清除生物被膜的组合清洗剂、方法和系统与流程

本发明涉及食品领域。具体地，本发明涉及清除生物被膜的组合清洗剂、方法和系统。

背景技术：

蜡样芽孢杆菌是一种条件致病菌，容易引起食源性疾病的爆发以及使食品腐败变质。根据国家食源性疾病监测网对中国食源性疾病爆发的监测资料分析，由蜡样芽孢杆菌引起的疾病占所有食源性微生物疾病的8.6％，排在第四位。蜡样芽孢杆菌不仅可以产芽孢而且有很强的生物被膜形成能力，这些特性提高了该菌的生存能力，也增加了其在食品加工中的感染率。

在食品生产环境中，细菌黏附并发展成的生物被膜是终产品潜在的污染源，不仅造成食品的腐败，同时引发食源性疾病的传播。生物被膜态细菌比起浮游态微生物来说更难清除，对杀菌剂及清洗剂有更强的抗性，是原料、产品以及人员的反复污染源。生物被膜还会降低管道液体的流动性、腐蚀不锈钢、降低热传递效率。因此，在食品生产过程中，若不能及时彻底地清除致病菌所形成的生物被膜，会导致严重的公共卫生安全隐患及巨大的经济损失。

生物被膜是黏附在固体表面并被一种其自身代谢形成的胞外基质(如胞外多糖)包裹在内的微生物聚集体。食品生产设备中的生物被膜主要由细菌胞外多糖、食品残留物(蛋白质、磷酸盐)构成。在食品加工过程中会有有机成分残留，有利于细胞的附着并为其发展形成生物被膜提供了有利条件。食品加工和物料运送管道设备在生产循环之后极有可能残留液体，使微生物更容易形成生物被膜，因为比起在完全被液体淹没的环境中，气-液交界处会形成更厚的生物被膜。

然而，目前适用于清除由蜡样芽孢杆菌形成的生物被膜的清洗剂仍有待开发。

技术实现要素：

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了一种清除生物被膜的组合清洗剂、方法和系统，该组合清洗剂能够达到完全清除生物被膜的效果，使得清洗更加快速、节能，适于规模化应用。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

由于蜡样芽胞杆菌形成的胞外基质结构致密，并且存在芽孢，非常难于完全清除，对于清洗剂的组成及清洗程序要求较高。发明人首先尝试了采用酸碱结合的方式进行清洗，具体步骤为水洗→1.00％氢氧化钠溶液，65℃，10min→1.00％硝酸溶液，65℃，10min。但是，该方法对于蜡样芽胞杆菌的清洗效果并不显著，仅仅只能成功降低2个数量级(例如菌数由10⁹降低至10⁷，或者由10⁸降低至10⁶)。进而，发明人针对蜡样芽孢杆菌生物被膜的特殊性，提高了酸碱的浓度，并延长了清洗时间，具体为2％氢氧化钠溶液，75℃，30分钟→水洗→1.8％硝酸溶液，75℃，30分钟→水洗，清洗效果有所提升，可以将蜡样芽孢杆菌生物被膜完全清除。然而，该方法的清洗时间较长，所采用的酸碱浓度较高，清洗温度也较高，容易对生物被膜所黏附的材料造成腐蚀，降低设备使用寿命。

进而，发明人经过深入研究，发现杀菌剂苯扎溴铵可以对蜡样芽胞杆菌起到较强的杀菌效果，同时，也可以对起到分解胞外基质的作用。将氢氧化钠溶液、硝酸溶液和苯扎溴铵溶液组合使用，在减少酸碱浓度、缩短处理时间、降低作用温度的同时，可以起到完全清除生物被膜的效果，尤其适用于具有特殊胞外基质组成的蜡样芽胞杆菌生物被膜，使清洗更加快速、节能，适于规模化应用。

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种清除生物被膜的组合清洗剂。根据本发明的实施例，所述组合清洗剂包括：氢氧化钠溶液；硝酸溶液；以及苯扎溴铵溶液，所述生物被膜是由蜡样芽胞杆菌形成的。

发明人发现，将氢氧化钠溶液、硝酸溶液和苯扎溴铵溶液组合使用，在减少酸碱浓度、缩短处理时间、降低作用温度的同时，可以达到完全清除蜡样芽胞杆菌生物被膜的效果，使清洗更加快速、节能，适于规模化应用。

