一种用于无创检测待测胎儿染色体是否为非整倍体的试剂盒及其专用探针组的制作方法

文档序号:17290773发布日期:2019-04-03 03:56阅读:141来源:国知局
本发明属于医学领域,具体涉及一种用于无创检测待测胎儿染色体是否为非整倍体的试剂盒及其专用探针组,尤其涉及一种用于检测待测胎儿13号染色体、18号染色体、21号染色体和性染色体是否为非整倍体的试剂盒及其专用探针组。
背景技术
::出生缺陷是危害人类疾健康的三大疾病之一。据世界卫生组织的最新数据,全球的出生缺陷发生率约为3%-6%,每年就有近800万的先天缺陷的新生儿。染色体异常是造成大量先天缺陷的主要原因。最常见的染色体异常疾病一般表现为染色体dna重复和缺失,以及染色体非整倍性,后者指的是完整的染色体的异常存在或缺失。当生物体具有少于或多于正常二倍体的染色体数量时,就会产生大量异常特征并引起多种综合征。唐氏综合征,亦称21-三体综合征,是染色体非整倍性最常见的例子,包括一条额外的21号染色体。其它常见的染色体非整倍性有13-三体综合征、18-三体综合征、特纳综合征和克兰费尔特综合征。产前诊断染色体非整倍体一般采用血清学生化筛查和绒毛采集、羊水穿刺、脐血穿刺等侵入性诊断方法。羊水穿刺是诊断的金标准,但创伤性强,且伴有流产风险。血清学筛查尽管是无创型,但检出率和假阳性率均较低。1997年,卢煜明教授首次发现了胎儿游离dna(cfdna),但是当时的技术很难对数量庞大的cfdna进行有效检测。直到2007年,第二代测序技术(ngs)出现,研究人员才找到了一个“称手”的研究工具。同时,科学家很快意识到,第二代测序技术的高通量特性也非常适合开展无创产前基因检测。直接对全基因组测序存在成本高、数据分析复杂、周期长等问题。目标序列捕获测序降低了测序成本,提高了测序深度,能够更为精确地发现待定区域序列改变的信息。nipt(无创产前筛查)作为产前检测领域出现的一种新型胎儿染色体疾病检测技术,相对传统的绒毛取样或羊膜腔穿刺等具有“侵入性”的产前检测方法而言,其通过高通量测序技术对母亲外周血中的胎儿游离dna进行“非侵入性”产前检测,更加安全、快捷、准确,有效补充了现有的产前筛查、产前诊断体系。技术实现要素:本发明的目的是检测待测胎儿染色体是否为非整倍体,从而产前诊断胎儿是否患有相应的染色体非整倍体疾病。本发明首先保护一种用于检测待测胎儿13号染色体、18号染色体、21号染色体和性染色体是否为非整倍体的试剂盒,可包括探针组;所述探针组可包括500个特异探针;每个特异探针可包括dna片段2;所述dna片段2可为13号染色体的核苷酸序列、18号染色体的核苷酸序列、21号染色体的核苷酸序列、x染色体的核苷酸序列或y染色体的核苷酸序列中的一部分。上述试剂盒中,所述dna片段2可为60-140个(如60-78个、78-100个、100-140个、60个、78个、100个或140个)核苷酸组成的单链dna分子。上述试剂盒中,所述500个特异探针的dna片段2的核苷酸序列依次可如序列表的序列1自5’末端起第16-93位至序列表的序列500自5’末端起第16-93位所示。上述试剂盒中,每个特异探针还可包括dna片段1和dna片段3;所述dna片段1位于所述dna片段2的5’端;所述dna片段3位于所述dna片段2的3’端。所述dna片段1和所述dna片段3均可为10-20个(如10-15个、15-20个、10个、15个或20个)核苷酸组成的单链dna分子。每个特异探针从5’末端到3’末端依次可包括所述dna片段1、所述dna片段2和所述dna片段3。上述任一所述探针组具体可由500个特异探针组成。每个特异探针从5’末端到3’末端具体可由所述dna片段1、所述dna片段2和所述dna片段3组成。上述任一所述试剂盒还可包括引物对甲;所述引物对甲可由引物1和引物2组成;所述引物1可包括所述dna片段1;所述引物2可包括所述dna片段3。所述引物1具体可为所述dna片段1。所述引物2具体可为所述dna片段3。所述引物1和/或所述引物2均可具有生物素标记。上述任一所述dna片段1和/或上述任一所述dna片段3具有生物素标记(即在试剂盒中不含有引物对甲的条件下,可直接对所述dna片段1和/或所述dna片段3进行生物素标记)。上述任一所述dna片段1的核苷酸序列可如序列表的序列501所示。上述任一所述dna片段3的核苷酸序列可如序列表的序列502所示。上述任一所述500个特异探针的核苷酸序列依次可如序列表的序列1至序列表的序列500所示。上述任一所述试剂盒具体可由所述探针组组成。上述任一所述试剂盒具体可由所述探针组和所述引物对甲组成。上述任一所述试剂盒还可包括接头1(用于制备待测孕妇血浆游离dna文库)、接头2(用于制备待测孕妇血浆游离dna文库)、引物3(用于封闭所述接头1)、引物4(用于封闭所述接头2)、引物5(用于pcr扩增)和引物6(用于pcr扩增);所述接头1从5’末端到3’末端依次可包括dna片段a(即测序接头序列1)、dna片段b和dna片段c;所述dna片段c的3’末端可为t;所述接头2从5’末端到3’末端依次可包括dna片段d和dna片段e;所述dna片段b和所述dna片段d均可由a、t、c和g随机组成;所述dna片段e的5’末端和所述dna片段a的3’末端反向互补;所述引物5可包括所述dna片段a;所述引物3从5’末端到3’末端依次可包括所述dna片段a、dna片段b和dna片段c;所述dna片段c和所述dna片段a的5’末端完全一致;所述dna片段b可由a、t、c和g随机组成;所述引物6可包括所述dna片段d;所述引物4从5’末端到3’末端依次可包括所述dna片段d、dna片段e和dna片段f;所述dna片段f和所述dna片段e的3’末端完全一致;所述dna片段e可由a、t、c和g随机组成。所述dna片段b和所述dna片段d可以相同,也可以不同。所述dna片段c的长度具体可为1bp。所述dna片段b和所述dna片段d的长度为6-14bp(如6-8bp、8-14bp、6bp、8bp或14bp)。