基于FOXD3基因的肺癌诊断剂及试剂盒的制作方法

本发明属于基因诊断领域，更具体地，本发明涉及一种用于肺癌检测的人foxd3基因甲基化的检测/诊断试剂以及含有该试剂的试剂盒。
背景技术：
：肺癌是起源于支气管粘膜、腺体或肺泡上皮的肺部恶性肿瘤。按照病理类型可以分为：1)小细胞肺癌(smallcelllungcancer，sclc)：一种特殊病理学类型的肺癌，有明显的远处转移倾向，预后较差，但多数病人对放化疗敏感；2)非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，nsclc)：除小细胞肺癌以外其他病理学类型的肺癌，包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等。在生物学行为和临床病程方面具有一定差异。按照发生位置又可以分为：1)中心型肺癌(centrallungcancer)：生长在肺段支气管开口及以上的肺癌；2)周围型肺癌(peripherallungcancer)：生长在肺段支气管开口以远的肺癌。近年来，人口老龄化、大气污染及吸烟等因素的影响，致使中国肺癌的发病率和死亡率逐年递增，根据国家癌症中心发布的《2017中国肿瘤登记年报》显示，全国每分钟约7人确诊患癌，其中肺癌发病率与死亡率均为第一位。中国已成为世界上肺癌人数最多的国家，专家预测到2025年中国肺癌的人数将达到100万。而根据流行病学研究显示：吸烟是引起肺癌的重要因素。世界上约80％-90％的肺癌可归因于吸烟。与非吸烟者相比，45-64岁每日吸香烟1-19支和20支以上者患肺癌的相对危险度分别为4.27和8.61，与从不吸烟者比较，长期每日吸烟1-19支和20支以上者死于肺癌的相对危险度分别为6.14和10.73。虽然肺癌的治疗技术日新月异，但5年生存率从4％仅上升至12％左右，现有的抗肿瘤药物仍只能起到缓解病情作用，患者无进展生存期平均仅延长3个月～5个月，但对于ⅰ期肺癌患者，手术后5年生存率高达约60％～70％。因此肺癌的早期诊断与早期手术是提高肺癌5年生存率、降低死亡率最有效的方法之一。肺癌目前的临床辅助诊断主要有以下几种，但是他们都不能完全做到早发现，早诊断：(1)血液生化检查：对于原发性肺癌，目前无特异性血液生化检查。肺癌病人血液碱性磷酸酶或血钙升高考虑骨转移的可能，血液碱性磷酸酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶或胆红素升高考虑肝转移的可能。(2)肿瘤标志物检查：1)cea：30％～70％肺癌患者血清中有异常高水平的cea，但主要见于较晚期肺癌患者。目前血清中cea的检查主要用于估计肺癌预后以及对治疗过程的监控。2)nse：是小细胞肺癌首选标志物，用于小细胞肺癌的诊断和监测治疗反应，根据检测方法和使用试剂的不同，参考值不同。3)cyfra21-1：是非小细胞肺癌的首选标记物，对肺鳞癌诊断的敏感性可达60％，根据检测方法和使用试剂的不同，参考值不同。(3)影像学检查：1)胸部x线检查：应包括胸部正位和侧位片。在基层医院，胸部正侧位片仍是肺癌初诊时最基本和首选的影像诊断方法。一旦诊断或疑诊肺癌，即行胸部ct检查。2)ct检查：胸部ct是肺癌的最常用和最重要的检查方法，用于肺癌的诊断与鉴别诊断、分期及治疗后随诊。ct引导下肺穿刺活检是肺癌的重要诊断技术，有条件的医院可将其用于难以定性的肺内病变的诊断，以及临床诊断肺癌需经细胞学、组织学证实而其它方法又难以取材的病例。近年来，多层螺旋ct和低剂量ct(ldct)是发现早期肺癌和降低死亡率的有效筛查工具，全美国家肺癌筛查研究(nlst)已经表明ldct相比胸部x线筛查可降低20％肺癌的死亡率。低剂量螺旋ct被推荐为早期肺癌筛查的重要手段，但是人为影响因素较多，假阳性率非常高。3)超声检查：主要用于发现腹部重要器官及腹腔、腹膜后淋巴结有无转移，也用于颈部淋巴结的检查。对于贴邻胸壁的肺内病变或胸壁病变，可鉴别其囊实性及进行超声引导下穿刺活检；超声还常用于胸水抽取定位。4)骨扫描：对肺癌骨转移检出的敏感性较高，但有一定的假阳性率。可用于以下情况：肺癌的术前检查；伴有局部症状的病人。(4)其它检查：1)痰细胞学检查：目前肺癌简单方便的无创诊断方法，连续涂片检查可提高阳性率约达60％，是可疑肺癌病例的常规诊断方法。2)纤维支气管镜检查：肺癌诊断中最重要的手段之一，对于肺癌的定性定位诊断和手术方案的选择有重要的作用。对拟行手术治疗的患者为必需的常规检查项目。而经支气管镜穿刺活检检查(tbna)，虽利于治疗前分期，但因技术难度和风险较大，有需要者应转上级医院进一步检查。3)其他：如经皮肺穿刺活检、胸腔镜活检、纵隔镜活检、胸水细胞学检查等，在有适应证的情况下，可根据现有条件分别采用以协助诊断。在临床实践工作中证明，任何肺癌筛查项目的成败取决于高危人群的识别，融合多重高危因素的风险预测模型已被世界公认是识别肺癌高危人群的方法之一。随着技术的飞速发展，肿瘤标志物检测成为继影像学诊断，病理诊断之后的肿瘤诊断治疗新领域，能够对肿瘤的诊断，检测，治疗产生重大的影响。肿瘤标志物可以在体液或者是组织中检测到，能够反映肿瘤的存在，分化程度，预后估计和个性化用药以及治疗效果等。早期肺癌患者没有明显的症状，难以被医生和患者察觉，再加之其在血液或生化项目上没有明显的特异性的标识物，因此难以通过常规的诊断方法进行早期发现和早期诊断，因此对肺癌早期诊断，尤其是大规模应用人群筛查上较为困难。越来越多的研究表明，在肿瘤形成过程中包含两大类机制。一个是通过dna核苷酸序列改变而形成突变，即遗传学机制。肿瘤作为一种遗传学疾病在分子生物学领域已经得到证实。另外一个就是表观遗传学(epigenetics)机制，即不依赖dna序列改变导致基因表达水平的变化，它在肿瘤形成过程中的作用越来越受到重视。遗传学与表观遗传学两种机制相互交叉存在，共同促进了肿瘤的形成。基因的异常甲基化在肿瘤发生的早期就可出现，并且在肿瘤逐步发展的过程中，基因异常甲基化的程度增加。