雌性施氏鲟特异DNA片段及应用的制作方法

本发明属于施氏鲟分子标记和遗传性别鉴定技术领域，更具体涉及雌性施氏鲟特异dna片段及应用。

背景技术：

施氏鲟(acipenserschrenckii)是我国黑龙江水系特有珍稀名贵的大型经济鱼类。施氏鲟具有生长速度快、抗病力及适应性强等优点，近年来成为养殖的重要对象之一。施氏鲟的鱼卵做成的鱼子酱富含人体必需氨基酸、多种不饱和脂肪酸、维生素等物质，营养价值极高，享有“黑色黄金”的美誉。在养殖上能够在其早期进行性别筛选，对雌、雄群体进行定向选育，可以获得更高的经济效益。但鲟鱼雌雄个体之间没有明显的第二性征，并且性成熟时间较长。早期从形态上无法辨别雌雄。不能够依照雌雄性别分别进行集约化养殖或一定性别比例进行饲养，造成饲养过多雄性个体的资源浪费，增加了养殖成本，阻碍了鲟鱼产业化的快速发展。因此，如何在施氏鲟发育早期快速准确鉴定其性别显得十分重要。

研究人员通过雌核发育对高首鲟(a.transmontanus)(vanetal.,1999)、短吻鲟(a.brevirostrum)(flynnetal.,2006)和杂交鲟bester(husohuso♀×a.ruthenus♂)(omotoetal.,2005)进行研究，结果表明了鲟科鱼类雌性个体为异形配子的性别决定遗传方式。另外，dna分子标记已成为鉴别鱼类性别的重要分子工具。但是，通过issr(inter-samplesequencerepeats)、aflp和rapd等不同分子标记技术来检测了西伯利亚鲟(a.baerii)、俄罗斯鲟(a.gueldenstaedtii)、小体鲟(a.ruthenus)、意大利鲟(a.naccarii)、湖鲟(a.fulvescens)、波斯鲟(a.percicus)、欧洲鳇(husohuso)、施氏鲟(a.schrenckii)和中华鲟(a.sinensis)等物种的雌雄个体基因组差异都没有检测到鲟鱼的性别特异性dna分子标记(wuertzetal.,2006；keyvanshokoohetal.,2007；mccormicketal.,2008；yarmohammadietal.,2011；刘翠，2011；刘雪清等，2015)。这可能是因为雌雄鲟鱼的基因组本身差异微小；同时也可能因为鲟鱼与高等硬骨鱼类不同，在其进化过程中经历了多次基因组加倍过程(张四明等，1999；ludwigetal.,2001)，其多倍性和数量较多的染色体的特点，加大了鉴定鲟鱼性别特异相关基因或标记的难度。因此需要能够提供更高标记密度、更准确的和更能代表样品基因组特征的检测技术来鉴定鲟鱼性别特异性标记。

随着高通量测序技术的发展，限制性酶切位点相关的dna测序(restrictionsite-associateddnasequencing,rad-seq)等简化基因组测序已广泛应用于物种性别特异性标记开发。目前，科研人员已经成功应用rad-seq技术鉴定到斑马鱼(daniorerio)(andersonetal.,2012)、鲑鱼虱(lepeophtheirussalmonis)(carmichaeletal.,2013)、大西洋比目鱼(hippoglossushippoglossus)(palaiokostasetal.,2013)、尼罗罗非鱼(oreochromisniloticus)(palaiokostasetal.,2013)、蜥蜴(anoliscarolinensis)(gambleetal.,2014)、肉色平鲉(sebastescarnatus)和黄黑平鲉(sebasteschrysomelas)(fowleretal.,2016)等物种性别特异性标记。rad-seq技术是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，构建测序文库。但是，当性染色体处于分化初期或者性染色体的非重组区域十分稀少时，rad测序技术可能鉴定不出性别特异性标记，因为限制性内切酶是对基因组进行有选择性的酶切。遇到这种情况时，gamble建议更换基因组序列中出现频率更高的内切酶进行基因组酶切(gamble,2016)。鉴于鲟鱼基因组相对比较复杂，本发明中采用低覆盖度全基因组测序获得分布整个基因组的序列片段筛选施氏鲟雌性性别特异性片段。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种雌性施氏鲟特异dna片段，所述的dna片段为seqidno.1或seqidno.2所示。

