一种与公猪精液量性状关联的分子标记及应用的制作方法

本发明属于猪分子标记筛选技术领域，具体涉及一种与公猪精液量性状关联的分子标记及应用，所述的分子标记涉及公猪精液量相关的snp。本发明所述的分子标记可用于公猪精液性状的标记辅助选择上。

背景技术：

根据《2016-2017中国养猪行业年鉴》统计，虽然国内53.84％的猪场规模小于500头，但依然有30.76％的猪场规模大于1000头。近年来，虽然小型散养户仍是我国生猪行业的主力军，但是规模化养猪是中国养猪业发展大势所趋。

猪人工授精技术的运用和推广，可以减少规模化猪场公猪养殖的数量，对于降低公猪饲养成本，提高经济效益有重要意义。根据相关部门的统计，我国目前有80％-90％的大型养殖户使用人工授精技术(李宝华,姜淑静,任欣欣.猪人工授精技术新进展及其应用[j].农家参谋,2018(15):122.)。随着猪人工授精的广泛应用，猪人工授精站的建立逐渐增多。对于猪人工授精站，其经济效益主要取决于公猪精液品质的好坏(邢明生.猪人工授精站成本与盈亏核算案例分析[j].养殖技术顾问,2012(07):285.)。公猪的常规精液性状包括精液量、精子浓度、精子活力、精子畸形率等，除此之外，还可以将总精子数和有效精子数作为检测公猪精液品质的指标(smitalj,sousalld,mohsena.differencesamongbreedsandmanifestationofheterosisinaiboarspermoutput[j].animalreproductionscience,2004,80(1):121-130.)。精液性状除了影响猪人工授精站的收入，还是导致公猪淘汰的主要原因之一。研究表明因精液品质问题导致公猪淘汰的比例为28.44％，仅次于因肢蹄问题(32.15％)造成的淘汰(王超,魏宏逵,彭健.广西公猪站公猪淘汰原因及在群猪肢蹄病发病规律调查研究[c].中国饲料营养学术研讨会.2014.)。公猪的非正常因素淘汰，降低了公猪生产效率，额外增加了公猪的养殖成本。

研究人员发现，在传统的选择策略中，额外加入对精液性状(精液量、精子浓度、精子活力、精子畸形率)的选择，可以产生更高的经济效益(gonzalez-penad,knoxrv,rodriguez-zassl.contributionofsementraitselection,artificialinseminationtechnique,andsemendosetotheprofitabilityofpigproductionsystems:asimulationstudy[j].theriogenology,2015:s0093691x15004859.)。前人对不同品种公猪的精液性状进行了遗传参数估计，发现公猪精液性状属于中低遗传力，其中精液量的遗传力在0.20左右，属于中等遗传力(wolfj.geneticparametersforsementraitsinaiboarsestimatedfromdataonindividualejaculates[j].reproductionindomesticanimals,2009,44(2):338-344.)。中等遗传力表明，通过对公猪精液性状进行选择改良，可以改良公猪精液品质，降低公猪因非正常因素淘汰的比例，提高猪人工授精站的经济效益。精液由精子和精浆组成，精浆占精液体积的70％～90％，主要由副性腺分泌，精浆中富含果糖、蛋白质、无机盐等物质，是维持精子活动所需能量的物质基础，因此，精液量是反应副性腺分泌功能是否正常的指标之一。

risch在1996年首次提出全基因组关联分析(gwas)的概念，认为相比连锁分析，全基因组关联分析在复杂性状的遗传学研究中具有更好的效果、更高的统计效力(rischn,merikangask.thefutureofgeneticstudiesofcomplexhumandiseases.[j].science,1996,273(3):350-354.)。全基因组关联分析通过对全基因组范围内的遗传标记和性状表型进行统计分析，鉴定出重要的遗传标记，目前已广泛应用于猪重要经济性状的分子标记辅助选择上(尹建良,赵姣姣,陈赛.猪全基因组关联分析研究进展及展望[j].中国猪业,2017,12(10):32-36.)。全基因关联分析已成为研究复杂数量性状遗传机制的有效工具。

