与草鱼性状相关的SNP分子标记及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学dna标记技术与应用领域，特别涉及与草鱼性状相关的snp分子标记及其应用。

背景技术：

草鱼(ctenopharyngodonidella)属雅罗鱼亚科(leuciscinae)、草鱼属(ctenopharyngodon)，具有生长速度快，肉质鲜美，营养价值高等优点，目前是我国淡水养殖鱼类中年产量最大的养殖对象，从2007年到2016年草鱼产量从356万吨逐年增加到590万吨，十年产量增加了65.73％。由此可见，草鱼养殖业的健康良性发展，不仅为我国乃至发展中国家人民提供了大量优质动物蛋白，同时带动了相关产业如饲料加工、运输和销售行业的发展壮大，解决了大批人员的就业问题。至今，虽然水产工作者已经付出了很多的努力，但草鱼仍未有通过国家良种审定委员会鉴定的人工选育的良种，实际生产上多为野生种直接驯化而成，缺少定向选育，生产上经常出现因亲本质量差，造成后代生长速度慢、规格不齐、抗病力差等问题，养殖户常常面临重大的经济损失，因此，选育高产优质的草鱼良种一直是草鱼育种工作的中心目标。

选育出生长速度更快的草鱼新品种可以节约饲料成本，缩短养殖周期进而大幅度降低草鱼养殖成本，因此，开发快速可靠的育种技术，进行草鱼快长品种(系)的培育十分必要。在开展常规选育研究的同时，开发和应用分子标记辅助育种技术可加快草鱼良种选育进程。snp是指基因组dna序列中由于单个核苷酸变异而产生的多态性，位于基因编码区的非同义snp可导致氨基酸的变化，从而影响蛋白质的功能，特别是发生在结构功能区域的snp尤其重要，最终引起生物表型的变化。

全基因组关联分析(genome-wideassociationstudy,gwas)旨在从全基因组范围内筛选与性状关联的snps。gwas分析的成本主要有2个:第一,用于分析的样本数量；第二,基因分型的费用。数量越多,其分型成本、测定性状的成本也越高。为减少成本,只测序极端样品的gwas方法被开发出来了,如bsr-seq(rna-seqbasedbsa)、xp-gwas(extreme-phenotypegenome-wideassociationstudy)等。研究证明xp-gwas可有效降低基因分型的工作量,能够进行低成本高效益的snp筛选。snp分型技术也逐渐由早期阶段的中、低通量,发展到高通量的基因芯片、重测序技术。其中rad-seq(restrictionassociationsitednasequencing)就是一种便宜、高效的snp发掘与分型高通量方法。综合考虑实验成本和效率,可以采用rad-seq技术结合xp-gwas策略在全基因组范围内寻找与草鱼生长性状相关的snp位点,旨在寻找新的遗传标记,为分子标记辅助选育快长草鱼新品种选育提供基础资料。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于提供与草鱼体重相关的4个snps标记及应用。

本发明所采取的技术方案是：

草鱼生长相关的基因序列如seqidno.1～seqidno.4所示。

上述基因序列，seqidno.1的第159位y为碱基t或c，seqidno.2的第410位y为碱基c或t，seqidno.3的第370位y为碱基c或t，seqidno.4的第374位y为碱基c或t。

上述所述的基因序列seqidno.1～seqidno.4在判断草鱼生长快慢的应用。

草鱼生长快慢相关的snp位点，其为seqidno.1第159位碱基、seqidno.1第410位碱基、seqidno.1第370位碱基和seqidno.1第374位碱基。

