异源生产线性三萜的方法与流程

本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种生物合成线性三萜类化合物的方法。

背景技术：

三萜类化合物是分布最广的天然产物，是一类结构多样，成员数目近20000个的c30化合物(sumit,2016)。根据其结构差异，三萜类化合物可分为线性三萜(角鲨烯型)和环状三萜(如羊毛甾烷型、油烷型、熊烷型、芦丁烷型)。三萜类化合物具有许多有前途的生物活性，包括抗癌、抗氧化、抗炎等(malwina,2015)。其中许多线性三萜，因含有多个非共轭双键，具有较强抗氧化活性(farvink,2007)。在提高体内超氧化物歧化酶(sod)活性、增强机体免疫力、药物递送和皮肤护理方面都有特别重要的作用(bindubscm,2015)。因此，高效生产线性三萜引发了学术界和产业界的广泛关注。

线性三萜的前体角鲨烯可通过甲戊酸钠(mva)(chappell,1995)或甲基赤藓醇4-磷酸(mep)(rohmer,1999)途径产生。角鲨烯形成后，经过一系列后修饰，最终产生结构功能多样的线性三萜，这些后修饰主要由细胞色素p450(cytochromep450,cyp)催化完成(steven,2013)。由于参与线性三萜生物合成的cyp发现和相关研究非常有限，这极大阻碍了它们的高效生产和广泛应用。

蘑菇类真菌含有丰富多样的cyp，并且可以产生多种独特的三萜类化合物，在生态系统和人类营养与健康中发挥着重要作用(chenw,2014)。然而，由于基因操作的不成熟，其cyp的功能鉴定相对植物和原核生物的相关研究滞后(haoq,2017)。为了克服这一局限，我们以酿酒酵母作为筛选宿主，用于筛选参与线性三萜生物合成的关键cyp。选择酿酒酵母的其原因是：(1)酿酒酵母遗传操作简单，背景清楚(joshua,2018)；(2)它能天然产生线性三萜类化合物的直接前体——角鲨烯(genlinzhang,2015)；(3)它具有支持膜蛋白cyp功能的亚细胞器(如内质网)；(4)很少有内源性cyp对外源cyp产生干扰。

技术实现要素：

本发明提出一种生物合成线性三萜类化合物的方法，通过筛选线性三萜生物合成相关的cyp基因，并在酿酒酵母细胞异源表达，从而实现异源合成线性三萜。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一类线性三萜类化合物，其分子式及结构式包括：

化合物1：

化合物2：

化合物3：

本发明涉及一种灵芝线性三萜合成基因，即cyp505d13，其核苷酸序列如seqno.1所示，氨基酸序列如seqno.2所示。

cyp505d13编码的蛋白质cyp505d13属于cyp505家族，目前已报道的cyp505家族的成员催化的底物最长碳链仅为c20(baker,g.j.,girvan,h.m.,matthews,s.,mclean,k.j.,etal.,expression,purification,andbiochemicalcharacterizationoftheflavocytochromep450cyp505a30frommyceliophthorathermophila.acsomega2017,2,4705-4724；nakayama,n.,takemae,a.,shoun,h.,cytochromep450foxy,acatalyticallyself-sufficientfattyacidhydroxylaseofthefungusfusariumoxysporum.journalofbiochemistry1996,119,435-440；kitazume,t.,tanaka,a.,takaya,n.,nakamura,a.,etal.,kineticanalysisofhydroxylationofsaturatedfattyacidsbyrecombinantp450foxyproducedbyanescherichiacoliexpressionsystem.europeanjournalofbiochemistry2002,269,2075-2082.)，cyp505d13是首个发现与催化c30相关的cyp05家族成员，也是首个发现的后修饰线性三萜(c30)的cyp。

本发明涉及上述线性三萜类化合物的异源合成方法，通过将cyp505d13基因克隆到酵母表达质粒，并将酵母表达质粒转化至重组酿酒酵母中进行异源表达，从而实现线性三萜的异源生物合成。

所述的异源表达具体是指：通过pcr扩增cyp505d13基因的表达序列片段，以同源重组的方法将表达载体prs426、所述表达序列片段、酵母hxt7p启动子和酵母fba1t终止子重组连接，得到重组表达质粒，重组酵母可进行线性三萜的生产。

所述的转化，通过标准的醋酸锂转化法(gietzetal.,1991)进行发酵筛选，具体为：将表达质粒导入酿酒酵母，通过ypd培养基发酵，发酵产物经乙酸乙酯振荡萃取，随后减压蒸馏除去乙酸乙酯，剩余物用甲醇溶解，最后通过hplc分析观察。