需要说明的是，本发明对于蜡样芽胞杆菌的获取方式不作严格限定，可以通过筛选分离、市售或者赠予获得。根据本发明的实施例，蜡样芽胞杆菌2018年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.16908，拉丁文分类命名为bacilluscereus。该蜡样芽胞杆菌是发明人在食品生产车间对非常难于清除的生物被膜进行研究而获得的。

根据本发明的实施例，所述清除生物被膜的组合清洗剂还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述生物被膜包括：蜡样芽孢杆菌；以及胞外基质，其中，基于所述胞外基质的总质量，所述胞外基质包括：40～50质量％的蛋白质；20～30质量％的多糖；以及余量的dna和脂质。氢氧化钠能够除掉如蛋白质、脂肪等有机物，而硝酸可以清除如钙离子或其它矿物质等无机物，苯扎溴铵是一种温和低毒的季铵盐型杀菌剂，三者组合使用，可以有效地针对蜡样芽胞杆菌生物被膜起到较强的清洗作用，通过改变菌体细胞膜的渗透性使细胞膜破裂，细胞内的蛋白质、离子等渗出，从而起到杀菌目的。

发明人发现，不同微生物所形成的生物被膜组成并不相同，尤其是胞外基质的组成差异较大，进而，所适用的清洗液有所不同。本发明的组合清洗剂是针对上述特殊胞外基质组成的蜡样芽胞杆菌生物被膜而设计的，可以高效地完全清除该生物被膜。

根据本发明的实施例，所述氢氧化钠溶液的浓度为1～2质量％。发明人经过大量实验得到上述较优浓度，由此，可以起到较好的清洗效果，且对生物被膜包覆的器材的损伤较小。

根据本发明的实施例，所述硝酸溶液的浓度为0.5～1.5质量％。发明人经过大量实验得到上述较优浓度，由此，可以起到较好的清洗效果，且对生物被膜包覆的器材的损伤较小。

根据本发明的实施例，所述苯扎溴铵溶液的浓度为0.3～0.5质量％。发明人经过大量实验得到上述较优浓度，由此，可以起到较好的清洗效果，且对生物被膜黏附材料的腐蚀性较低。

根据本发明的实施例，所述组合清洗剂进一步包括：中和液，基于所述中和液的总质量，所述中和液中含有0.1～0.5质量％的吐温-80和0.1～0.5质量％的卵磷脂。由此，以便中和残留的杀菌剂苯扎溴铵，避免其带来危害。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种利用前面所述清除生物被膜的组合清洗剂清洗生物被膜的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)利用所述氢氧化钠溶液对所述生物被膜进行冲洗，再进行水洗；(2)利用所述硝酸溶液对所述生物被膜进行冲洗；(3)利用所述苯扎溴铵对所述生物被膜进行冲洗，再进行水洗。发明人发现，依次用氢氧化钠溶液、硝酸溶液和苯扎溴铵溶液进行处理，可以有效地提高蜡样芽胞杆菌生物被膜去除效果，实现完全去除的目的，使清洗更加快速、节能，适于规模化应用。另外，步骤(1)中，在用硝酸溶液进行冲洗之前，先用水洗，从而可以有效地避免后续采用的硝酸与残留的氢氧化钠中和，无法起到清除生物被膜的目的。