上述所述的snp位点在判断或鉴别草鱼生长快慢中的应用。

上述所述的snp位点在选育生长优异草鱼品种的应用。

一种筛选草鱼生长快慢的方法，包括以下步骤：

检测草鱼基因序列seqidno.1的第159位碱基处的snp位点是否为基因型cc，若是，则为体重优异，生长快的草鱼；

或/和，检测草鱼基因seqidno.2的第410位碱基处的snp位点是否为基因型cc，若是，则为体重优异，生长快的草鱼；

或/和，检测草鱼基因seqidno.3的第370位碱基处的snp位点是否为基因型cc，若是，则为体重优异，生长快的草鱼；

或/和，检测草鱼基因seqidno.1的第374位碱基处的snp位点是否为基因型tt，若是，则为体重优异，生长快的草鱼。

进一步的，包括以下步骤：

(1)提取草鱼的dna；

(2)以提取的dna为模板，进行pcr扩增实验，获取含有snp位点的目标片段，检测草鱼基因seqidno.1第159位碱基、基因seqidno.2第410位碱基、基因seqidno.3第370位碱基的基因型是否为cc，或基因seqidno.4第374位碱基处的基因型是否为tt。

进一步的，所述的步骤(2)pcr扩增：使用snp24-f、snp24-r、snp35-f、snp35-r、snp36-f、snp36-r、snp37-f以及snp37-r引物对进行pcr扩增，得到pcr产物，所述引物的核苷酸序列如下：

snp24-f：5'-cgtagtcacgacaggacacgt-3'；(seqidno.5)

snp24-r：5'-cagtgattcttctgttaattct-3'；(seqidno.6)

snp35-f：5'-gatatggatgactgtctctcc-3'；(seqidno.7)

snp35-r：5'-caatccaggtcagatagtaca-3'；(seqidno.8)

snp36-f：5'-tcagggttcaaagtttgagtg-3'；(seqidno.9)

snp36-r：5'-gtgcgaggtgattggtatctg-3'；(seqidno.10)

snp37-f：5'-gacaatgagttcactattct-3'；(seqidno.11)

snp37-r：5'-caaggttctggaatcattcct-3'(seqidno.12)；

再将pcr产物使用延伸引物snp24-p、snp35-p、snp36-p和snp37-p进行pcr延伸扩增，确定草鱼基因seqidno.1第159位碱基、基因seqidno.2第410位碱基、基因seqidno.3第370位碱基以及基因seqidno.4第374位碱基处的基因型；所述延伸引物核苷酸序列如下：

snp24-p：5'-tacgctgtgagaaactgtgagg-3'；(seqidno.13)

snp35-p：5'-gtgaaagggggaatactataac-3'；(seqidno.14)

snp36-p：5'-ttttttttttcggactcggaggttgagagcta-3'；(seqidno.15)

snp37-p：5'-agatctcaatccaagcgagcac-3'(seqidno.16)。

进一步的，所述的pcr扩增体系为：

所述的pcr扩增反应条件为：94℃变性15s；54℃退火15s，72℃延伸30s，24个循环。

本发明的有益效果是：

(1)本发明所获得的基因型是依据基因内部产生的碱基突变，因此不存在遗传的交换，也不需要表型的进一步验证。

(2)本发明通过检测草鱼的四个snp标记，snp24、snp35、snp36以及snp37，能够在相同养殖条件下有效的挑选体重更大的草鱼，能够有效用于草鱼的分子标记辅助育种。进而能够根据实际育种需求对草鱼亲本进行基因型鉴定，挑选合适的基因型草鱼亲本进行繁殖，可以获得生长较快的草鱼后代(鱼苗)，节约育种时间，成本低廉，准确性高，加快草鱼育种进程。

附图说明

图1为snp延伸反应后的检测峰图，峰图的颜色及对应核苷酸为：绿色—a，红色—t，黑色—c，蓝色—g。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1snp标记的获得

1.本发明测序获得的草鱼基因序列如seqidno.1～seqidno.4，在seqidno.1第159位碱基、seqidno.1第410位碱基、seqidno.1第370位碱基和seqidno.1第374位碱基处各发现一个snp位点，seqidno.1第159位碱基、seqidno.1第410位碱基、seqidno.1第370位碱基和seqidno.1第374位碱基处有等位基因c和t，组成cc、tc、tt基因型。