本发明的另一个目的在于提供了针对雌性施氏鲟特异dna片段设计的引物，针对seqidno.1序列设计的引物为：acsc-fs01f(5′-3′):ataacatagttcattaataatgcct和acsc-fs01r(5′-3′):cgccaacagtgaatacgtt，针对seqidno.2序列设计的引物为：acsc-fs02f(5′-3′):ggccataactgtacatatatagaac和acsc-fs02r(5′-3′):ctttcgattatgccggaca。

本发明还有一个目的在于提供了雌性施氏鲟特异dna片段或针对该片段设计的引物的应用，利用本发明提供的dna片段或引物，可进行施氏鲟个体性别鉴定或用于生产施氏鲟鱼子酱的雌性个体的鉴定。

本发明最后一个目的在于提供了一种鲟鱼性别鉴定的方法，方法简单，准确率达到100％。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种雌性施氏鲟特异dna片段，所述的dna片段为seqidno.1或seqidno.2所示。

针对seqidno.1或seqidno.2所示序列设计的引物也为本发明的保护内容。

施氏鲟特异dna片段或针对其设计的引物的应用，包括利用seqidno.2所示片段或针对其设计的引物用于施氏鲟性别鉴定，或是用于生产鱼子酱的施氏鲟雌性个体鉴定；还包括利用seqidno.2和seqidno.1所示片段或针对这两个片段设计的引物用于施氏鲟性别鉴定，或是用于生产鱼子酱的施氏鲟雌性个体鉴定。

一种施氏鲟性别鉴定的方法，通过检测施氏鲟基因组中是否含有seqidno.1或seqidno.2所示的核苷酸序列来判定，所述的检测的方法包括但不限于目前已有的基因组测序，pcr的方法。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

本发明首次筛选获得了施氏鲟雌性特异性片段，设计了雌性特异引物进行鉴定，对施氏鲟雌雄各24尾进行常规pcr扩增验证准确率达100％。首次建立了施氏鲟遗传性别分子鉴定技术。该技术具有准确、简单、快速等优点，为施氏鲟养殖产业发展提供帮助。该筛选体系为其它具有复杂基因组物种筛选性别特异性标记提供了一种可行的技术方法。

附图说明

图1为施氏鲟雌性特异acsc-fs01片段(seqidno.1所示)遗传性别鉴定结果示意图；

图中泳道1-24为雌性个体都能扩增出特异条带，25-48为雄性个体都扩增不出条带，c表示阴性对照，m表示dl2000dnamarker。

图2为施氏鲟雌性特异acsc-fs02片段(seqidno.2所示)遗传性别鉴定结果示意图；

图中1-24为雌性个体都能扩增出特异条带，25-48为雄性个体都扩增不出条带，c表示阴性对照，m表示dl2000dnamarker。

具体实施方式

本发明利用全基因组测序技术与比对分析筛选出施氏鲟候选雌性特异dna片段，并通过常规pcr在群体中验证获得的施氏鲟候选特异dna片段，建立了施氏鲟遗传性别分子鉴定技术，解决了施氏鲟性别鉴定的困难，对施氏鲟人工养殖工作提供了极大的帮助。

实施例1：

雌性施氏鲟特异dna片段的获得：

1、低覆盖度全基因组测序扫描施氏鲟雌雄个体基因组：利用性腺组织石蜡切片鉴定雌雄各20尾施氏鲟，并提取其全基因组dna，超声波随机打断基因组dna、测序文库制备、文库质量检测、illumina测序平台上机测序，获得施氏鲟雌雄个体全基因组测序原始数据，对原始数据进行质控获得有效数据；

2、利用k-mer方法对雌雄两组基因组数据进行分析获得候选性别特异性片段：首先将每个个体有效数据切割成长度为21bp的k-mer，获得40个长度为21bp的k-mer数据集，筛选出雌性特有而雄性没有的k-mer作为雌性特异的k-mer数据集，其次利用雌性特异的k-mer提取其对应的有效片段并通过soapdenovo进行序列组装成雌性候选特异性片段，然后将雌雄所有样品有效测序片段进一步对雌性候选特异性片段进行比对筛选出雌性均有覆盖而雄性无覆盖的特异性雌性片段作为下一步验证的候选雌性特异性片段；