所述dna片段a的长度为17-25bp(如17-21bp、21-25bp、17bp、21bp或25bp)。所述dna片段b的长度为1-8bp(如1-4bp、4-8bp、1bp、4bp或8bp)。所述dna片段d的长度为17-25bp(如17-21bp、21-25bp、17bp、21bp或25bp)。所述dna片段e的长度为10-25bp(如10-16bp、16-25bp、10bp、16bp或25bp)。所述引物4还可包括barcode标记序列;所述barcode标记序列位于所述dna片段e的上游、下游或中间(在本发明的一个实施例中,barcode标记序列位于所述dna片段e的中间)。所述barcode标记序列的长度为6-14bp(如6-8bp、8-14bp、6bp、8bp或14bp)。所述barcode标记序列可由a、t、c和g随机组成,用于测序数据处理时区分不同的待测样本。所述接头1、所述引物5和所述引物6的3’末端均可进行硫代修饰。所述接头2的5’末端可进行磷酸化修饰。所述接头1从5’末端到3’末端具体可由dna片段a(测序接头序列1)、dna片段b和dna片段c组成。在本发明的实施例中,采用illumina平台进行测序。相应的,dna片段a(测序接头序列1)的核苷酸序列(从5’至3’)可为acactctttccctacacgacgctcttccgatct。根据测序平台的不同,也可以替换成由其它核苷酸序列组成的测序接头序列。所述接头1的核苷酸序列(从5’至3’)具体可如序列表中序列507所示。所述接头2从5’末端到3’末端具体可由dna片段d和dna片段e组成。在本发明的实施例中,采用illumina平台进行测序。相应的,所述dna片段e(测序接头序列2)的核苷酸序列(从5’至3’)可为agatcggaagagcacacgtct。根据测序平台的不同,也可以替换成由其它核苷酸序列组成的测序接头序列。所述接头2的核苷酸序列(从5’至3’)具体可如序列表中序列508所示。所述引物3从5’末端到3’末端具体可由所述dna片段a、所述dna片段b和所述dna片段c组成。所述引物3的核苷酸序列(从5’至3’)具体可如序列表中序列503所示。所述引物4从5’末端到3’末端具体可由所述dna片段d、所述dna片段e(含所述barcode标记序列)和所述dna片段f组成。所述引物4的核苷酸序列(从5’至3’)具体可如序列表中序列504所示。所述引物5具体可由所述dna片段a组成。所述引物5的核苷酸序列(从5’至3’)具体可如序列表中序列505所示。所述引物6具体可由所述dna片段d组成。所述引物5的核苷酸序列(从5’至3’)具体可如序列表中序列506所示。上述任一所述试剂盒具体可由所述探针组、所述接头1、所述接头2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6组成。上述任一所述试剂盒具体可由所述探针组、所述引物对甲、所述接头1、所述接头2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6组成。上述任一所述试剂盒还可包括记载有判断标准甲和判断标准乙的载体。所述判断标准甲即判断待测孕妇胎儿的目标常染色体数目是增加、减少还是正常;所述目标常染色体可为13号染色体、18号染色体或21号染色体。所述判断标准甲可如下:先按照公式(1)计算待测孕妇目标常染色体z-score;chrnz-score:待测孕妇目标常染色体z-score;%chrnsample:待测孕妇目标常染色体捕获区域的reads比例;meanchrnreference:参考数据库中目标常染色体捕获区域reads比例的平均值;s.d.%chrnreference:参考数据库中目标常染色体捕获区域reads比例的标准方差;然后进行如下判断:如果待测孕妇的目标常染色体z-score≥3,则待测孕妇胎儿的目标常染色体数目增加;如果-3<待测孕妇的目标常染色体z-score<3,则待测孕妇胎儿的目标常染色体数目正常;如果待测孕妇的目标染色体z-score≤-3,则待测孕妇胎儿的目标常染色体数目减少;如果目标常染色体数目增加或目标常染色体数目减少,则胎儿目标常染色体为非整倍体(例如,第13号染色体数目增加会造成13-三体综合征,第18号染色体数目增加会造成18-三体综合征,第21号染色体数目增加会造成21-三体综合征(即唐氏综合征));如果目标常染色体数目正常,则胎儿目标常染色体为整倍体。胎儿目标常染色体为非整倍体,即患有目标常染色体非整倍体疾病。所述判断标准乙即判断待测孕妇胎儿的性染色体数目是增加、减少还是正常。所述判断标准乙可如下:(1)先根据待测孕妇y染色体捕获区域的reads比例判断胎儿性别:若待测孕妇y染色体捕获区域reads比例>0.001,则胎儿性别为男性;若待测孕妇y染色体捕获区域reads比例≤0.001,则胎儿性别为女性。(2)如果胎儿为女性,先按照公式(2)计算待测孕妇的x染色体z-score;chrxz-score:待测孕妇x染色体z-score;%chrnsample:待测孕妇x染色体捕获区域的reads比例;meanchrnreference:女胎儿数据库中x染色体捕获区域reads比例的平均值;s.d.%chrnreference:女胎儿数据库中x染色体捕获区域reads比例的标准方差;然后进行如下判断:如果待测孕妇的x染色体z-score≥3,则待测孕妇胎儿的x染色体数目增加;如果-3<待测孕妇的x染色体z-score<3,则待测孕妇胎儿的x染色体数目正常;如果待测孕妇的x染色体z-score≤-3,则待测孕妇胎儿的x染色体数目减少;胎儿性别为女性时,如果x染色体数目增加或x染色体数目减少,则胎儿x染色体为非整倍体(例如,x染色体数目增加会造成超雌综合症;x染色体数目减少会造成特纳综合征);如果x染色体数目正常,则胎儿x染色体为整倍体。胎儿性别为女性时,胎儿x染色体为非整倍体,即患有x染色体非整倍体疾病。