对常见的98种人类原发肿瘤的基因组进行分析，发现每种肿瘤至少有600个异常甲基化的cpg岛。许多研究显示启动子异常甲基化在许多肿瘤的发生过程中是一个频发的早期事件，因此肿瘤相关基因的甲基化状态是肿瘤发生的一个早期敏感指标，被认为是一种有前景的肿瘤分子生物标志物(biomarker)。更为重要的是，癌变细胞可以释放dna到外周血中。正常人外周血中都存在纳克级的游离dna。研究发现外周血血浆/血清、肿瘤累及器官相关的体液(如唾液、痰等)中同样可以检测到肿瘤组织中存在的肿瘤相关基因的启动子异常甲基化。这些生物样品比较容易获得，并且通过pcr技术将其中的dna进行大量的扩增后能够很灵敏的检测到，因此检测其中某些肿瘤相关基因的启动子区甲基化状态，可以为肿瘤的早期诊断提供非常有价值的信息。与其它类型的肿瘤分子标记物相比，检测启动子异常甲基化有更多的优点。某一基因在不同类型肿瘤中，其启动子异常甲基化的区域是相同的，检测比较方便；另外与等位基因缺失这样的标志物相比，异常甲基化是一个阳性信号，很容易与正常组织中的阴性背景区分。esteller等检测了22例非小细胞肺癌(nsclc)的肿瘤组织和血清中p16、dapk、gstp1及mgmt等基因的启动子区异常甲基化状态，发现68％(15/22)的肿瘤组织中存在至少一种基因的启动子甲基化；而在15例组织阳性病例中，有11例同时在血清中也检测到了启动子异常甲基化的存在。另有许多研究者也分别从肝癌、头颈部癌、食管癌及结肠癌患者的肿瘤组织和血清中同时检测出了某些肿瘤相关基因的启动子甲基化。palmisano等检测了21例肺鳞癌患者的肿瘤组织和痰液中p16、mgmt启动子异常甲基化情况，发现所有痰样品中都存在一种或两种基因的启动子区异常甲基化。其中10例痰样是在肿瘤确诊后采集的；另11例痰样来自有吸烟史或其它暴露的高危人群，这11例监测对象在随后5～35月都被确诊为肺癌。而这21例痰样经痰细胞形态学检验为阳性的仅有4例。因此检测基因启动子区异常甲基化是一个非常敏感的指标。这些研究结果表明：dna甲基化的检测可以作为癌症的早期症断和风险评估的手段。早期肺癌患者往往无明显的症状和体征，很容易被患者忽视，很少因症就诊。临床常规的胸片x光和痰脱落细胞学检查远远达不到筛查早期肺癌的要求，均未被证实能降低死亡率。胸部x线的筛查漏检率可高达54％-90％，痰脱落细胞学检查虽然成本低，不需要昂贵设备，但是漏检率高，结果判断的人为因素干扰较多，而且需要多次送检。低剂量螺旋ct被推荐为早期肺癌筛查的重要手段，但是人为影响因素较多，假阳性率非常高。目前，有很多研究检测血液，痰液，肺泡灌洗液中的细胞或者dna甲基化状态，以期找到用于肺癌早期诊断的标志物。尽管现有技术中已经发现了一些基因的dna甲基化与肺癌相关，但是目前本领域中仍然需要进一步研究能够切实地应用的于肺癌诊断的相关基因，以及开发出具有较高检测准确性的检测试剂。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种foxd3基因的核酸片段在制备肿瘤检测/诊断试剂或试剂盒中的应用。本发明的另一个目的在于提供一种引物对在制备肿瘤检测/诊断试剂或试剂盒中的应用。本发明的另一个目的在于提供一种探针在制备肿瘤检测/诊断试剂或试剂盒中的应用。本发明的进一步目的在于提供一种诊断人foxd3基因甲基化的试剂、试剂盒和方法。本发明的进一步目的在于提供一种特异性强、敏感度高的肺癌检测/诊断试剂和试剂盒。本发明的进一步目的在于提供一种对肺癌应用范围广的肺癌检测/诊断试剂和试剂盒。本发明的进一步目的在于提供一种使用方便的肺癌检测/诊断试剂和试剂盒。本发明的上述目的通过以下技术手段实现：一方面，本发明提供了一种核酸片段在制备肿瘤检测/诊断试剂或试剂盒中的应用。其中，所述的核酸片段来源于foxd3基因，具体来源于foxd3基因位于1号染色体：63788730-63790797(以grch37作为参考)之间。具体地，所述的核酸片段选自seqidno：19、seqidno：21或seqidno：23。作为本发明中优选的实施方式，所述的核酸片段选自seqidno：19。另一方面，本发明还提供了一种引物对，所述的引物对选自seqidno：1和seqidno：2，seqidno：27和seqidno：28，seqidno：30和seqidno：31，seqidno：33和seqidno：34，seqidno：36和seqidno：37，seqidno：39和seqidno：40，seqidno：42和seqidno：43，seqidno：45和seqidno：46，seqidno：48和seqidno：49，seqidno：51和seqidno：52，seqidno：54和seqidno：55，seqidno：57和seqidno：58，seqidno：60和seqidno：61，seqidno：63和seqidno：64中所示的任意一条；优选地，所述的引物选自seqidno：1和seqidno：2，seqidno：27和seqidno：28，seqidno：30和seqidno：31，seqidno：33和seqidno：34，seqidno：36和seqidno：37，seqidno：51和seqidno：52所示的引物对；更优选地，所述的引物选自seqidno：1和seqidno：2，seqidno：27和seqidno：28，seqidno：30和seqidno：31，seqidno：33和seqidno：34，seqidno：36和seqidno：37所示的引物对。作为本发明中优选的实施方式，所述的引物选自seqidno：1和seqidno：2所示。另一方面，本发明还提供了一种探针，所述的探针选自seqidno：3、seqidno：29、seqidno：32、seqidno：35、seqidno：38、seqidno：41、seqidno：44、seqidno：47、seqidno：50、seqidno：53、seqidno：56、seqidno：59、seqidno：62、seqidno：65中任一所示；优选地，所述的核酸探针选自seqidno：3、seqidno：29、seqidno：32、seqidno：35、seqidno：38、seqidno：53；更优选地，所述的核酸探针选自seqidno：3、seqidno：29、seqidno：32、seqidno：35、seqidno：38。