本发明用于生长性状(体重)分析的样本为同批繁殖且同塘饲养的25月龄草鱼群体，随机挑选298尾草鱼用于生长性状(体重)关联分析，选取体重极大的个体20尾(平均体重为2659±126.40g)，体重极小的个体20尾(平均体重为744.76±73.35g)，分别抽取亲本和后代尾静脉血液各2ml(添加acd抗凝剂抗凝)用于后续实验。

以下序列中的y代表的是突变的碱基。

snp24的基因序列片段如seqidno.1，rad库标签(ctg294657.0)，突变位置为t159c：

atcggtccacgtaactctcccgaaagcctttccgcaccgcgcgggccatactgaccaccgtagtcacgacaggacacgtgctgaaacccaagaggacgggatgatggtctttaattcattaacatgacgagtgctgtgtgtgtgtgtgtgtgtttgttycctcacagtttctcacagcgtatgccgctcgtccccgtcggacacacacaggtgttcagagggccgcaggcagcaccatgttggcagggaggaacacacggtgtagtgacagctgcacacacacacacaattacatgatcacacactacatcaaaacaccacagaattaacagaagaatcactgcaaatgaaactgaaactgaaaaaatgaatgtcatatgaatgattcaatgattaatgatgtcataatgaaaggattataat(seqidno.1)；

snp35序列片段，rad库标签(ctg355219.0),突变位置为c410t：

attacaacacaccagtggtgaggtcagctggtggtagcatgtgtttcctgatgttgattagtttgattttgtctagtataagtgcattctttttctttggagaacccacatctgcactttgcctcctgcgaaatgccatatttgcatttttcttcactgtctgtatttcctgtttgactgtccgttcctttcaaattgtttgtgtttttaaaatggctgctcagttccctaaggtgcacagcctttgggtaaagcacaatggccagtggctcttcattgcatttacttctgtcattcatttaatttcttgtgtgatatggatgactgtctctcctgtcaaagtcacggctgactggtggacttatacagatcaaattatgctcgtctgtgaaagggggaatactataacyttaaccatagttgtgttcataggttggtttcttggtttcctgtgtctcctgttttcctacatgggaagagatctgccgaaaaattacaatgaggccaaatcaataaccttcagtctaactttgtactatctgacctggattggatatttcacagcatacctctctttcaaaagcaaatacatcatccttttgaatgcactggctcaaatatccagtataaatggaatt(seqidno.2)；

snp36序列片段，rad库标签(ctg36503.0),突变位置为c370t：

agtgttccgtgaggaaatggtgcgttgaccacagggctttgattacagaagcggctggtgtaatggagacggaggactctctgttctcctgaggcccccagacgcttcccgcatgtgtttacttaacgcagttagggcttacgccatgcatgtgattaccaagtggctgacacttcatatcgcaaatagacaaactaaacagagaggccacacaacttcaccctaatttttttttggagggaaattctgtggtttggatgtgaaattctgtgaatggtccctgtagagtttaaaatcttcttttttttaatatcttcccccatgtatcagggttcaaagtttgagtgcggactcggaggttgagagctaygcgtccttcatagcccaggctctagaaaagacgcgtggccgtgagtgtgtgccctcttgggaggagatccaggggctgatgggaaggcaggagatactgtgtgctgtgcactaccctggaccgggctgctgccagataccaatcacctcgcacactacggctaatgaggtattgcatcagtcgtttcctctacagcagggattgggaac(seqidno.3)；

snp37序列片段，rad库标签(ctg378190.0),突变位置为c374t：：

aatcgactctaaagtctggatcggatggacgtgttcgaatgcacacctgtgaccacatataactataataataaaaaaataaaaaaataatttagggcaagtattatgtttttttttttgtttttttggctgttggcaattcagctttgcagttttaaattgcaatatttcacaatatgtctgcttttactgtatttttgatcaaataaatgcagcattggtgagactttaccaaccctaaacttttggccctaaaccagcaggataacgccacaaagcttaaatcatctcaaactggttttttaaacaagacaatgagttcactattctcaaatggcctccacagtctccagatctcaatccaagcgagcacytttgggatgtggtgcaacaggagatttgcataatggatgtgcagctgacaaatctgcagcaactgtgtgatgccatcatgataatatggaccaaactctctgaggaatgattccagaaccttgttgaatttatgccactatgaattaaggcagttctgaaatcaacttggtactagaaagatgtacagtacctaataaagtggccggttagtgtatgtatacacacacacacacacacacacacacacac(seqidno.4).