(3)如果胎儿为男性,首先按照如下步骤(a)-(c)获得待测孕妇的x染色体z-score:(a)按照公式(3)计算正常男性数据库x染色体与y染色体比值均值:c:正常男性数据库x染色体与y染色体比值均值(在本发明的一个实施例中,经计算,正常男性数据库x染色体与y染色体比值均值为2.817);%chrxmdb:正常男性数据库中x染色体捕获区域reads比例的平均值;%chrymdb:正常男性数据库中y染色体捕获区域reads比例的平均值。(b)按照公式(4)计算经转换后待测孕妇x染色体捕获区域的reads比例:%chrx为经转换后待测孕妇x染色体捕获区域的reads比例;%chrxsample为待测孕妇x染色体捕获区域的reads比例;c为正常男性数据库x染色体与y染色体比值均值;%chrysample为待测孕妇y染色体捕获区域的reads比例;(c)按照公式(5)计算待测孕妇x染色体z-score:chrxz-score:待测孕妇x染色体z-score;%chrx:经转换后待测孕妇x染色体捕获区域的reads比例;meanchrxreference:女胎儿数据库中x染色体捕获区域reads比例的平均值;s.d.%chrxreference:女胎儿数据库中x染色体捕获区域reads比例的标准方差;然后进行如下判断:如果待测孕妇的x染色体z-score≥3且待测孕妇y染色体捕获区域reads比例<正常孕妇中分娩出男胎儿的y染色体捕获区域reads比例的平均值,则待测孕妇胎儿的x染色体数目增加、y染色体数目正常;如果待测孕妇的x染色体z-score≥3且待测孕妇y染色体捕获区域reads比例≥正常孕妇中分娩出男胎儿的y染色体捕获区域reads比例的平均值,则待测孕妇胎儿的y染色体数目增加、x染色体数目正常;如果-3<待测孕妇的x染色体z-score<3,则待测孕妇胎儿的x染色体和y染色体数目均正常;如果待测孕妇的x染色体z-score≤-3,则待测孕妇胎儿的x染色体数目减少,y染色体数目正常(该情况一般不会出现,因为男性没有x染色体则无法存活);胎儿性别为男性时,如果x染色体数目增加或x染色体数目减少(x染色体数目减少的情况一般不会出现,因为男性没有x染色体则无法存活)、y染色体数目正常,则胎儿x染色体为非整倍体(例如:x染色体数目增加会造成克兰费尔特综合征);如果y染色体数目增加、x染色体数目正常,则胎儿y染色体为非整倍体(例如:y染色体数目增加会造成超雄综合征);如果x染色体和y染色体数目均正常,则胎儿x染色体和y染色体均为整倍体;所述参考数据库可由m名分娩健康胎儿的健康孕妇的数据和n名健康男性的数据共同组成;m和n均为50以上的自然数;所述正常男性数据库可由h名健康男性的数据组成;h可为30以上的自然数;所述女胎儿数据库可由r名分娩出女胎儿的健康孕妇的数据组成;r可为30以上的自然数;待测者可为分娩健康胎儿的健康孕妇、健康男性或分娩出女胎儿的健康孕妇;获得待测者的数据的步骤可如下:(k1)制备待测者血浆游离dna文库;制备待测者血浆游离dna文库的接头可为所述接头1和所述接头2;(k2)完成步骤(k1)后,将所述待测者血浆游离dna文库与所述探针组进行杂交,得到杂交产物;(k3)完成步骤(k2)后,从所述杂交产物中收集靶序列,获得靶序列捕获文库;(k4)将步骤(k3)得到的靶序列捕获文库进行高通量测序,得到测序原始数据;(k5)将步骤(k4)得到的测序原始数据切除接头序列、低质量碱基,过滤(如过滤长度小于40bp序列),然后比对到参考基因组hg19的相应位置;(k6)完成步骤(k5)后,去除由于pcr扩增偏好引起的重复序列,得到该待测者的数据。胎儿性别为男性时,胎儿x染色体为非整倍体、y染色体为整倍体,即患有x染色体非整倍体疾病;胎儿y染色体为非整倍体、x染色体为整倍体,即患有y染色体非整倍体疾病。在本发明的一个实施例中,上述任一所述参考数据库具体可由400名分娩健康胎儿的健康孕妇的数据和50名健康男性的数据共同组成。上述任一所述正常男性数据库可由50名健康男性的数据组成。上述任一所述女胎儿数据库可由400名分娩健康胎儿的健康孕妇中分娩出女胎儿的孕妇的数据组成。在本发明的一个实施例中,400名正常孕妇(即400名分娩健康胎儿的健康孕妇)中分娩出男胎儿的y染色体捕获区域reads比例的平均值为0.00345。上述任一所述试剂盒具体可由所述探针组、所述接头1、所述接头2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6和所述记载有判断标准甲和判断标准乙的载体组成。上述任一所述试剂盒具体可由所述探针组、所述引物对甲、所述接头1、所述接头2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6和所述记载有判断标准甲和判断标准乙的载体组成。上述任一所述试剂盒还可包括进行pcr扩增的常规试剂。上述任一所述试剂盒还可包括dna文库与探针进行杂交的常规试剂。本发明还保护一种检测待测胎儿染色体是否为非整倍体的方法,依次可包括如下步骤:(1)制备待测孕妇血浆游离dna文库;(2)完成步骤(1)后,将所述待测孕妇血浆游离dna文库与上述任一探针组进行杂交,得到杂交产物;(3)完成步骤(2)后,从所述杂交产物中收集靶序列,获得靶序列捕获文库;(4)完成步骤(3)后,将所述靶序列捕获文库进行测序,根据测序数据判断待测胎儿的13号染色体、18号染色体、21号染色体和性染色体是否为非整倍体。所述步骤(1)中,制备待测孕妇血浆游离dna文库的接头可为上述任一所述接头1和所述接头2。所述制备待测孕妇血浆游离dna文库的步骤具体可为:首先提取待测孕妇血浆游离dna,然后利用kapahyper文库构建试剂盒制备待测孕妇血浆游离dna文库(接头可为上述任一所述接头1和所述接头2)。所述kapahyper文库构建试剂盒具体可为kapabiosystems公司的产品,货号为kk8504。