作为本发明中优选的实施方式，所述的核酸探针选自seqidno：3。另一方面，本发明还提供了上述的引物对或者探针在制备肿瘤检测/诊断试剂或试剂盒中的应用。另一方面，本发明提供了一种肿瘤检测/诊断试剂，该试剂含有foxd3基因的甲基化检测试剂。foxd3基因(forkheadboxd3)，叉头框d3基因，该基因属于叉头蛋白家族转录因子。有相关报道认为foxd3主要在胚胎干细胞或者是多能干细胞中表达，与胚胎发育和干细胞的多能性关系密切，是肿瘤干细胞的标记物成员。另外也有报道foxd3具有抑制癌症的作用。甲基化的发生是胞嘧啶上多了一个甲基，经过经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐处理后，胞嘧啶会变成脲嘧啶，因为在进行pcr扩增时尿嘧啶与胸腺嘧啶相似而会被识别为胸腺嘧啶，体现在pcr扩增序列上就是没有发生甲基化的胞嘧啶变成了胸腺嘧啶(c变成t)，甲基化的胞嘧啶(c)则不会发生变化。pcr检测甲基化基因的技术通常为甲基化特异性pcr(methylmionspecificpcr,msp)，针对处理后的甲基化片段(即片段中未改变的c)设计引物，进行pcr扩增，如果有扩增则说明发生了甲基化，无扩增则没有甲基化。进一步地，foxd3基因的甲基化检测试剂检测的是foxd3基因经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰后的序列。作为一种示范性的实施方式，检测foxd3基因经亚硫酸氢盐修饰后的序列。作为优选的实施方式，试剂所针对foxd3基因的检测区域具体来源于foxd3基因位于1号染色体：63788730-63790797(以grch37作为参考)之间。更优选地，所述的检测区域选自如seqidno：19、seqidno：21或seqidno：23所示；更为优选以seqidno：19作为检测区域。发明人经实验发现，foxd3基因检测区域的选择，会对肿瘤的检测效能产生影响。针对本发明涉及的foxd3基因，发明人进行了rrbs甲基化测序，得到了foxd3基因自身以及该基因上游5000bp内的碱基甲基化情况。经过初步的分析能够明显的发现该基因的不同区域的甲基化情况在肺癌和非肺癌对照组中明显的不同，因此选择不同的区域设计引物和探针对肺癌和非肺癌的诊断具有重要的影响。如图1所示，左侧方框的区域设计引物和探针在检测腺癌和鳞癌中都比较的好，而右侧的区域对腺癌的检测效果要比鳞癌好。虽然都在foxd3基因附近，但是显然选择左侧区域设计引物探针的效果要更好些。本发明的试剂中，含有扩增引物。作为优选的实施方式，所述的引物如seqidno：1和seqidno：2，seqidno：27和seqidno：28，seqidno：30和seqidno：31，seqidno：33和seqidno：34，seqidno：36和seqidno：37，seqidno：39和seqidno：40，seqidno：42和seqidno：43，seqidno：45和seqidno：46，seqidno：48和seqidno：49，seqidno：51和seqidno：52，seqidno：54和seqidno：55，seqidno：57和seqidno：58，seqidno：60和seqidno：61，seqidno：63和seqidno：64中所示的任意一条；优选地，所述的引物选自seqidno：1和seqidno：2，seqidno：27和seqidno：28，seqidno：30和seqidno：31，seqidno：33和seqidno：34，seqidno：36和seqidno：37，seqidno：51和seqidno：52所示的引物对；更优选地，所述的引物选自seqidno：1和seqidno：2，seqidno：27和seqidno：28，seqidno：30和seqidno：31，seqidno：33和seqidno：34，seqidno：36和seqidno：37所示的引物对；最优选地，所述的引物选自seqidno：1和seqidno：2所示的引物对。所述的引物用于扩增foxd3基因的特定区域。本领域公知，引物的成功设计对于pcr是至关重要。相对于一般的pcr，在基因的甲基化检测中，引物的设计影响更为关键，这是由于甲硫化反应促使dna链中的“c”转化为“u”，导致gc含量降低，使pcr反应后在序列中出现长的连续“t”，容易引起dna链的断裂，导致很难选择具有合适的tm值及稳定的引物；另一方面，为了区别硫化处理和没有硫化处理以及未完全处理的dna，需要引物有足够数量的“c”，这些都增加了选择稳定引物的困难。因此，dna甲基化检测中，引物所针对的扩增片段的选择，如扩增片段长短和位置，以及引物的选择等等都对检测的灵敏度和特异性产生影响。发明人经实验也发现，不同的扩增目的片段和引物对检测效果有所区别。很多时候，发现了某些基因或核酸片段在肿瘤和非肿瘤中具有表达差异，然而其距离转化为肿瘤的标志物，应用到临床中，仍存在很长的距离。其中最主要的原因是因为检测试剂的限制，导致该潜在肿瘤标志物的检测灵敏度和特异性难以满足检测需求，或者检测方法操作复杂、成本高，难以在临床中大规模应用。作为一种可选的实施方式，本发明的试剂盒中，还含有探针。