目前，关于全基因组关联分析(gwas)在公猪精液性状上的应用报道极少，为了更好的了解公猪精液性状的遗传机制，筛选出与公猪精液量显著相关联的snp分子标记，本发明使用mvp软件中的farmcpu模型进行全基因组关联分析(liux,huangm,fanb,etal.iterativeusageoffixedandrandomeffectmodelsforpowerfulandefficientgenome-wideassociationstudies[j].plosgenetics,2016,12(2):e1005767.)，为公猪精液性状dna标记辅助选择和全基因组选择的开展提供了新的分子标记基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，筛选一种与公猪精液量性状关联的snp分子标记，利用50k基因芯片对snp进行分型，并使用全基因组关联分析(gwas)筛选与公猪(例如杜洛克)精液量显著相关的snp，为猪的遗传育种提供了新的分子标记资源和标记辅助选择方法。

本发明的技术方案如下所述：

申请人通过基因分型技术并参阅ensembl数据库，得到登陆号为wu_10.2_13_11960687基因片段snp的上下游100bp的序列，其核苷酸序列具体如下所述(即序列表seqidno:1所示的核苷酸序列)。：

tggaaaatcttcctcactctgcccttggggtcagtgaagatgtagggcaaaagccaccttggggtcatcacgctggacaccccagaaatgcagcccagtgy(c/t)atctgtgtgagctgttatttcctgggacactctctccattccccaacccatgcttcattcttagcctcttatccacagggaacagcctcggcttttggct，

上述序列的第101碱基处的y为一个等位基因突变(c101-t101),该突变使上述序列即seqidno：1所述的核苷酸序列产生多态性。该分子标记可以作为检测与猪精液量性状相关的分子标记，且当seqidno：1上的第101位核苷酸为t时，判定公猪具有更多的精液量。

上述序列可以作为检测与公猪精液性状相关的分子标记。

申请人提供了一种筛选公猪精液量性状相关snp分子标记的方法，所述的方法包括如下步骤：

①提取杜洛克公猪精子总dna，并对dna进行质量检测；

②利用基因芯片技术进行基因型分型；

③公猪精液性状属于重复测量性状，需要利用混合线性模型(mlm)，采用公猪站、年份和月份的联合效应作固定效应，日龄、采精间隔作协变量，个体作随机效应，计算个体随机效应，作为构建新表型(pseudo-phenotypes)用于后续gwas分析；

④基于多标记关联模型的方法，采用控制群体遗传背景的主成分作为协变量，利用r统计环境下mvp软件包中的farmcpu模型进行全基因组关联分析(gwas)；

⑤对farmcpu模型筛选出来的显著snp位点与杜洛克公猪精液量进行关联分析。

本发明筛选的分子标记可用于非诊断目的的公猪相关基因或基因型与公猪精液量的关联分析中，该新的分子标记可用于杜洛克公猪精液量性状的标记辅助选择上。

与现有技术相比本发明具有的有益效果：

本发明可通过在体外采用基因芯片技术检测猪的基因型，作为非诊断目的的评价猪的精液质量，与目前的pcr-rflp等方法相比，本发明具有方法简单、快捷、灵敏度高和特异性好等突出优点。

更详细的技术方案请参见说明书的《附图说明》及《具体实施方式》中的实施例。

附图说明

图1：本发明的总体技术流程示意图。

图2：是本发明克隆的登陆号为wu_10.2_13_11960687基因片段snp的上下游100bp核苷酸序列和本发明的分子标记的核苷酸序列。附图标记说明：在图2显示核苷酸序列的第101位碱基处存在一个c/t等位基因突变(101bp处的英文字母“y”为突变位点)。