所述步骤(2)中,“将待测孕妇血浆游离dna文库与所述探针组进行杂交,得到杂交产物”的步骤可如下:(2-1)配制富集体系;所述富集体系包括所述待测孕妇血浆游离dna文库、所述探针组、所述引物3和所述引物4;(2-2)取所述富集体系,60-70℃(如60-65℃、65-70℃、60℃、65℃或70℃)杂交富集16h以上(如16h),得到杂交产物。所述步骤(2-1)中,所述富集体系可由待测孕妇血浆游离dna文库、人cot-1dna、鲑鱼精dna、所述引物3、所述引物4、探针组和杂交缓冲液(65℃预热)组成。所述步骤(2-1)中,100μl所述富集体系具体可由48μl待测孕妇血浆游离dna文库(含1μg待测孕妇血浆游离dna)、12μl富集缓冲液、5μl探针组和35μl杂交缓冲液(65℃预热)组成。所述富集缓冲液可由3.5体积份人cot-1dna水溶液、3.5体积份鲑鱼精dna水溶液和3体积份引物混合液(由引物3、引物4和水组成)组成。富集缓冲液中,人cot-1dna的浓度可为30%-45%(如30%-35%、35%-45%、30%、35%、40%或45%)(v/v),鲑鱼精dna的浓度可为5%-25%(如5%-15%、15%-25%、5%、10%、15%、20%或25%),引物3的浓度可为0.2-1nmol/μl(如0.2-0.5nmol/μl、0.5-1nmol/μl、0.2nmol/μl、0.3nmol/μl、0.5nmol/μl、0.6nmol/μl或1nmol/μl),引物4的浓度可为0.2-1nmol/μl(如0.2-0.5nmol/μl、0.5-1nmol/μl、0.2nmol/μl、0.3nmol/μl、0.5nmol/μl、0.6nmol/μl或1nmol/μl)。所述杂交缓冲液可为含1.0-1.5m(如1.0-1.25m、1.25-1.5m、1m、1.25m或1.5m)nacl、0.1-0.3m(如0.1-0.15m、0.15-0.3m、0.1m、0.125m、0.15m、0.2m或0.3m)柠檬酸钠、0.08-0.12g/100ml(如0.08-0.10g/100ml、0.10-0.12g/100ml、0.08g/100ml、0.10g/100ml或0.12g/100ml)bsa和5-9%(如5-7%、7-9%、5%、6%、7%、8%或9%)(v/v)tween20的水溶液。所述步骤(2-2)中,所述杂交可在pcr仪进行。反应程序可为:95℃7min,65℃16h以上。所述步骤(3)中,“从杂交产物中收集靶序列,获得靶序列捕获文库”的步骤可如下:(3-a)用磁珠收集所述杂交产物;(3-b)以步骤(3-a)收集的产物为模板,采用所述引物5和所述引物6组成的引物对进行pcr扩增,pcr扩增产物即为靶序列捕获文库。所述步骤(3-a)具体可包括下述步骤(3-1)、步骤(3-2)、步骤(3-3)和步骤(3-4)。所述步骤(3-b)具体可包括下述步骤(3-5)、步骤(3-6)和步骤(3-7)。所述步骤(3)中,“从杂交产物中收集靶序列,获得靶序列捕获文库”的步骤具体可如下:(3-1)制备链霉亲和素包被磁珠的溶液;(3-2)取离心管,加入所述链霉亲和素包被磁珠的溶液和所述杂交产物,孵育;然后置于磁力架或离心,弃上清;(3-3)完成步骤(3-2)后,取所述离心管,加入漂洗缓冲液,洗涤;(3-4)完成步骤(3-3)后,取所述离心管,重悬磁珠;然后置于磁力架或离心,收集上清;(3-5)配制pcr扩增体系;pcr扩增体系包括步骤(3-4)收集的上清、权利要求7至10中所述引物5和所述引物6;(3-6)取所述pcr扩增体系,进行pcr扩增,得到pcr扩增产物;(3-7)取所述pcr扩增产物,纯化,得到靶序列,即靶序列捕获文库。所述步骤(3-2)中,所述孵育可为室温孵育0.5-2h(如0.5-1h、1-2h、0.5h、1h或2h)。置于磁力架具体可为置于磁力架1min。所述步骤(3-3)中,所述“加入漂洗缓冲液,洗涤”可分为两步进行:第一步加入漂洗缓冲液1洗涤;第二步加入漂洗缓冲液2洗涤。目的为将没有与链霉亲和素磁珠结合的特异探针洗掉。所述漂洗缓冲液1可为含0.05-0.2%(m/v)sds的柠檬酸钠缓冲液(如含0.05-0.1%(m/v)sds的柠檬酸钠缓冲液、含0.1-0.2%(m/v)sds的柠檬酸钠缓冲液、含0.05%(m/v)sds的柠檬酸钠缓冲液、含0.1%(m/v)sds的柠檬酸钠缓冲液或含0.2%(m/v)sds的柠檬酸钠缓冲液)。柠檬酸钠缓冲液可为含175g/lnacl和88g/l柠檬酸三钠的水溶液;ph值为7.4。所述漂洗缓冲液2具体可为含0.05-0.2%(m/v)sds的柠檬酸钠缓冲液稀释液(如含0.05-0.1%(m/v)sds的柠檬酸钠缓冲液稀释液、含0.1-0.2%(m/v)sds的柠檬酸钠缓冲液稀释液、含0.05%(m/v)sds的柠檬酸钠缓冲液稀释液、含0.1%(m/v)sds的柠檬酸钠缓冲液稀释液或含0.2%(m/v)sds的柠檬酸钠缓冲液稀释液)。柠檬酸钠缓冲液稀释液可为1体积份柠檬酸钠缓冲液和9体积份水混合而成。所述步骤(3-4)中,“重悬磁珠”通过加入文库富集洗脱液重悬。所述文库富集洗脱液可为浓度为0.1m的naoh水溶液。所述步骤(3-5)中,所述pcr扩增体系可由步骤(3-4)收集的上清、中和缓冲液和pcr反应液组成。所述中和缓冲液具体可为ph7.5、1m的tris-hcl缓冲液。pcr反应液由phusionhotstartiidnapolymerase、dntp、dmso、引物5、引物6、mgcl2、kcl、nonidetp40和水组成。3mlpcr反应液具体可由100μl浓度为0.05u/μlphusionhotstartiidnapolymerase(thermo公司的产品,货号为f549s)和2900μlpcrmixbuffer组成。pcrmixbuffer为含0.2mmdatp、0.2mmdttp、0.2mmdctp、0.2mmdgtp、5%(v/v)dmso、2.5pmol引物5、2.5pmol引物6、4mmmgcl2、500mmkcl和0.8%(v/v)nonidetp40的水溶液。