作为优选的实施方式，所述的探针如seqidno：3、seqidno：29、seqidno：32、seqidno：35、seqidno：38、seqidno：41、seqidno：44、seqidno：47、seqidno：50、seqidno：53、seqidno：56、seqidno：59、seqidno：62、seqidno：65中任一所示；优选地，所述的核酸探针选自seqidno：3、seqidno：29、seqidno：32、seqidno：35、seqidno：38、seqidno：53；更优选地，所述的核酸探针选自seqidno：3、seqidno：29、seqidno：32、seqidno：35、seqidno中任一所示：38；最优选地，所述的核酸探针选自seqidno：3。作为一种优选的实施方式，本发明的试剂盒中，同时含有引物和探针，较佳的，所述的引物如seqidno：1和seqidno：2所示，同时，所述的探针如seqidno：3所示。作为一种可选的实施方式，所述的试剂含包括内参基因的检测试剂。作为优选的实施方式，所述的内参基因为β-actin、col2a1。作为一种优选的实施方式，所述的内参基因的检测试剂为针对内参基因的引物和探针。作为一种更为优选的实施方式，所述的内参基因的检测试剂为seqidno：16、seqidno：17所示的引物对和seqidno：18所示的探针。作为优选的实施方式，所述的试剂还包括亚硫酸氢盐、重亚硫酸氢盐或肼盐，以对foxd3基因进行修饰，当然可以不包括。作为优选的实施方式，所述的试剂含包括dna聚合酶、dntps、mg2+离子、缓冲液中的一种或几种，优选包括dna聚合酶、dntps、mg2+离子和缓冲液的pcr反应体系，用于对经修饰后的foxd3基因扩增。本发明的检测/诊断试剂所检测的样品可以选自肺泡灌洗液、组织、胸水、痰液、血液、血清、血浆、尿液、前列腺液或粪便。作为优选的实施方式，所述的样品选自肺泡灌洗液、组织、痰液；更优选地，所述样品选自肺泡灌洗液或痰液。本发明的检测/诊断试剂针对肿瘤选自肺癌组织和癌旁正常组织(或者良性肺部疾病组织)。另一方面，本发明还提供了包含上述检测/诊断试剂的试剂盒。另一方面，本发明还提供了一种检测foxd3基因的dna甲基化的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将待测样品进行亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐处理，获得经修饰的待测样品；(2)利用上述试剂或试剂盒对步骤(1)的经修饰的待测样品进行foxd3基因甲基化情况检测。作为优选的实施方式，步骤(2)中，采用实时荧光定量甲基化特异性聚合酶链反应进行检测。另一方面，本发明还提供了一种肺癌的检测/诊断系统。所述的系统含有：(1)foxd3基因的dna甲基化检测构件，以及，(2)结果判断系统；优选地，所述的foxd3基因的dna甲基化检测构件含有权利要求5-14所述任一所述试剂或试剂盒；优选地，所述的结果判断构件用于根据检测系统检测的foxd3基因的dna甲基化结果，输出肺癌的患病风险和/或肺癌类型；更优选地，所述的患病风险是根据通过结果判断构件比较待测样本与正常样本的甲基化结果，当待测样本与正常样本的甲基化具有显著差异或极显著差异时，结果判断构件输出待测样本患病风险高。作为优选的实施方式，若foxd3基因基因dna甲基化阳性，则表明待测样品的提供者为肺癌高危或肺癌患者。作为一种优选的实施方式，所述的阳性是指将所获得检测结果与正常样本的检测结果比较，当待测样本与正常样本的扩增结果具有显著或极显著的差异时，所述待测样本的供体呈阳性。本发明的有益效果：虽然，现有技术中，已经报道了foxd3基因甲基化可以作为肺癌的肿瘤标志物之一。然而，有关肺癌的肿瘤标志物的报道，不计其数，真正能够用于临床中，作为肺癌检测的标志物的却少之又少。本发明针对foxd3基因的检测试剂对肺癌具有很高的灵敏度和特异性，十分有希望作为肺癌临床诊断的肿瘤标志物。foxd3基因对肺癌具有很高的灵敏度和特异性是基于本发明优化的foxd3基因的甲基化的检测区域以及检测试剂，才能使得该标志物在组织标本中能够达到特异性为95％，敏感性77％的肺癌检出率。其中鳞癌检出率达到91.3％；在最难检出的腺癌中，腺癌检出率为73.1％，大细胞癌能全部检出。目前市面上已有基于shox2基因的肺癌检测试剂盒。在本发明的一个实施例中，对痰液标本进行检测，无论将肺癌作为一个整体进行比较分析，还是按照肺癌的亚型进行比较分析，foxd3的检测效果都要优于shox2基因的检测效果。特别是对腺癌的检测效果，foxd3检出率为22.2％，而shox2基因检出率为0％。在本发明的另一个实施例中，对肺泡灌洗液进行检测，将肺癌作为一个整体进行比较分析，foxd3的检出率为61.9％，远远高于shox2的47.6％，按照肺癌的亚型进行比较分析，鳞癌组foxd3的检测结果比shox2的要高出16.7％。特别是对腺癌的检测效果，其灵敏性达到54.5％，远远高于shox2的36.4％。此外，本发明的检测标志物针对不同类型的肺癌，包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌中的鳞癌、腺癌、大细胞癌均具有很高的特异性和灵敏度，其适用范围广，基本上能作为所有肺癌的肿瘤标志物。而现有的用于临床的肺癌标志物，其一般仅能适用于一类肺癌的检测，如nse用于小细胞肺癌的诊断和监测治疗反应，而cyfra21-1是非小细胞肺癌的首选标记物。本发明提供的含有foxd3基因的检测试剂和方法能非常方便、准确地判断出肺癌和肺部良性疾病患者，该基因的检测方法有望转化为基因检测试剂盒，并服务于肺癌的筛查、临床检测和预后监测。附图说明图1针对foxd3不同的区域设计引物和探针的检测效果比较图2foxd3、six3、pcdhga12、hoxd8、gata3五个候选基因检测肺癌的roc曲线图3foxd3基因在对照组和肺癌组的甲基化程度图4foxd3基因在临床组织标本中检测肺癌的roc曲线图5foxd3和shox2基因在痰液样本中检测的roc曲线图6foxd3和shox2基因在灌洗液样本中检测的roc曲线具体实施方式以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。