一种用于检测大麦黄花叶病的引物组合物、方法及应用与流程

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测大麦黄花叶病的引物组合物、方法及应用。

背景技术：

大麦黄花叶病是欧洲和东亚等冬大麦产区的重要病害之一，根据发病程度和发病时间不同，在感病田中感病大麦品种平均减产10％-50％，严重威胁欧亚地区冬大麦粮食生产。大麦黄花叶病是一种土传病毒病害，由大麦黄花叶病毒(barleyyellowmosaicvirus，baymv)和大麦温和花叶病毒(barleymildmosaicvirus，bammv)单独或者两者共同感染引起，这两种病毒均属于马铃薯y病毒科。大田条件下，baymv和bammv寄生在土壤中的禾谷多黏菌的休眠孢子中，由于土壤耕种、风吹土壤颗粒、含有游动孢子的水分短距离运输，病毒随着真菌孢子的传播从而完成在不同植株和不同地域之间的传播过程。在自然条件下，baymv和bammv通常在秋季感染幼苗根部，来年早春最先在植株新叶中出现典型的花叶病症，随着病斑不断增多导致叶片黄化、植株矮小、分蘖少、植株发育迟缓，或早枯或不抽穗结实。由于禾谷多黏菌休眠孢子在土壤中能够存活10年以上，在外界环境适宜的情况下，携带病毒的休眠孢子萌发再次感染寄主植物，因而该病成为一种长期、持久的病害胁迫。推广抗性品种是当前各个发病地区抗大麦黄花叶病的主要途径，baymv和bammv的准确鉴定是首要的关键一步，对于筛选和鉴定抗病性品种至关重要，因而对于大麦抗病性育种和大麦粮食生产具有重要价值。目前，baymv和bammv病毒检测方法主要有大田病叶的病斑观察、双夹心酶联免疫吸附测定(das-elisa)检测、反转录-环介导等温扩增技术(rt-lamp)检测和普通逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)检测技术等。

大田表型观察具有以下缺点：其一，病症受环境影响，和早春冬害、盐害的表型近似，表型观察准确性差；其二，感染病毒的植物不一定出现可见的病症；其三，人为主观因素影响对病症判断。因此，该方法的假阳性和假阴性均很高。das-elisa检测技术具有以下缺点：其一，该检测方法的前提是具有特异性抗体，但是国内没有商业化的病毒抗体，提前合成特异性抗性周期特别长，价格特别高；其二，该方法可以检测病毒是否存在，但是不能区分病毒株系之间的序列(或者毒性)差异；其三，该检测方法的灵敏性和准确性受到抗血清质量的影响，其灵敏性不如pcr检测技术。rt-lamp检测技术具有以下缺点：其一，该检测方法需要采用多种生物和生化试剂，检测成本高；其二，采用病毒rna为检测模板，由于受rna稳定性差和引物特异性的影响，导致病毒检测的重复性差；其三，只能检测病毒有和无，不能区分病毒的不同株系的序列(毒性)差异。普通rt-pcr检测方法具有以下缺点：其一，对baymv和bammv分别进行pcr反应，工作量是多重逆转录聚合酶链式反应检测方法的2倍；第二，没有来源于植物的内参基因，不能判断检测样品的rna质量，从而导致鉴定结果准确性降低。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的旨在提供一种基于多重逆转录聚合酶链式反应的baymv病毒和bammv病毒检测方法，用以检测大麦黄花叶病致病病毒的流行区域和遗传变异、大麦品种的抗病性鉴定和抗病性品种培育，该方法具有检测准确性高、灵敏性高、检测速度较快、检测成本较低等特点。

为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种用于检测大麦黄花叶病的引物组合物，所述的引物组合物包括：