所述步骤(3-6)中,所述“进行pcr扩增”的程序可为:98℃30sec;98℃30sec,65℃30sec,72℃30sec,15个循环;72℃5min,4℃∞。所述步骤(3-7)中,所述纯化可为利用agencourtampurexp核酸纯化试剂盒(beckmancoulter公司的产品,货号为a63881)进行纯化。所述步骤(4)中,“将所述靶序列捕获文库进行测序,根据测序数据果判断待测胎儿的13号染色体、18号染色体、21号染色体和性染色体是否为非整倍体”可为将所述靶序列捕获文库进行测序,得到测序原始数据;将测序原始数据进行处理,得到测序数据;根据测序数据判断待测胎儿的13号染色体、18号染色体、21号染色体和性染色体是否为非整倍体。所述将测序原始数据进行处理包括如下步骤:(4-1)将测序原始数据切除接头序列、低质量碱基,过滤(如过滤长度小于40bp序列),然后比对到参考基因组hg19的相应位置;(4-2)完成步骤(4-1)后,去除由于pcr扩增偏好引起的重复序列,得到测序数据。所述步骤(4)中,“根据测序数据判断待测胎儿染色体是否为非整倍体”的判断标准可为上述任一所述判断标准甲和/或上述任一所述判断标准乙。本发明还保护靶序列捕获文库,由上述任一所述方法得到的靶序列组成。本发明还保护上述任一所述探针组。本发明还保护上述任一所述探针组的应用,可为w1)或w2):w1)检测待测胎儿13号染色体、18号染色体、21号染色体和性染色体是否为非整倍体;w2)检测待测胎儿13号染色体、18号染色体、21号染色体和性染色体。上述任一所述测序的平台可为nextseq500、xten或novaseq。实验证明,本发明提供的试剂盒可以检测待测胎儿13号染色体、18号染色体、21号染色体和性染色体是否为非整倍体,检测结果与羊水金标检测结果(属于侵入性产前诊断)完全一致。本发明具有重要的应用价值。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的孕妇对实验内容均知情同意。下述实施例中涉及的引物的核苷酸序列见表1。表1注:*g表示g进行硫代修饰,*a表示a进行硫代修饰,*t为t进行硫代修饰,p为磷酸化修饰,n为a、t、c或g。实施例1、用于无创检测待测胎儿染色体是否为非整倍体的试剂盒的制备一、探针组的制备1、根据人第13号染色体的特异区域、人第18号染色体的特异区域、人第21号染色体的特异区域、人第x染色体的特异区域和人第y染色体的特异区域设计并合成500个探针。每个探针均由108个核苷酸组成,从5’末端到3’末端依次包括dna片段1、dna片段2和dna片段3。dna片段1的核苷酸序列为5’-gactacatgggacat-3’。dna片段3的核苷酸序列为5’-ggaacctacgacgta-3’。dna片段2均由78个核苷酸组成。dna片段2为人第13号染色体的特异区域、人第18号染色体的特异区域、人第21号染色体的特异区域、人第x染色体的特异区域或人第y染色体的特异区域的一部分。2、完成步骤1后,对探针进行生物素标记。具体步骤作为:将500个探针混合均匀在总体积为1.2ml的ddh2o中,取其中15μl利用通用pcr引物对(由引物1:5’-bio-gactacatgggacat-3’(bio表示5’末端具有生物素标记)和引物2:5’-ggaacctacgacgta-3’组成)进行pcr扩增(可分三管进行),得到pcr扩增产物。3、取pcr扩增产物,用minelutepcrpurificationkit(qiagen公司的产品,货号为28006)进行纯化,得到纯化产物;之后取500ng纯化产物,用myone链酶亲和素磁珠(invitrogen公司的产品,货号为35602)进行结合;之后加入naoh溶液处理,目的为将没有生物素标记的互补链变性、洗脱下来;之后将整个磁珠用100℃的甲酰胺液体洗涤,使探针从磁珠上分离下来;最后用乙醇沉淀,得到生物素标记的探针组。二、用于无创检测待测胎儿染色体是否为非整倍体的试剂盒的制备用于无创检测待测胎儿染色体是否为非整倍体的试剂盒由富集缓冲液、杂交缓冲液、文库结合缓冲液、漂洗缓冲液1、漂洗缓冲液2、文库富集洗脱液、中和缓冲液、pcr反应液和步骤一制备的探针组组成。富集缓冲液由3.5体积份人cot-1dna水溶液、3.5体积份鲑鱼精dna水溶液和3体积份引物混合液(由引物3、引物4和水组成)组成。富集缓冲液中,人cot-1dna的浓度为35%(v/v),鲑鱼精dna的浓度为15%(v/v),引物3的浓度为0.5nmol/μl,引物4的浓度为0.5nmol/μl。杂交缓冲液:含1.25mnacl、0.125m柠檬酸钠、0.1g/100mlbsa和7%(v/v)tween20的水溶液。文库结合缓冲液:含1mnacl和1mmedta的ph7.5、10mm的tris-hcl缓冲液。漂洗缓冲液1:含0.1%(m/v)sds的柠檬酸钠缓冲液。柠檬酸钠缓冲液为含175g/lnacl和88g/l柠檬酸三钠的水溶液;ph值为7.4。漂洗缓冲液2:含0.1%(m/v)sds的柠檬酸钠缓冲液稀释液。柠檬酸钠缓冲液稀释液为1体积份柠檬酸钠缓冲液和9体积份水混合而成。文库富集洗脱液:浓度为0.1m的naoh水溶液。中和缓冲液:ph7.5、1m的tris-hcl缓冲液。3mlpcr反应液由100μl浓度为0.05u/μlphusionhotstartiidnapolymerase(thermo公司的产品,货号为f549s)和2900μlpcrmixbuffer组成。pcrmixbuffer为含0.2mmdatp、0.2mmdttp、0.2mmdctp、0.2mmdgtp、5%(v/v)dmso、2.5pmol引物5、2.5pmol引物6、4mmmgcl2、500mmkcl和0.8%(v/v)nonidetp40的水溶液。