实施例1：检测靶基因的选择甲基化dna作为检测靶标具有明显的优点，相比蛋白质类标志物，dna是可以扩增的，并且很容易检测到；与突变类标志物相比，dna发生甲基化的部位都位于基因的特定部位，一般在启动子区，使检测变得更容易和方便。为了完成本发明，发明人筛选了数百个基因，并从中选择出较好的foxd3、six3、pcdhga12、hoxd8、gata3作为候选的检测基因，β-actin基因作为内参基因，研究各个基因甲基化位点分布情况，设计检测的引物探针分别用于检测。各基因检测引物探针如下：foxd3的检测引物和探针为：seqidno：1foxd3引物f：cgtcgggatcggattttttcseqidno：2foxd3引物r：tctcgactcaaaaaccgaccgseqidno：3foxd3探针：fam-cggttttttgcgttaaggttag-bq1six3的检测引物和探针为：seqidno：4six3引物f：cgttttatatttttggcgagtagcseqidno：5six3引物r：actccgccaacaccgseqidno：6six3探针：fam-cggcggcggcgcgggaggcgg-bq1pcdhga12的检测引物和探针为：seqidno：7pcdhga12引物f：ttggtttttacggttttcgacseqidno：8pcdhga12引物r：aaattctccgaaacgctcgseqidno：9pcdhga12探针：fam-attcggtgcgtataggtatcgcgc-bq1hoxd8的检测引物和探针为：seqidno：10hoxd8引物f：ttagtttcggcgcgtagcseqidno：11hoxd8引物r：cctaaaaccgacgcgatctaseqidno：12hoxd8探针：fam-aaaacttacgatcgtctaccctccg-bq1gata3的检测引物和探针为：seqidno：13gata3引物f：tttcggtagcgggtattgcseqidno：14gata3引物r：aaaataacgacgaaccaaccgseqidno：15gata3探针：fam-cgcgtttatgtaggagtggttgaggttc-bq1β-actin的检测引物和探针为：seqidno：16β-actin引物f：ttttggattgtgaatttgtgseqidno：17β-actin引物r：aaaacctactcctcccttaaaseqidno：18β-actin探针：fam-ttgtgtgttgggtggtggtt-bq1样本信息：肺石蜡组织样本共计36例，其中作为对照的肺组织标本共11例，包括4例癌旁正常组织和7例良性肺部疾病组织；癌组织样本25例，包括鳞癌4例，腺癌21例.试验过程：a.收集确诊为肺癌或者良性疾病肺部的手术切除标本，用石蜡进行包埋，进行病理组织切片染色，鉴定其组织类型和纯度。组织切片使用magen的dna提取试剂盒(hipureffpednakit，d3126-03)来提取dna。b.使用zymoresearch生物公司的dna转化试剂盒(ezdnamethylationkit，d5002)进行dna的亚硫酸氢盐修饰。c.扩增检测体系和检测体系如表1-2：表1配液体系表2pcr反应过程d.利用标准曲线计算基因在标本中的甲基化拷贝数，采用比值＝拷贝数/actb拷贝数*100来进行判断两组组织的甲基化程度，最后选取一个阈值作为判断癌症组和对照组的标准，换算后的比值超过设定阈值可判断为阳性，等于或小于设定阈值可判断为阴性。根据此标准，36例组织标本的检测结果如表3-4：表3组织中的检测结果注：“+”表示检测结果为阳性样本；“-”表示检测结果为阴性样本表4统计结果所有对照组的标本均可判定为foxd3甲基化阴性，而25例肺癌标本中，21例被判定为阳性，只有3例肺腺癌和1例肺鳞癌被判定为阴性。foxd3基因的检测敏感性是84％，特异性为100％，阳性检出率远高于另外4个基因。提示foxd3基因在对肺癌临床检测诊断中具有重要的意义。foxd3、six3、pcdhga12、hoxd8、gata3五个候选基因检测肺癌的roc曲线如图2，foxd3基因检测的roc曲线下面积是0.916。因此，发明人选择foxd3为候选基因，对其检测条件进行了优化，并扩大检测范围，重新收集了122对肺癌组织样本及其对应癌旁组织作为非肺癌对照，合共244例肺石蜡组织标本。其中包括23例鳞癌，93例腺癌，3例大细胞癌，1例混合性癌，2例未明确诊断肺癌类型。具体见实施例2。实施例2：foxd3基因在临床标本中的检测a.检测引物探针如下：foxd3的检测引物和探针为：seqidno：1foxd3引物f：cgtcgggatcggattttttcseqidno：2foxd3引物r：tctcgactcaaaaaccgaccgseqidno：3foxd3探针：fam-cggttttttgcgttaaggttag-bq1β-actin的检测引物和探针为：seqidno：16β-actin引物f：ttttggattgtgaatttgtgseqidno：17β-actin引物r：aaaacctactcctcccttaaaseqidno：18β-actin探针：fam-ttgtgtgttgggtggtggtt-bq1b.样本信息：122对肺癌组织样本及其对应癌旁组织作为非肺癌对照，合共244例肺石蜡组织标本。其中包括23例鳞癌，93例腺癌，3例大细胞癌，1例混合性癌，2例未明确诊断肺癌类型。c.收集确诊为肺癌的手术切除标本，分离患癌组织和癌旁组织，分别用石蜡进行包埋，进行病理组织切片染色，鉴定其组织类型和纯度。组织切片使用magen的dna提取试剂盒(hipureffpednakit，d3126-03)来提取dna。d.使用zymoresearch生物公司的dna转化试剂盒(ezdnamethylationkit，d5002)进行dna的亚硫酸氢盐修饰。e.扩增检测体系和检测体系如表5-6：表5配液体系表6pcr反应过程f.