3、候选雌性特异性片段验证：针对获得的雌性候选特异性片段设计引物在上述40个样品中进行普通pcr验证，选取能够在所有雌性个体中能够有效扩增而雄性个体不能扩增的有效片段作为施氏鲟雌性特异性dna片段。获得特异性片段为acsc-fs01(seqidno.1)和acsc-fs02(seqidno.2)，将获得的片段在genebank数据库进行比对，未发现同源序列，为全新的未报道过的dna片段。

实施例2：

雌性施氏鲟特异dna片段的检测方法：

针对acsc-fs01(seqidno.1)设计的引物为：

acsc-fs01f(5′-3′):ataacatagttcattaataatgcct

acsc-fs01r(5′-3′):cgccaacagtgaatacgtt；

其对应的pcr扩增条件为：

95℃预变性5min；随后95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸20s，扩增35个循环，然后72℃延伸7min。

针对acsc-fs02(seqidno.2)设计的引物为：

acsc-fs02f(5′-3′):ggccataactgtacatatatagaac

acsc-fs02r(5′-3′):ctttcgattatgccggaca

其对应的pcr扩增条件为：

95℃预变性5min；随后95℃变性30s,54℃退火30s,72℃延伸20s，扩增35个循环，然后72℃延伸7min。

实施例3：

雌性施氏鲟特异dna片段或针对其设计的引物在鉴定施氏鲟性别中的应用：

首先通过高盐法提取施氏鲟雌雄各24尾的鳍条基因组dna，利用琼脂糖电泳和分光光度计检测提取dna的完整性和浓度；

利用实施例2中涉及的引物对上述dna进行常规pcr扩增，扩增体系为：模板dna约10ng；taq聚合酶1.5u；10×扩增缓冲液2.5μl；4种dntp浓度分别为200μm；上下游引物终浓度分别为0.2μm；补充ddh2o至25μl。

扩增结果如图1和图2所示：

无论是针对seqidno.1设计的引物，还是针对seqidno.2设计的引物，在雌性施氏鲟中都能扩增出特异性条带。而在雄性施氏鲟中均扩增不出特异性条带；即2个雌性特异片段在24个雌性个体中都能扩增出雌性特异条带，24个雄性个体都不能扩增出雌性特异条带，与实际情况完全相同。

因此，本发明提供的特异性条带或针对其设计的引物，无论是单独使用或是联合使用，都能准确的对施氏鲟的雌性进行鉴别。

实施例4：

利用实施例3的方法，对不同种类的鲟鱼(每一种鲟鱼都包括雌性和雄性)进行性别鉴定，结果表明该施氏鲟雌性特异dna片段在达氏鳇、达氏鲟、中华鲟、俄罗斯鲟、闪光鲟、欧洲鳇、小体鲟、西伯利亚鲟)雌雄个体均能扩增出相同条带，无法进行性别鉴定；

在匙吻鲟雌雄个体中均无任何条带扩出，也无法进行性别鉴定。

表明本发明的特异性序列是仅适用于施氏鲟雌雄个体的性别鉴定。

序列表

<110>中国水产科学研究院长江水产研究所

<120>雌性施氏鲟特异dna片段及应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>199

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

aatgcctgtgagagtgcaataccttgcttaatggtcattacaacttaaatatacaactcg60

gctccattcgtttcagtgcaccaaactaagtgcatattactcgggcaacgtaaaagccac120

ctacatggtacaggggttgtttaaaagtacagatggcgctttccaataacgtattcactg180

ttggcgtgcggtattccta199

<210>2

<211>262

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ggccataactgtacatatatagaacaaactaatttggtttcgtaggttaaaaaaactgaa60

aagtatgcattataccaaaataaacatgaattttcacaaaaatatattaaaataaccatt120

ctgaaacttagtagtattttaaacccatattggcacagataataataaaatagtgcaaaa180

tcaatgggtttgttacctgtgtttaatttccccatttacacagtacaacaatctaaaata240

aaatgtccggcataatcgaaag262

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ggccataactgtacatatatagaac25

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ctttcgattatgccggaca19

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ataacatagttcattaataatgcct25

<210>6

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

cgccaacagtgaatacgtt19