实施例2、实施例1制备的试剂盒无创产前检测待测胎儿是否患有染色体非整倍体疾病的方法的建立本发明的发明人经过大量实验,建立了采用实施例1制备的试剂盒无创产前检测待测胎儿是否患有染色体非整倍体疾病的方法。具体步骤如下:一、待测孕妇血浆游离dna提取1、用edta抗凝血管采集待测孕妇外周血10ml,4℃、1600g离心15min,收集上清1(置于低吸附离心管)。2、完成步骤1后,取所述上清1,12000rpm离心5min,收集上清2(置于低吸附离心管)。上清2即为血浆。3、完成步骤2后,取1ml上清2,用大体积游离核酸提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司的产品,货号为dp710)提取血浆游离dna(cfdna)。将该cfdna命名为待测孕妇血浆游离dna。二、待测孕妇血浆游离dna文库的制备取5ng步骤一获得的待测孕妇血浆游离dna,利用kapahyper文库构建试剂盒(kapabiosystems公司的产品,货号为kk8504)制备待测孕妇血浆游离dna文库。制备待测孕妇血浆游离dna文库的接头为单链dna1和单链dna2。取待测孕妇血浆游离dna文库,进行qubit定量和2%琼脂糖凝胶电泳检测。三、靶序列捕获文库的构建1、配制富集体系。富集体系为100μl,由48μl待测孕妇血浆游离dna文库(含1μg待测孕妇血浆游离dna)、12μl富集缓冲液、5μl探针组和35μl杂交缓冲液(65℃预热)组成。2、完成步骤1后,取所述富集体系,置于pcr仪进行过夜杂交富集(杂交时间至少16h),得到富集产物。反应程序:95℃7min,65℃16h以上。3、链霉亲和素包被磁珠的溶液的获得(链霉亲和素包被磁珠在保存液中保存,进行这一步的目的为去除保存液)(1)取低吸附离心管,加入50μlm-280链霉亲和素磁珠,然后置于磁力架1min。(2)完成步骤(1)后,弃上清,加入50μl文库结合缓冲液,重悬磁珠,然后短暂离心。(3)完成步骤(2)后,取所述低吸附离心管,置于磁力架1min,弃上清,然后加入50μl文库结合缓冲液,重悬磁珠。(4)完成步骤(3)后,取所述低吸附离心管,置于磁力架1min,弃上清,然后加入50μl文库结合缓冲液,重悬磁珠,得到链霉亲和素包被磁珠的溶液。4、共孵育捕获(1)完成步骤3后,取所述低吸附离心管,加入步骤2获得的全部的富集产物,涡旋震荡5sec,然后置于室温的旋转混匀仪上1h。(2)完成步骤(1)后,取所述低吸附离心管,置于磁力架1min,弃上清。5、洗涤和pcr扩增(1)完成步骤4后,取所述低吸附离心管,加入500μl漂洗缓冲液1,混匀,置于旋转混匀仪旋转15min。(2)完成步骤(1)后,取所述低吸附离心管,置于磁力架上静置2min,弃上清。(3)完成步骤(2)后,取所述低吸附离心管,加入500μl漂洗缓冲液2(已65℃预热),65℃孵育10min。(4)完成步骤(3)后,取所述低吸附离心管,置于磁力架上静置2min,弃上清。(5)重复步骤(4)两次。进行上述步骤的目的为将没有与m-280链霉亲和素磁珠结合的探针洗掉。(6)完成步骤(5)后,取所述低吸附离心管,加入30μl文库富集洗脱液,重悬磁珠,置于室温旋转混匀仪10-20min。(7)完成步骤(6)后,取所述低吸附离心管,置于磁力架上静置1min。(8)完成步骤(7)后,将上清转移至离心管,然后加入40μl中和缓冲液和30μlpcr反应液,移液器吸打混匀后置于pcr仪进行pcr扩增,得到pcr扩增产物。pcr程序:98℃30sec;98℃30sec,65℃30sec,72℃30sec,15个循环;72℃5min,4℃∞。6、纯化完成步骤5后,取所述pcr扩增产物,利用agencourtampurexp核酸纯化试剂盒(beckmancoulter公司的产品,货号为a63881)纯化,得到文库扩增纯化产物。该文库扩增纯化产物即为靶序列捕获文库。四、高通量测序及数据分析1、将步骤三得到的靶序列捕获文库通过nextseq500、xten、novaseq等二代测序平台进行高通量测序,得到测序原始数据。2、完成步骤1后,将测序原始数据用cutadapt软件(网址为:https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)切除接头序列、低质量碱基(质量值小于10),过滤长度小于40bp序列,然后通过bwa软件(网址为:http://bio-bwa.sourceforge.net/)或bowtie软件(http://http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/)比对到参考基因组hg19的相应位置。3、完成步骤2后,用biobambam2软件(https://software.broadinstitute.org/gatk/)去除由于pcr扩增偏好引起的重复序列,得到待测孕妇的数据,进一步获得待测孕妇目标染色体的捕获区域reads比例。4、参考数据库的建立(1)待测者血浆游离dna提取将步骤一中“待测孕妇”替换为某待测者,其它步骤均不变,得到该待测者血浆游离dna。(2)待测者血浆游离dna文库的制备分别取5ng步骤(1)获得的待测者血浆游离dna,利用kapahyper文库构建试剂盒制备待测者血浆游离dna文库。制备待测孕妇血浆游离dna文库的接头为单链dna1和单链dna2。(3)靶序列捕获文库的构建将步骤三中“待测孕妇血浆游离dna文库”分别替换为步骤(2)制备的待测者血浆游离dna文库,其它步骤均不变,获得靶序列捕获文库。(4)将步骤(3)得到的靶序列捕获文库通过nextseq500、xten、novaseq等二代测序平台进行高通量测序,得到测序原始数据。(5)将步骤(4)得到的测序原始数据用cutadapt软件切除接头序列、低质量碱基(质量值小于10),过滤长度小于40bp序列,然后通过bwa软件或bowtie软件比对到参考基因组hg19的相应位置。