hvactin-f：gtgtgatgtggatatcaggaagg；

hvactin-r：ttagaagcacttccggtgga；

ymv-cp-f2：gcagatggtaactggagcgtg；

ymv-cp-r：ttaggttagttctgggtgtccatc；

mmv-resk-58：gattgcatactcaggtggagag；

mmv-vpg-rev：ctgtatgtgcgcaggagctat。

所述的大麦黄花叶病由大麦黄花叶病毒(baymv)或大麦温和花叶病毒(bammv)单独或者两者共同感染引起。

所述的引物组合物用于鉴定大麦黄花叶病毒或大麦温和花叶病毒的应用也在本发明的保护范围之内。

在本发明的另一方面，本发明提供一种用于检测大麦黄花叶病的方法，包括以下步骤：

1)获取目标样本，并提取样本rna；

2)以提取的样本rna为模板，反转录出cdna；

3)以获得的cdna为模板，以上述引物组合物进行pcr扩增；

4)将扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳法分析。

进一步的，所述的步骤(3)的反应体系为20μl：cdna模板2.0μl，10xtaqbuffer(+mg²⁺)2.0μl，dntpmix(10mm)0.4μl，引物各0.4μl，taqdnapolymerase(5u/μl)0.2μl，ddh2o12μl。

进一步的，步骤(3)的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃复性20s，72℃延伸1min，32个循环；72℃充分延伸5min，12℃保存。

本发明方法同样适用于鉴定大麦黄花叶病毒或大麦温和花叶病毒。

在本发明的另一方面，本发明还提供了所述的引物组合物在作为制备用于检测大麦黄花叶病试剂盒中的应用。

上述所述的试剂盒也在本发明的保护范围之内，所述的试剂盒包含所述的引物组合物。

在本发明的另一方面，本发明提供了所述的引物组合物或试剂盒用于选择抗大麦黄花叶病毒和(或)大麦温和花叶病毒的大麦植株，在今后辅助培育抗大麦黄花叶病品种中具有广阔的应用前景。

本发明的有益效果为：

长江中下游冬大麦产区是我国最主要的大麦生产基地，大麦黄花叶病是该区域最主要的病害，该病害的发生严重影响啤酒大麦和饲料大麦的高产稳产，成为我国啤酒大麦产业和啤酒生产原料供给的主要不稳定因素之一，严重影响我国饲料大麦供给。培育抗病性大麦品种是预防该病害发生的最佳手段，其首要前提就是实现病原(baymv和bammv病毒)的准确鉴定。本发明技术方案提供了一种针对baymv和bammv病毒的检测方法，具有鉴定准确性高、灵敏性高、检测速度较快、检测成本较低等特点，结合一代测序技术也可以实现病毒株系序列变异的初步划分。因而，该multi-rt-pcr检测方法可以实现病毒的准确鉴定，对于检测病毒分布和流行区域、培育抗病性大麦品种具有重要意义。

附图说明

图1是实施例1本发明方法检测的电泳图；其中1、2样品只感染baymv；3、4样品只感染bammv；5、6样品感染baymv和bammv；7、8样品为抗病品种；9是baymv和bammv的混合质粒(阳性对照)；10是h2o(阴性对照)；

图2是实施例3检测本发明中三对引物灵敏性的电泳图；以感病大麦样本的cdna为实验材料，1-8依次按比例进行稀释：1:10，1:50，1:250，1:1250，1:6250，1:31250，1:156250，1:781250；9试验样本是baymv和bammv的混合质粒，作为阳性对照；10试验样本是ddh2o，作为阴性对照；

图3是实施例4检测本发明中三对引物实用性的电泳图，其中1-94是待检测的大麦样本；95试验样本是baymv和bammv的混合质粒，作为阳性对照；96试验样本是ddh2o，作为阴性对照。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种用于检测大麦黄花叶病的方法，具体包括以下步骤：

1)获取目标样本，并提取样本rna

a.将研钵及装样勺进行酒精火烤(去除rnaase)用于研磨样品，研磨样品前所用东西都要提前预冷，磨完后装入相应的ep管中。

b.在ep管中分别加入1ml的trizolreagent，涡旋仪震荡混匀，室温放置5min。

c.分别加入0.2ml(1/5体积的trizolreagent)的三氯甲烷，手动摇晃15s混匀。

d.在4℃离心机下12000g离心15min。

e.吸取700μl的上清于新的rnaasefree的ep管中，随后马上加入600μl的异丙醇，室温静置10min。

f.在4℃离心机下12000g离心10min。

g.倒掉上清，加入75％乙醇(利用rnaasefreeh2o配制)室温漂洗2min后洗净上清。

h.室温干燥，至沉淀微微透明，加rnaasefreeh2o(提前65℃温育一下)溶解吹打。

i.nanodrop测定提取的rna浓度，利用1％(w/v)的琼脂糖凝胶进行电泳跑胶，检测提取质量(2μlrna样品+8μl水+2μlloadingdye上样，采用‘5000+dnaladder’作为片段大小指示，180v电压电泳20min)，备用。