图3：是本发明制作的曼哈顿图。附图标记说明：研究标的是杜洛克公猪精液量性状，黑色圆圈及箭头指向标记的为本发明筛选的分子标记，该分子标记位于猪第13号染色体上。

具体实施方式

对序列表的说明：

序列表seqidno:1是本发明克隆和筛选的与公猪精液量性状关联的分子标记的核苷酸序列，序列长度为201bp，在序列的第101bp处存在一个等位基因突变(c/t)，该突变导致seqidno:1所示的核苷酸序列产生多态性。

本发明中的序列和全基因组关联分析结果，是基于猪基因组11.2版本。

实施例1：基因分型检测

(1)利用常规磁珠法精子基因组提取试剂盒(武汉纳磁生物科技有限公司)自动提取杜洛克公猪精子总dna，具体步骤为：

(1)取适量杜洛克公猪的精液(5～15μl)至1.5ml离心管中；

(2)向离心管中加入500μl裂解液(上述试剂盒自带)和5μl蛋白酶k(20mg/ml)，振荡混匀30秒后，置于65℃烘箱或金属浴中，裂解30min～1h；

(3)裂解完成后，取全部上清转移至深孔板(标记为①号)，并向每个样孔中加入350μl异丙醇；

(4)将①号深孔板，置于核酸提取仪工位1上，将装有磁珠、洗涤液①、洗涤液②和③以及洗脱液的深孔板分别置于工位2～6上。打开仪器电源，待仪器完成自检后，按表1所示，设置仪器参数。

表1核酸提取仪预设的工作参数

(5)运行预设的程序，待程序运行结束后，核酸提取仪会自动停止，并且工位6会进入4℃保存程序，对样品进行暂时保存；

(6)dna样品可以直接用于下游试验，或封装后4℃短暂保存数日。若要长时间保存dna样品，可以封装或转移至新的容器中，并置于-20℃冰箱中长期保存。

(2)snp基因型的判定及质量控制

使用geneseekporcine50ksnp芯片进行分型，用plinkv1.9对获得的基因型数据进行质量控制，剔除检出率<90％、次等位基因频率(minorallelefrequency,maf)<0.05、偏离哈代温伯格(hardy-weinbergequilibrium,hwe)<10^-7的snp标记和检出率<90％的个体，最终有1440个个体和35813个snp用于全基因组关联分析(gwas)研究。

实施例2：wu_10.2_13_11960687分子标记分型方法在杜洛克公猪精液量性状关联分析中的应用

(1)杜洛克公猪精液性状表型预处理

公猪精液性状属于重复测量性状，需要利用混合线性模型(mlm)，采用公猪站、年份和月份的联合效应作固定效应，日龄、采精间隔作协变量，个体作随机效应，计算个体随机效应，作为新构建表型(pseudo-phenotypes)用于后续gwas分析。利用r统计环境下lme4包进行分析，数据包含2020个个体，105201次采精记录。具体模型如下：

其中，yijklm是第l个个体第m次的精液性状(精液量)原始表型值；μ是群体均值；hymi是公猪站、年份和月份联合效应(固定效应)；agej、是日龄效应及其平方项(协变量)、intk、是采精间隔效应及其平方项(协变量)，b1、b2是日龄效应协变量对应的回归系数，b3、b4是采精间隔效应协变量对应的回归系数；idl是个体效应(随机效应)，假定服从正态分布：表示个体效应方差；εijklm是模型残差效应，假定服从正态分布：表示残差方差，i为相应的单位关联矩阵。

(2)杜洛克公猪精液量全基因组关联分析

用于基因型与精液性状关联分析所用的试验猪群是纯种杜洛克公猪(为常规品种，包括3个品系：丹系、美系和华系杜洛克)。基因分型所用的dna由纯种杜洛克公猪(说明书正文和表中所称的“杜洛克公猪”简称“猪”)精子中提取。基于多标记关联模型的方法，采用控制群体遗传背景的主成分作为协变量，利用r统计环境下mvp软件包中的farmcpu模型进行gwas分析。具体的模型如下：

yijk＝b1×pc1+b2×pc2+b3×pc3+mi+sj+εijk

其中，yijk是性状根据混合线性模型计算出的第k个个体随机效应值(pseudo-phenotypes)；pc1、pc2、pc3是控制群体遗传背景的前三大主成分效应；b1、b2、b3是对应的回归系数；mi是i个pseudoqtns的基因型效应；sj是第j个标记效应；εijk是残差效应，假定服从正态分布：表示残差方差，i为单位关联矩阵。