检测结果利用标准曲线计算foxd3基因在标本中的甲基化拷贝数，采用比值＝foxd3拷贝数/actb拷贝数*100来进行判断两组组织的甲基化程度，最后选取数值“13.8”作为判断癌症组和对照组的标准，换算后的比值超过“13.8”可判断为阳性，等于或小于“13.8”可判断为阴性。根据此标准，244例组织标本的检测结果如下：表7检测结果注：“+”表示检测结果为阳性样本；“-”表示检测结果为阴性样本表8统计结果上述结果表明，122对标本中，122例为肺癌标本，在特异性为95.0％的情况下，检出甲基化dna阳性94例，灵敏性为77.0％。其中鳞癌检出率达到91.3％，漏检2例；腺癌检出率为73.1％，大细胞癌能全部检出。从箱形图和散点图看(图3)，foxd3基因检测dna甲基化在肺癌组和非肺癌组有较明显的区分度。再次证明了foxd3基因可作为肺癌临床诊断的分子标志物。尤其是针对腺癌，其特异性达到了95.0％，灵敏度达到了73.1％，具有极高的临床应用价值。肺腺癌较容易发生于女性及不抽烟者，早期一般没有明显的临床症状，且腺癌周围型，由于支气管的树状生理结构，漏检率更高，因此对这部分的检测更加困难和有意义。且foxd3在组织标本中检测的roc曲线见图4，auc值为0.937。实施例3：foxd3基因在痰液标本中的检测大量文献显示shox2可用作检测肺癌的标志物，shox2在肺泡灌洗液、病变部位组织、胸水、痰液等样本中具有较高的检出率。为了验证foxd3的检测效果，本发明人同时检测foxd3与shox2基因在痰液中的检出效率。各基因检测引物探针如下：foxd3的检测引物和探针为：seqidno：1foxd3引物f1：cgtcgggatcggattttttcseqidno：2foxd3引物r1：tctcgactcaaaaaccgaccgseqidno：3foxd3探针p1：fam-cggttttttgcgttaaggttag-bq1shox2的检测引物和探针为：shox2_t_mf3引物f：tttaaagggttcgtcgtttaagtcshox2_t_mr3引物r：aaacgattactttcgcccgshox2_taq_p3_探针：fam-ttagaaggtaggaggcggaaaattag-bq1样本信息：测试痰样本共计60例，其中正常对照组样本31例，癌症组对照样本29例，29例癌症组样本中有鳞癌9例，小细胞癌6例，腺癌9例，大细胞癌1例，未明确分类的肺癌4例。试验过程：a.收集确诊为肺癌患者和非肺癌患者的痰液标本，使用dtt解稠后，离心取沉淀分离细胞，使用pbs洗涤2遍，然后使用magen的dna提取试剂盒(hipureffpednakit，d3126-03)提取dna。b.使用zymoresearch生物公司的dna转化试剂盒(ezdnamethylationkit，d5002)进行dna的重亚硫酸盐修饰。c.配液体系如表9：表9配液体系d.扩增体系如表10：表10pcr反应过程e.检测结果如下：利用标准曲线计算各基因在标本中的甲基化拷贝数，采用比值＝拷贝数/actb拷贝数*100来进行判断两组组织的甲基化程度，最后选取foxd3的阈值为8.9，shox2的阈值为5.1，作为判断癌症组和对照组的标准，换算后的比值超过设定阈值可判断为阳性，等于或小于设定阈值可判断为阴性。根据此标准，60例痰液标本的检测结果如表11：表11痰液标本检测结果注：“+”表示检测结果为阳性样本；“-”表示检测结果为阴性样本。f.结果分析表12统计结果从以上结果可以看出，无论将肺癌作为一个整体进行比较分析，还是按照肺癌的亚型进行比较分析，foxd3的检测效果都要优于shox2基因的检测效果。特别是对腺癌的检测效果，foxd3检出率为22.2％，而shox2基因检出率为0％，腺癌一般为周围型，由于支气管的树状生理结构，肺深部的脱落细胞更加难以通过痰液咳出，因此对这部分的检测更加困难和有意义。foxd3和shox2在痰液标本中检测的roc曲线见图5，foxd3的auc值为0.894，shox2的auc值为0.847。实施例4：foxd3基因在灌洗液标本中的检测样本信息：测试肺泡灌洗液样本共计79例，其中正常对照组样本58例，癌症组对照样本21例，21例癌症组样本中有鳞癌6例，小细胞癌4例，腺癌11例。试验过程：a.收集确诊为肺癌患者和非肺癌患者的肺泡灌洗液标本，离心分离细胞，然后使用magen的dna提取试剂盒(hipureffpednakit，d3126-03)提取dna。b.使用zymoresearch生物公司的dna转化试剂盒(ezdnamethylationkit，d5002)进行dna的亚硫酸氢盐修饰。c.配液体系同表9。d.扩增检测体系同表10。e.检测结果如下：利用标准曲线计算各基因在标本中的甲基化拷贝数，采用比值＝拷贝数/actb拷贝数*100来进行判断两组组织的甲基化程度，最后选取foxd3的阈值为2.6，shox2的阈值为0.6，作为判断癌症组和对照组的标准，换算后的比值超过设定阈值可判断为阳性，等于或小于设定阈值可判断为阴性。根据此标准，79例灌洗液标本的检测结果如表13：表13灌洗液标本检测结果注：“+”表示检测结果为阳性样本；“-”表示检测结果为阴性样本。表14统计结果从以上结果可以看出，同时检测foxd3和shox2，将肺癌作为一个整体进行比较分析，foxd3的检出率为61.9％，远远高于shox2的47.6％，按照肺癌的亚型进行比较分析，鳞癌组foxd3的检测结果比shox2的要高出16.7％。特别是对腺癌的检测效果，其灵敏性达到54.5％，远远高于shox2的36.4％。因为腺癌一般为周围型，由于支气管的树状生理结构，肺泡灌洗液不容易接触到肺深部的肺泡或者癌组织，因此对这部分的检测更加困难和有意义。foxd3和shox2在肺泡灌洗液标本中检测的roc曲线见图6，foxd3的auc值为0.791，shox2的auc值为0.784。综合实施例1-4，能够充分的说明foxd3在对肺癌检测诊断，尤其是应用痰液，肺泡灌洗液等生物样本上具有更好的检测效果。