2)以提取的样本rna为模板，反转录出cdna

利用rtkitwithgdnaeraser试剂盒(北京金百特生物技术有限公司)合成待检测样品的cdna。将检测样品rna浓度调到1μg/μl，取1μl总rna合成cdna。操作步骤如下：

a.使用pcr管在pcr仪上进行：totalrna1.0μl，4xgdnaerasermix4.0μl，rnaasefreeh2o11.0μl；

b.轻轻混匀，37℃孵育5min；

c.瞬间离心收集反应液，置冰上，继续在同一管中加入5xrtmastermix4.0μl；

d.25℃10min，42℃30min，85℃5sec，将反转出来的cdna稀释5倍，保存至-20℃待用。

3)以获得的cdna为模板，设计进行pcr扩增；

根据baymv外壳蛋白基因编码序列、bammv编码序列设计病毒特异性引物以及内参基因hvactin引物，引物序列见表1。

表1文中所用引物详述

multi-rt-pcr技术的反应体系(总体系：20μl)：

multi-rt-pcr技术的反应程序：

4)将扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳法分析。

用1％(w/v)的琼脂糖凝胶进行电泳跑胶，10μl扩增产物+2μlloadingdye上样，采用‘5000+dnaladder’作为片段大小指示，180v电压电泳30min，结果如图1所示。

实施例2特异性实验

选取8个已知病毒感染情况的大麦样本开展multi-rt-pcr，实验过程如实施例1所示，实验结果如图1(见附图说明)，鉴定出2个样本兼抗baymv和bammv，2个样本只感染了baymv，2个样本只感染了bammv，2个样本同时感染了baymv和bammv。该检测结果与预测结果完全符合，体现了本文中三对引物的检测特异性和本发明实验方法的准确性，可用于准确鉴定抗黄花叶病的大麦样本。

实施例3灵敏性实验

以感病大麦样本的cdna为实验材料，样品按1:10，1:50，1:250，1:1250，1:6250，1:31250，1:156250，1:781250比例依次稀释，使用实施例1中的实验过程，实验结果如图2(见附图说明)。由此可见，在稀释比例为1:1250也可以检测到病毒条带，说明本专利三对引物的灵敏性非常高。

实施例4

使用实施例1中的实验过程，对种植于大麦黄花叶病病圃中的94个大麦样本，在大田发病期取样后进行病毒检测，如图3所示，鉴定出37个样本为兼抗baymv和bammv样本(检测到一个片段，277bp；样品编号2，4，6，7，9，10，11，17，21，25，27，28，35，38，40，45，53，54，55，59，61，62，65，66，71，73，74，76，77，80，84，86，88，90，91，92，94)；2个样本感染bammv(检测到两条片段，277bp和940bp；样品编号19，29)；34个样本感染baymv(检测到两个片段，277bp和648bp；样品编号1，3，5，12，13，14，16，18，20，22，23，24，33，36，37，41，42，44，46，48，51，52，57，58，63，64，67，69，75，79，83，87，89，93植株)；20个样本同时感染baymv和bammv两种病毒(检测到三个片段，277bp，648bp和940bp；样品编号8，15，26，30，32，34，39，43，47，49，50，56，60，68，70，72，78，81，82，85)；1个样本结果待定(样品编号31，未检测出内参片段277bp，显示样品rna质量检测不过关)。

鉴定出37个样本兼抗baymv和bammv，属于大麦黄花叶病抗病性遗传材料；56个样本感染baymv和/或bammv，属于大麦黄花叶病感病性遗传材料；1个样本没有检测到内参基因，显示该样本rna质量异常。该实施例充分表明了本发明中三对引物的检测灵敏性及本发明multi-rt-pcr技术的实用性，可用于检测待测样本是否感染大麦黄花叶病。

实施例5

multi-rt-pcr技术检测大麦黄花叶病病毒试剂盒(50次)，该试剂盒包括6条检测引物、baymv/bammv混合质粒，taqdnapolymerase和taqbuffer，dntpmix和ddh2o。

表1试剂和试剂体积

检测过程如实施例1，实例运用结果如图1和图2。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。