(3)wu_10.2_13_11960687分子标记分型结果与精液量关联分析使用混合线性模型(mlm)进行wu_10.2_13_11960687分子标记与精液量的关联分析。具体模型如下：

其中，yijklmno是第j种品系、第n个个体、第o次的精液性状(精液量)原始表型值；μ是群体均值；gi是基因型效应、bj是品系效应、hymk公猪站、年份和月份联合效应(固定效应)；agel、是日龄效应及其平方项(协变量)，intm、是采精间隔效应及其平方项(协变量)，b1、b2是日龄效应协变量对应的回归系数，b3、b4是采精间隔效应协变量对应的回归系数；idn是个体效应(随机效应)，假定服从正态分布：表示个体效应方差；εijklmno是模型残差效应，服从正态分布：表示残差方差，i为相应的单位关联矩阵。关联分析结果用最小二乘均数±标准误表示。关联分析结果见表2。

由表1可知，对于精液量性状，基因型为tt的个体精液量极显著高于cc基因型个体，基因型为tt的个体精液量极显著高于ct基因型个体，基因型为ct的个体精液量与cc基因型个体无显著差异。

表2wu_10.2_13_11960687的多态性以及不同基因型对猪精液量的影响

表1说明：p<0.05为差异显著；p<0.01为差异极显著。

综上所述，t是有利于精液量的等位基因。

主要参考文献：

[1]尹建良,赵姣姣,陈赛.猪全基因组关联分析研究进展及展望[j].中国猪业,2017,12(10):32-36.

[2]邢明生.猪人工授精站成本与盈亏核算案例分析[j].养殖技术顾问,2012(07):285.

[3]王超,魏宏逵,彭健.广西公猪站公猪淘汰原因及在群猪肢蹄病发病规律调查研究[c].中国饲料营养学术研讨会.2014.

[4]李宝华,姜淑静,任欣欣.猪人工授精技术新进展及其应用[j].农家参谋,2018(15):122.

[5]wolfj.geneticparametersforsementraitsinaiboarsestimatedfromdataonindividualejaculates[j].reproductionindomesticanimals,2009,44(2):338-344.

[6]smitalj,sousalld,mohsena.differencesamongbreedsandmanifestationofheterosisinaiboarspermoutput[j].animalreproductionscience,2004,80(1):121-130.

[7]rischn,merikangask.thefutureofgeneticstudiesofcomplexhumandiseases.[j].science,1996,273(3):350-354.

[8]liux,huangm,fanb,etal.iterativeusageoffixedandrandomeffectmodelsforpowerfulandefficientgenome-wideassociationstudies[j].plosgenetics,2016,12(2):e1005767.

[9]gonzalez-penad,knoxrv,rodriguez-zassl.contributionofsementraitselection,artificialinseminationtechnique,andsemendosetotheprofitabilityofpigproductionsystems:asimulationstudy[j].theriogenology,2015:s0093691x15004859。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种与公猪精液量性状关联的分子标记及应用

<141>2019-01-15

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>201

<212>dna

<213>猪(susscrofa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(201)

<220>

<221>mutation

<222>(101)..(101)

<400>1

tggaaaatcttcctcactctgcccttggggtcagtgaagatgtagggcaaaagccacctt60

ggggtcatcacgctggacaccccagaaatgcagcccagtgtatctgtgtgagctgttatt120

tcctgggacactctctccattccccaacccatgcttcattcttagcctcttatccacagg180

gaacagcctcggcttttggct201