实施例2生长差异标记的筛选

利用构建的极端大个体20尾和极端小个体20尾样品对筛选出来的84个差异snps标记进行初步验证。在所选择的84个snps位点中，其中40个未检测到snp突变，44个检测到snp突变。将检测到突变型的44个snps在极端大个体组和极端小个体组的差异趋近分析表明，snp24，snp36差异显著(p<0.05)，snp37，snp38差异极显著(p<0.01)(见表2)。

表2在极端群体分型的标记

注：“_”表示此位点p<0.05。

实施例3草鱼体重关联的snp标记与体重相关的验证

1.样品dna提取

(1)取待测鱼的血液100ul或剪碎后鳍条组织3mg，加入0.5ml的裂解液(10mmol/ltris-hcl；0.1mol/ledta；0.5％sds；30mg/lrnase；100mg/l蛋白酶k，ph8.0)，55℃消化1小时，其间不时轻轻摇动。

(2)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液。

(3)加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀dna，12000转/分钟离心10分钟。

(4)用70％乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μlte(10mmol/ltris－hcl；1mmol/ledta，ph8.0)溶解dna，4℃贮存备用。

2.引物设计和合成

根据草鱼基因片段(seqidno.1～seqidno.4)设计合成了引物对，以及与体重相关的4个snp位点的snapshot引物，引物序列如下：

snp24-f：5'-cgtagtcacgacaggacacgt-3'；(seqidno.5)

snp24-r：5'-cagtgattcttctgttaattct-3'；(seqidno.6)

snp35-f：5'-gatatgggatgactgtctctcc-3'；(seqidno.7)

snp35-r：5'-caatccaggtcagatagtaca-3'；(seqidno.8)

snp36-f：5'-tcagggttcaaagtttgagtg-3'；(seqidno.9)

snp36-r：5'-gtgcgaggtgattggtatctg-3'；(seqidno.10)

snp37-f：5'-gacaatgagttcactattct-3'；(seqidno.11)

snp37-r：5'-caaggttctggaatcattcct-3'(seqidno.12)

3.pcr扩增反应体系：

pcr扩增反应条件：

94℃变性15s；54℃退火15s，72℃延伸30s，24个循环；72℃延伸3min。得到pcr扩增反应产物。扩增获得条带大小为423bp、638bp、579bp或624bp的条带。

4.取3ulpcr扩增反应的产物用exoi和sap纯化，去除pcr产物中的引物及dntp。

纯化反应体系：

纯化反应条件：37℃45min，80℃15min，得到纯化的pcr产物。

5.对纯化的pcr产物进行单碱基延伸

反应体系为：

延伸引物序列如下：

snp24-p：5'-tacgctgtgagaaactgtgagg-3'；(seqidno.13)

snp35-p：5'-gtgaaagggggaatactataac-3'；(seqidno.14)

snp36-p：5'-ttttttttttcggactcggaggttgagagcta-3'；(seqidno.15)

snp37-p：5'-agatctcaatccaagcgagcac-3'；(seqidno.16)