(6)完成步骤(5)后,用biobambam2软件去除由于pcr扩增偏好引起的重复序列,得到该待测者的数据。待测者共450名,分别为400名正常孕妇(即分娩健康胎儿的健康孕妇)和50名男性。450名待测者的数据共同组成参考数据库。50名男性待测者的数据共同组成正常男性数据库。400名正常孕妇中分娩出女胎儿的待测者的数据共同组成女胎儿数据库。400名正常孕妇中分娩出男胎儿的待测者的数据共同组成男胎儿数据库。5、计算参考数据库中目标染色体(第13号染色体、第18号染色体、第21号染色体、x染色体或y染色体)捕获区域reads比例的平均值(mean)和标准方差(sd:standraddeviation)。参考数据库中目标染色体(第13号染色体、第18号染色体、第21号染色体、x染色体或y染色体)捕获区域reads比例的平均值(mean)和标准方差(sd:standraddeviation)的值见表2。表2捕获区域reads比例的平均值捕获区域reads比例的标准方差第13号染色体0.0704802340.003783135第18号染色体0.0564815190.004469963第21号染色体0.0534748840.003796539x染色体0.138318218944452(m)/0.140807034370486(f)0.0115653390816059(m)/0.0119558674493583(f)y染色体0.00345129816422603(m)/-0.00128275369533018(m)/-6、完成步骤5后,先按照下述公式计算待测孕妇目标常染色体z-score;chrnz-score:待测孕妇目标常染色体z-score;%chrnsample:待测孕妇目标常染色体捕获区域的reads比例;meanchrnreference:参考数据库中目标常染色体捕获区域reads比例的平均值;s.d.%chrnreference:参考数据库中目标常染色体捕获区域reads比例的标准方差。然后进行如下判断:如果待测孕妇的目标常染色体z-score≥3,则待测孕妇胎儿的目标常染色体数目增加;如果-3<待测孕妇的目标常染色体z-score<3,则待测孕妇胎儿的目标常染色体数目正常;如果待测孕妇的目标染色体z-score≤-3,则待测孕妇胎儿的目标常染色体数目减少。目标常染色体数目增加或目标常染色体数目减少均会造成染色体非整倍体疾病。例如,第13号染色体数目增加会造成13-三体综合征,第18号染色体数目增加会造成18-三体综合征,第21号染色体数目增加会造成21-三体综合征(即唐氏综合征)。7、完成步骤5后,判断待测孕妇胎儿的性染色体数目是增加、减少还是正常。具体步骤如下:(1)先根据待测孕妇y染色体捕获区域的reads比例判断胎儿性别:若待测孕妇y染色体捕获区域reads比例>0.001,则胎儿性别为男性;若待测孕妇y染色体捕获区域reads比例≤0.001,则胎儿性别为女性。(2)如果胎儿为女性,先按照下述公式计算待测孕妇的x染色体z-score;chrxz-score:待测孕妇x染色体z-score;%chrnsample:待测孕妇x染色体捕获区域的reads比例;meanchrnreference:女胎儿数据库中x染色体捕获区域reads比例的平均值;s.d.%chrnreference:女胎儿数据库中x染色体捕获区域reads比例的标准方差。然后进行如下判断:如果待测孕妇的x染色体z-score≥3,则待测孕妇胎儿的x染色体数目增加;如果-3<待测孕妇的x染色体z-score<3,则待测孕妇胎儿的x染色体数目正常;如果待测孕妇的x染色体z-score≤-3,则待测孕妇胎儿的x染色体数目减少。胎儿性别为女性时,x染色体数目增加或x染色体数目减少均会造成染色体非整倍体疾病。x染色体数目增加会造成超雌综合症。x染色体数目减少会造成特纳综合征。(3)如果胎儿为男性,首先按照如下步骤(a)-(c)获得待测孕妇的x染色体z-score:(a)按照下述公式计算正常男性数据库x染色体与y染色体比值均值:c:正常男性数据库x染色体与y染色体比值均值;%chrxmdb:正常男性数据库中x染色体捕获区域reads比例的平均值;%chrymdb:正常男性数据库中y染色体捕获区域reads比例的平均值。经计算,正常男性数据库x染色体与y染色体比值均值为2.817。(b)按照下述公式计算经转换后待测孕妇x染色体捕获区域的reads比例:%chrx为经转换后待测孕妇x染色体捕获区域的reads比例;%chrxsample为待测孕妇x染色体捕获区域的reads比例;c为正常男性数据库x染色体与y染色体比值均值;%chrysample为待测孕妇y染色体捕获区域的reads比例。(c)按照下述公式计算待测孕妇x染色体z-score:chrxz-score:待测孕妇x染色体z-score;%chrx:经转换后待测孕妇x染色体捕获区域的reads比例;meanchrxreference:女胎儿数据库中x染色体捕获区域reads比例的平均值;s.d.%chrxreference:女胎儿数据库中x染色体捕获区域reads比例的标准方差。然后进行如下判断:如果待测孕妇的x染色体z-score≥3且待测孕妇y染色体捕获区域reads比例<0.00345,则待测孕妇胎儿的x染色体数目增加、y染色体数目正常;如果待测孕妇的x染色体z-score≥3且待测孕妇y染色体捕获区域reads比例≥0.00345,则待测孕妇胎儿的y染色体数目增加、x染色体数目正常;如果-3<待测孕妇的x染色体z-score<3,则待测孕妇胎儿的x染色体和y染色体数目均正常;如果待测孕妇的x染色体z-score≤-3,则待测孕妇胎儿的x染色体数目减少,y染色体数目正常。400名正常孕妇中分娩出男胎儿的y染色体捕获区域reads比例的平均值为0.00345。胎儿性别为男性时,x染色体数目增加或y染色体数目增加均会造成染色体非整倍体疾病。x染色体数目增加会造成克兰费尔特综合征。y染色体数目增加会造成超雄综合征。