根据本发明的实施例，所述冲洗分别独立地是在60～70℃下进行5～15分钟。由此，可以完全去除蜡样芽胞杆菌生物被膜，清洗快速、节能。

根据本发明的实施例，步骤(3)进一步包括：在进行所述水洗之前，利用所述中和液对所述生物被膜进行冲洗。由此，可以进一步提高清洗效果。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对组合清洗剂所描述的特征和优点，同样适用于该清洗生物被膜的方法，在此不再赘述。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种实施前面所述利用前面所述清除生物被膜的组合清洗剂清洗生物被膜的方法的系统。根据本发明的实施例，所述系统包括：第一储液装置，所述第一储液装置用于存储所述氢氧化钠溶液；第二储液装置，所述第二储液装置用于存储所述硝酸溶液；第三储液装置，所述第三储液装置用于存储所述苯扎溴铵溶液；第四储液装置，所述第四储液装置用于存储所述中和液；以及水管，所述第一储液装置、第二储液装置、第三储液装置和第四储液装置上均设置有出液管道，用于对所述生物被膜进行冲洗。由此，利用本发明的系统可以高效地实现完全清除蜡样芽胞杆菌生物被膜的目的，清洗快速、节能。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对清洗生物被膜的方法所描述的特征和优点，同样适用于该系统，在此不再赘述。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的不同浓度苯扎溴铵与酸碱清洗剂复合使用对蜡样芽孢杆菌生物被膜的平板计数结果；

图2显示了根据本发明一个实施例的蜡样芽孢杆菌生物被膜被不同浓度苯扎溴铵与酸碱清洗剂复合处理前后在共聚焦显微镜下的变化，其中a：未处理的生物被膜、b：按照处理1处理后的生物被膜、c：按照处理5处理后的生物被膜；

图3显示了根据本发明一个实施例的蜡样芽孢杆菌生物被膜内菌体经过苯扎溴铵处理后胞内蛋白质泄漏量示意图；

图4显示了根据本发明一个实施例的蜡样芽孢杆菌生物被膜内菌体经过苯扎溴铵处理后胞内离子的外泄量示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

1.材料

1.1实验菌株

蜡样芽孢杆菌，分离自乳制品工厂生产线。

1.2试剂

蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、胰蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢二钠、结晶紫等试剂均为分析纯，购自北京易秀博谷生物科技有限公司和科百奥生物技术公司。

1.3主要试剂的配制

营养琼脂培养基(ph7.2)：蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml，用于平板计数。

脑心浸出液培养基(ph7.4)：胰蛋白胨20g、氯化钠10g、磷酸氢二钠5g、葡萄糖4g、牛心浸出粉10g、蒸馏水1000ml，用于菌株的培养。

1.5％naoh溶液：称取1.5gnaoh溶解于100ml超纯水中。

1.0％hno3溶液：从65％的浓硝酸取0.769ml于100ml容量瓶中，加超纯水定容至100ml。

1.4实验仪器

立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司)

电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)

激光共聚焦显微镜(蔡司carlzeiss公司)

酶标仪(tecan公司)

电导率检测仪(上海雷兹公司)

实验例1

1.1药物配制

从50g/l的苯扎溴铵取10ml于100ml容量瓶中，加超纯水定容至100ml。将药物通过0.22μm滤膜，再用无菌水进行倍比稀释，供后续实验使用。

1.2菌液的配制

取在-20℃保存的蜡样芽孢杆菌，接种于脑心浸出液中，置于37℃恒温箱培养24h，培养三代(含菌量10⁸cfu/ml)后进行后续实验。

1.3苯扎溴铵对蜡样芽孢杆菌最小抑菌浓度(mic)

将菌液按1％的量接种到脑心浸出液中，混合液与苯扎溴铵按一定比例混合至苯扎溴铵的总浓度为25μg/ml，接着从配好的液体中取5ml后加入不含苯扎溴铵的脑心浸出液5ml。按此方法不断进行二倍稀释，获得的体系浓度分别为25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.5625μg/ml，再分别做只含培养基与只加菌液不含药物的两组对照，在37℃培养24h后，用酶标仪检测od值。每组做3个平行。

通过实验可以明显得出，苯扎溴铵的最小抑菌浓度为6.25μg/ml。

1.4苯扎溴铵及其与酸碱清洗剂复合使用对蜡样芽孢杆菌生物被膜的清除效果

1.4.1生物被膜的建立

将不锈钢片(1cm*1cm*1cm)用洗洁精清洗，置于2.00％氢氧化钠中超声15min，除去表而油脂，再置于1.00％硝酸中超声15min，以去除矿物质等无机离子。去用蒸馏水冲洗干净后置于75％的乙醇浸泡30min，蒸馏水冲净，烘干，灭菌备用。

将每一块不锈钢片放置于24孔板中，每一孔添加1ml的脑心浸出液培养基，并接种10μl菌液(菌密度达10⁸/ml)，在30℃培养72h，让蜡样芽孢杆菌在铁片表面生成一定量的生物被膜。