延伸反应条件：

5.取1μl延伸产物，加8μl上样loading，95℃变性3min，立即冰水浴。

6.草鱼基因型分析

利用测序仪(测序仪型号为abi3730xl)对pcr产物进行snapshot分型，根据测序结果峰图的颜色可判断各个样品草鱼的基因型，草鱼基因seqidno.1第159位碱基处的snp位点是否为cc基因型，如果是cc基因型，则为体重更重、快速增长的草鱼；基因seqidno.2第410位碱基处的snp位点是否为cc基因型，若为cc基因型，则为体重更重、快速增长的草鱼；基因seqidno.3第370位碱基处的snp位点是否为cc基因型，若为cc基因型，则为体重更重、快速增长的草鱼；或/和基因seqidno.4第374位碱基处的snp位点是否为tt基因型，若为tt基因型，则为体重更重、快速增长的草鱼。

利用最小二乘法对筛选到的差异显著的snps与草鱼体重进行关联性分析，在随机群体中与在极端群体验证的结果相同，即这4个snps与生长性状均显著相关(p<0.05)。标记snp24，snp35和snp36标记cc型体重均值均显著高于tt型，而snp37标记tt型体重均值显著高于cc和tc基因型(见表3)。

表34个snps标记与体重性状关联分析

注：相同字母表示两种基因型之间差异不显著(p>0.05)，不同字母表示两种基因型差异显著(p<0.05)。

从表3中可知，草鱼基因seqidno.1第159位碱基、基因seqidno.2第410位碱基、基因seqidno.3第370位碱基，或/和基因seqidno.4第374位碱基处的snp位点，与草鱼的体重密切相关。本发明通过检测草鱼的四个snp标记，snp24、snp35、snp36以及snp37，能够在相同养殖条件下有效的挑选体重更大的草鱼。本发明发现snp标记与草鱼的体重能紧密相关，能够有效用于草鱼的分子标记辅助育种。进而能够根据实际育种需求对草鱼亲本进行基因型鉴定，挑选合适的基因型草鱼亲本进行繁殖，可以获得生长较快的草鱼后代(鱼苗)，对快长草鱼苗种生产有积极意义，并可以大大节约育种时间，成本低廉，准确性高，加快草鱼育种进程。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120>与草鱼性状相关的snp分子标记及其应用

<130>

<160>16

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>423

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atcggtccacgtaactctcccgaaagcctttccgcaccgcgcgggccatactgaccaccg60

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aacatgacgagtgctgtgtgtgtgtgtgtgtgtttgttycctcacagtttctcacagcgt180

atgccgctcgtccccgtcggacacacacaggtgttcagagggccgcaggcagcaccatgt240

tggcagggaggaacacacggtgtagtgacagctgcacacacacacacaattacatgatca300

cacactacatcaaaacaccacagaattaacagaagaatcactgcaaatgaaactgaaact360

gaaaaaatgaatgtcatatgaatgattcaatgattaatgatgtcataatgaaaggattat420

aat423

<210>2

<211>638

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

attacaacacaccagtggtgaggtcagctggtggtagcatgtgtttcctgatgttgatta60

gtttgattttgtctagtataagtgcattctttttctttggagaacccacatctgcacttt120

gcctcctgcgaaatgccatatttgcatttttcttcactgtctgtatttcctgtttgactg180

tccgttcctttcaaattgtttgtgtttttaaaatggctgctcagttccctaaggtgcaca240

gcctttgggtaaagcacaatggccagtggctcttcattgcatttacttctgtcattcatt300

taatttcttgtgtgatatggatgactgtctctcctgtcaaagtcacggctgactggtgga360

cttatacagatcaaattatgctcgtctgtgaaagggggaatactataacyttaaccatag420

ttgtgttcataggttggtttcttggtttcctgtgtctcctgttttcctacatgggaagag480

atctgccgaaaaattacaatgaggccaaatcaataaccttcagtctaactttgtactatc540

tgacctggattggatatttcacagcatacctctctttcaaaagcaaatacatcatccttt600

tgaatgcactggctcaaatatccagtataaatggaatt638

<210>3

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<212>dna

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<400>3

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ctaccctggaccgggctgctgccagataccaatcacctcgcacactacggctaatgaggt540

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agatctcaatccaagcgagcac22