能够更加容易的应用于大规模的人群筛查。具有更加优越的社会经济学价值。实施例5：foxd3基因的区域、检测引物和探针的选择各种研究资料表明，同一个基因的甲基化状态和分布并不均匀，因此对于同一个基因来说，选择不同的区域设计的甲基化引物、探针检测体系对同一样本，同一肿瘤的诊断检测效能并不一样，甚至有时候选择的区域不合适造成对肿瘤完全没有诊断效果，表15列出了本发明实验过程中选则的foxd3基因的不同区域。表15foxd3基因不同区域的序列根据区域1、区域2和区域3设计不同的甲基化引物和探针，各引物探针信息见表16，其中组1、组2、组3、组4、组5是根据区域1设计的甲基化引物和探针；组6、组7、组8、组9、组10是根据区域2设计的甲基化引物和探针；、组11、组12、组13、组14是根据区域3设计的甲基化引物和探针。所有的引物和探针均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。表16根据foxd3基因的不同区域设计的引物和探针在36例肺组织样本检测表16中14组引物探针组合，其中正常组织样本11例，癌组织样本25例，25例癌症组样本中有鳞癌4例，腺癌21例。检测结果如表17。样品处理、检测结果判断、统计方式同实施例1；pcr配液体系、反应过程为本领域常规操作。表17不同引物探针组合在组织中的检测结果所处区域组别引物探针组合特异性灵敏性区域1组1foxd3-f1,foxd3-r1,foxd3-p1100％84％区域1组2foxd3-f2,foxd3-r2,foxd3-p2100％68％区域1组3foxd3-f3,foxd3-r3,foxd3-p3100％80％区域1组4foxd3-f4,foxd3-r4,foxd3-p4100％72％区域1组5foxd3-f5,foxd3-r5,foxd3-p5100％84％区域2组6foxd3-f6,foxd3-r6,foxd3-p6100％40％区域2组7foxd3-f7,foxd3-r7,foxd3-p7100％40％区域2组8foxd3-f8,foxd3-r8,foxd3-p8100％52％区域2组9foxd3-f9,foxd3-r9,foxd3-p9100％48％区域2组10foxd3-f10,foxd3-r10,foxd3-p10100％68％区域3组11foxd3-f11,foxd3-r11,foxd3-p11100％64％区域3组12foxd3-f12,foxd3-r12,foxd3-p12100％52％区域3组13foxd3-f13,foxd3-r13,foxd3-p13100％36％区域3组14foxd3-f14,foxd3-r14,foxd3-p14100％40％结果显示，结果显示组1、组2、组3、组4、组5、组10均有较高的检出率。但无论采用本发明设计的何种引物和探针，区域1的检测灵敏度最低也可达到68％，最高达到84％，检出率都高于针对区域2和区域3设计的几对引物，因此，区域1的检出率明显较其他区域高(见表17)。实施例6引物和探针组合的选择为了进一步验证不同引物和探针的组合在痰液中的检出率，发明人选取了22例痰液标本，采用表16中的引物和探针进行验证，其中包括7例正常对照，15例肺癌对照，15例肺癌中有鳞癌7例，腺癌7例，大细胞癌1例，检测结果如表18。样品处理、检测结果判断、统计方式同实施例3；pcr配液体系、反应过程为本领域常规操作。表18在痰液中的检测结果从22例痰液标本的检测结果显示，组1：foxd3-f1,foxd3-r1,foxd3-p1的检出率最高，达到73.3％。虽然在组织样本中，组1和组5的灵敏度都达到84％，但针对痰液检测样本，组5的灵敏度却大幅下降至53.3％，这也从一方面证实了针对痰液样本，设计具有高灵敏度的检测试剂尤其不易。最终，根据各组引物探针的检测结果，最优选的引物探针序列为组1的组合：foxd3-f1，foxd3-r1，foxd3-p1。序列表<110>广州市康立明生物科技有限责任公司<120>基于foxd3基因的肺癌诊断剂及试剂盒<160>71<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cgtcgggatcggattttttc20<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tctcgactcaaaaaccgaccg21<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cggttttttgcgttaaggttag22<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cgttttatatttttggcgagtagc24<210>5<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5actccgccaacaccg15<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6cggcggcggcgcgggaggcgg21<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ttggtttttacggttttcgac21<210>8<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8aaattctccgaaacgctcg19<210>9<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9attcggtgcgtataggtatcgcgc24<210>10<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10ttagtttcggcgcgtagc18<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