实施例3、采用实施例1制备的试剂盒无创产前检测待测胎儿是否患有染色体非整倍体疾病待测样本为1例13-三体综合征唐筛高危孕妇外周血样本(编号为7)、2例18-三体综合征唐筛高危孕妇外周血样本(编号为1和6)、2例21-三体综合征唐筛高危孕妇外周血样本(编号为2和3)、1例超雌综合症(具体为xxx)唐筛高危孕妇外周血样本(编号为4)、1例克兰费尔特综合征(具体为xxy)唐筛高危孕妇外周血样本(编号为5)、1例特纳综合征(具体为xo)唐筛高危孕妇外周血样本(编号为9)和1例超雄综合征(具体为xyy)唐筛高危孕妇外周血样本(编号为8)。1、采用实施例1制备的试剂盒无创产前检测取待测样本,按照实施例2建立的方法进行检测。平均测序深度检测结果见表3中第2列。胎儿性别见表3中第3列(f为女性,m为男性)。y染色体捕获区域reads比例见表3中第4列。孕妇的目标染色体z-score见表3中第5列。测序数据量在1g情况下,20x以上的覆盖度见表3中第6列。检测结果见表3中第7列。表32、羊水金标检测羊水金标检测结果见表3中第8列。结果表明,采用实施例1制备的试剂盒进行的无创产前检测结果和羊水金标检测结果完全一致。由此可见,可以采用实施例1制备的试剂盒无创产前检测待测胎儿是否患有染色体非整倍体疾病(如13-三体综合征、18-三体综合征、21-三体综合征、特纳综合征、克兰费尔特综合征)。<110>北京迈基诺基因科技股份有限公司<120>一种用于无创检测待测胎儿染色体是否为非整倍体的试剂盒及其专用探针组<160>508<170>patentinversion3.5<210>1<211>108<212>dna<213>人工序列<400>1gactacatgggacatctcccccccaggaacactggtccacgctttctagaagcagggtcc60ctgacctctgcagctttgggcttctccctgttttacgtcgtaggttcc108<210>2<211>108<212>dna<213>人工序列<400>2gactacatgggacatgcctggcaccacctttgactcctgtctcctggaagctgattcact60cagcctgcacacctctgctctcctcccatctcgtacgtcgtaggttcc108<210>3<211>108<212>dna<213>人工序列<400>3gactacatgggacatgcaggtgtctgcaggtctgccaaccccatcaggggctggactctc60tgcgtgaggtgagtggctcgggtacaaagagactacgtcgtaggttcc108<210>4<211>108<212>dna<213>人工序列<400>4gactacatgggacatacagcctctaatgcatagttagggaaggcccagggttccagcaac60tttccagggcaaccacctgaccagtccccgcagtacgtcgtaggttcc108<210>5<211>108<212>dna<213>人工序列<400>5gactacatgggacattccctgaccatcccctgccagctatgaattttcccggtcggcatg60aattgtgcttgagaggtgatatgcctcagaagctacgtcgtaggttcc108<210>6<211>108<212>dna<213>人工序列<400>6gactacatgggacattggaatgttcttgctgaacagcattttctttctaagaaagcagaa60ctttggaagacgaggttatcagagccaatgaactacgtcgtaggttcc108<210>7<211>108<212>dna<213>人工序列<400>7gactacatgggacatgcgggaagcaacctactggttatgggtattctgaaaatactgtag60aaaaacatagtcccagaggacactcagagagaatacgtcgtaggttcc108<210>8<211>108<212>dna<213>人工序列<400>8gactacatgggacatgcagagtaagctcaaattattttgtgaagattcacaaaggtttat60ggaagtggctgatagcaccagcagtaggcaaggtacgtcgtaggttcc108<210>9<211>108<212>dna<213>人工序列<400>9gactacatgggacatagtcaatttaagtgcagattcattatcagggtacttctctcttaa60gccacttccctttctctctgctccctgcccctctacgtcgtaggttcc108<210>10<211>108<212>dna<213>人工序列<400>10gactacatgggacataacaattgcgaattctctctgcctcgcctccccctatcttgtccg60tgtgggcacacactgagtgttgagttgccgtgttacgtcgtaggttcc108<210>11<211>108<212>dna<213>人工序列<400>11gactacatgggacattgtgtgacatgacaacaaaggaacaaatgcactgtctttggaaca60gattttgttcaaagcaagctgaatacagccagctacgtcgtaggttcc108<210>12<211>108<212>dna<213>人工序列<400>12gactacatgggacattccatgactggacttggatgcatatgcttccgccatcaccatgag60aaggctgtgtctgggatggccgctgtgccctgatacgtcgtaggttcc108<210>13<211>1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