对形成的生物被膜的组成进行检测，其中含有48质量％的蛋白质、29质量％的多糖以及剩余少量的dna和脂质。

1.4.2生物被膜的清除

对在30℃培养72h不锈钢片上的生物被膜进行如下处理：

对照组：作为对照，不锈钢片上的生物被膜未进行任何处理。

处理组1：1.50％naoh，65℃，10min-水洗-1.00％hno3，65℃,10min-水洗

处理组2：1.50％naoh，65℃，10min-水洗-1.00％hno3，65℃，10min-pbs，65℃，10min-水洗。

处理组3：1.50％naoh,65℃，10min-水洗-1.00％hno3，65℃，10min-0.10％苯扎溴铵，65℃，10min–中和剂(0.3％的吐温-80和0.3％的卵磷脂混合液)-水洗。

处理组4：1.50％naoh，65℃，10min-水洗-1.00％hno3，65℃,10min-0.20％苯扎溴铵，65℃，10min–中和剂-水洗。

处理组5：1.50％naoh，65℃，10min-水洗-1.00％hno3，65℃，10min-0.30％苯扎溴铵，65℃，10min–中和剂-水洗。

处理组6：1.50％naoh，65℃，10min-水洗-1.00％hno3，65℃，10min-0.40％苯扎溴铵，65℃，10min–中和剂-水洗。

处理组7：1.50％naoh，65℃，10min-水洗-1.00％hno3，65℃，10min-0.50％苯扎溴铵，65℃，10min–中和剂-水洗。

处理完毕后，将不锈钢片放置于无菌的15ml的离心管中，内含0.5g直径为100μm的玻璃珠，在旋涡振荡器中以最大转速旋振1min后，在营养琼脂培养基上进行平板计数，结果以logcfu/cm²表示。每组实验做3个平行。

结果如图1所示，通过平板计数，菌落数随着苯扎溴铵浓度的增加而减少，当苯扎溴铵的浓度达到0.3％时，平板无菌落生长。经过spss软件分析，每个处理组与对照组存在显著性差异，p<0.05。

共聚焦显微镜是观察生物被膜的重要方法，通过对生物被膜进行pi染色，能够在确定生物被膜的形态、厚度的同时不破坏生物被膜的完整性。结果如图2所示，没有经过处理的生物被膜较厚，呈网状分布。经过处理后，生物被膜的厚度减少，当苯扎溴铵的浓度达到0.5％时，视野里基本看不到生物被膜。

以上两个实验说明苯扎溴铵及其与酸碱清洗剂复合使用对蜡样芽孢杆菌有很好的清除效果，且苯扎溴铵的浓度越高，作用效果越好。综合考虑，采用0.3～0.5质量％的苯扎溴铵溶液进行处理，其中，优选0.5质量％。

1.5苯扎溴铵对生物被膜内细菌活性的影响

菌体内蛋白质与离子的泄露量可以表征菌体细胞膜受损伤的程度，标志这细胞膜通透性的改变。蛋白质的泄漏量使用bca试剂盒来测定，其原理是，二价铜离子在碱性条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子会与bca钠盐特异性结合，产生紫色复合物，此复合物在570nm处的吸光值与蛋白质含量成正比。而离子的泄露量通过检测上清液的电导率来表征。

结果如图3和4所示，随着苯扎溴铵的浓度增大，菌体内蛋白质与离子的泄漏量会增加，说明细胞膜的通透性增加，苯扎溴铵能够渗透的生物被膜内部对蜡样芽孢杆菌进行抑制和杀灭作用。

对比例1

按照实施例1的方法的处理组7，区别在于，将苯扎溴铵替换为过氧化氢。

结果表明，采用过氧化氢不能将蜡样芽孢杆菌生物被膜完全清除，仅能降低5个数量级(菌数由10⁷降低至10²)。

对比例2

按照实施例1的方法的处理组7，区别在于，清洗方式如下：

0.50％苯扎溴铵，65℃，10min–1.50％naoh，65℃，10min-水洗-1.00％hno3，65℃，10min-中和剂-水洗。

结果表明，改变顺序后，无法完全清除蜡样芽孢杆菌生物被膜，只能降低6个数量级(菌数由10⁷降低至10¹)。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。