11cctaaaaccgacgcgatcta20<210>12<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12aaaacttacgatcgtctaccctccg25<210>13<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13tttcggtagcgggtattgc19<210>14<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14aaaataacgacgaaccaaccg21<210>15<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15cgcgtttatgtaggagtggttgaggttc28<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16ttttggattgtgaatttgtg20<210>17<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17aaaacctactcctcccttaaa21<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18ttgtgtgttgggtggtggtt20<210>19<211>348<212>dna<213>homosapiens<400>19agcccgacatctagccggtctccggcaggaccctgcaccgcgtcgggatcggacccttcc60gctggggcggcctcctgcgtcaaggccagcaggaaccttcctgtcgccctccccggccgc120cgcttcgcctccttcccgcccccggaggttgtgcaggcgctatggtccgcctggagggag180aaagccggcggccggttcctgagccgagagcggccgcggaaaaatcctctgcctccgctg240gaaatcgatattaggccggcgcgggcgcgggacgtcggggccgcagccagtaggttgtgc300acgtctcatcatttagctaatcgagtcgaaaagtttctgtaagggccg348<210>20<211>348<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20agttcgatatttagtcggttttcggtaggattttgtatcgcgtcgggatcggattttttc60gttggggcggttttttgcgttaaggttagtaggaatttttttgtcgtttttttcggtcgt120cgtttcgtttttttttcgttttcggaggttgtgtaggcgttatggttcgtttggagggag180aaagtcggcggtcggtttttgagtcgagagcggtcgcggaaaaattttttgttttcgttg240gaaatcgatattaggtcggcgcgggcgcgggacgtcggggtcgtagttagtaggttgtgt300acgttttattatttagttaatcgagtcgaaaagtttttgtaagggtcg348<210>21<211>476<212>dna<213>homosapiens<400>21ctgagctccgtggcagcccccgaacaccctcatcgcccgctgccccctccccgccgccgc60taccaaccccgaggagggatgaccctctccggcggcggcagcgccagcgacatgtccggc120cagacggtgctgacggccgaggacgtggacatcgatgtggtgggcgagggcgacgacggg180ctggaagagaaggacagcgacgcaggttgcgatagccccgcggggccgccggagctgcgc240ctggacgaggcggacgaggtgcccccggcggcaccccatcacggacagcctcagccgccc300caccagcagcccctgacattgcccaaggaggcggccggagccggggccggaccggggggc360gacgtgggcgcgccggaggcggacggctgcaagggcggtgttggcggcgaggagggcggc420gcgagcggcggcgggcctggcgcgggcagcggttcggcgggaggcctggccccgag476<210>22<211>476<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22ttgagtttcgtggtagttttcgaatatttttatcgttcgttgtttttttttcgtcgtcgt60tattaatttcgaggagggatgatttttttcggcggcggtagcgttagcgatatgttcggt120tagacggtgttgacggtcgaggacgtggatatcgatgtggtgggcgagggcgacgacggg180ttggaagagaaggatagcgacgtaggttgcgatagtttcgcggggtcgtcggagttgcgt240ttggacgaggcggacgaggtgttttcggcggtattttattacggatagttttagtcgttt300tattagtagtttttgatattgtttaaggaggcggtcggagtcggggtcggatcggggggc360gacgtgggcgcgtcggaggcggacggttgtaagggcggtgttggcg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