

<400>1

agcagcaacaacagcaatgaggacgagctcaaggtgggaaaagtaaagaaggggccatac60

ttgatgaggccacacatcttccagtagtttccattccagcaggccacttgctctgtgcgg120

ttctgggatcacaaccgggtgtaatgagaagagtcctggactcggttcaggaaactctgg180

cttctggccccccagccctgccatccaatcatagcctggccatggcacatcccctaacct240

ctctggacctcatgtccctagctgtaaaatgtagggattgaatgggggttgcaaactggt300

ggctgacagatgtgtttggtttggctcacagagtatcttaaacacattcgaattggttgc360

caatattttaaaattgggcagtttcactcgcagagtcagatttcaagcacctctggagag420

ctcggaagatatgacatctctggcctacattgatgcctggaaaggccgtgagagaactcc480

tcctgcttccccttggaaggatagctccccaccacgcctcaccagcttggtctgtgtaga540

tatttggtgtgcgaacctgaccctttccaaaggtctgtcccaccttgaattctactattc600

cacatctgatttgcttcactattcaaaatataccaaatccttagyggtttccacatccat660

gtgcatgcatgccaagtcacttcagtcctgtctgactctgtgaccctatggactgtagcc720

tactaggctctactgtccatgggtttctccaggcaagaatactagagcgagctgtcatgc780

cctccttcagaggatcttcccaacccaggggctgaaccacagtctcttatgtctcctgca840

ttggcagataggttctttacccctagcgccacctgggaagcccctctccatccacagcag900

actgctaagttatttgtctgtacgttaagtatcatgtaaaggctgggagtgtgttaggtc960

aaacaaatcagccccatttgggacaaatgcttatttgaaatctgatgacaaggtgatatt1020

taaggttgccacaggaagggtttggcttctgacagttgtctactcagaaaactgtatgag1080

tttattatagattatcccaaaactgataacttaaaaacccaaagcaaataatataaatcc1140

cttcagttaatatagcattttttccatatcgcccactaaactaacatttctaattttctg1200

tttggatgttagatatgtaaactttttctgttcatgtgattgcaagcaaattatgttgac1260

tacgttctgtcttcttcaaaggtaaagcagttacatcattctagaagttcagacttttat1320

aaagcctgtgtgcgtagtcactcggtcatgtccaactctttgcgaccccatattctgtag1380

cccaccaggctcctctgttcataggattctccaggcaagaatactggagtcggttgtcat1440

tc1442

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

agcagcaacaacagcaat18

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gaatgacaaccgactcca18