所述的ypd培养基成分为酵母粉10g/l，牛肉蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l。

所述的重组酿酒酵母为基因工程改造后的by4742菌株yl-t3(by4742,δtrp1,δdna::ppgk1-thmg1-tadh1-ptef1-lys2-tcyc1,trp::his-ppgk1-erg20-tadh1-ptef1-erg9-tcyc1-ptdh3-erg1-ttpl1)，by4742菌株为本领域技术人员常用的一种商品化酵母宿主。在此基础上过表达了角鲨烯生物合成途径上游的thmg1基因、erg20基因、erg9基因和erg1基因，从而提高了线性三萜前体的合成量，其构建采用(wangetal.,biotechnolbioeng,2018,115(7):1842-1854)文献中的方法实现。

技术效果

与现有技术相比，本发明通过从灵芝基因组中挖掘到一个参与线性三萜合成的cyp505d13基因(gl17184)，利用合成生物学技术构建了酵母工程菌株，实现线性三萜类物质的异源生物合成。该技术为继续发现与线性三萜生物合成相关的关键酶和化合物，以及有效生物合成该类物质奠定了基础。

附图说明

图1为本发明表达载体prs426-hxt7p-cyp505d13-fba1t示意图；

图2为酵母转化菌株和对照菌株发酵第4天产物uplc分析图；

图中：a图蓝线为yl-t3-cyp505d13发酵第四天产物uplc结果；黑线为对照yl-t3-voidplasmid第四天产物uplc结果。b、c、d为cyp505d13导入后，三个典型的新产物ms图，分别为化合物1、化合物2、化合物3。

图3为表达cyp505d13的酵母转化株生长曲线及三种产物产量图。图中：a为生长曲线图；实线为yl-t3-cyp505d13，虚线为yl-t3-voidplasmid。b为产物(化合物1、化合物2、化合物3)积累图。三角形为化合物1，圆形为化合物2，方形为化合物3。

图4为化合物1的nmr谱图；a为¹hnmr谱图。b为¹³cnmr谱图。c为dept谱图。d为hmbc谱图。e为hmqc谱图。e为cosy谱图。

图5为化合物2的nmr谱图；a为¹hnmr谱图。b为¹³cnmr谱图。c为dept谱图。d为hmbc谱图。e为hmqc谱图。e为cosy谱图。

图6为化合物3的nmr谱图；a为¹hnmr谱图。b为¹³cnmr谱图。c为dept谱图。d为hmbc谱图。e为hmqc谱图。e为cosy谱图；

图7为本发明工艺路线示意图。

具体实施方式

实施例1

重组酵母菌株的构建

构建表达cyp基因的酵母菌株包括：

以灵芝5.616的cdna文库为模板，用引物gl17184-f/rpcr扩增得到cyp505d13的编码区序列(cds)片段，引物具体序列如序列表1所示；

随后将cds片段重组至表达载体prs426，并进行测序验证。得到重组质粒prs426hf-cyp505d13；

将重组质粒转化到酵母菌株yl-t3，从而获得表达cyp基因的酵母菌株yl-t3-cyp505d13。

所述的重组质粒prs426hf-cyp17184，具体通过以下方式得到：

i)通过smai线性化prs426质粒，随后在其两端引入酵母内源的hxt7p启动子和fba1t终止子。

所述的hxt7p启动子和fba1t终止子片段以酵母基因组为模板，并分别采用引物hxt7p-f/r，fba1t-f/rpcr获得，引物具体序列如序列表1所示：

表1：构建prs426hf-cyp17184表达质粒所用引物序列表

ii)将线性化的prs426质粒、hxt7p启动子和fba1t终止子通过同源重组酶连接，得到包含启动子和终止子的prs426hf质粒。将连接后的质粒通过pme1酶切线性化，然后和cyp505d13基因的cds片段重组连接，具体步骤如下：

a)连接体系：载体50ng、cyp基因片段50-200ng、ceiibuffer4μl、exnaseii2μl、蒸馏水补至20μl。混匀，37℃反应连接30min，后冰浴5min。

b)连接产物添加至50μldh5α感受态细胞中、冰上放置30min，42℃热激90s，加入800μl预冷的lb培养基，37℃孵育60min。随后涂布到含100ug/ml的amp抗性的lb平板，37℃培养箱过夜培养。

c)挑选阳性克隆接含100ug/mlamp抗性的4mllb试管，37℃220rpm过夜培养。

d)对上述试管培养的大肠杆菌细胞抽质粒后测序。比对测序结果，得到正确的重组质粒prs426hf-cyp505d13。

将上述得到的测序正确的重组质粒通过醋酸锂法(rdgietzetal.,yeast,1991)转化至酿酒酵母中。转化后的酵母涂布在sc-his-leu-ura(sc-hlu)固体培养基(无氨基酸酵母基础氮源6.7g/l；葡萄糖，20g/l；do-supplement-his-leu-ura3，0.65g/l；琼脂粉，2％)进行筛选。30℃培养箱3天，至转化子出现。

实施例2

发酵yl-t3-cyp505d13进行产物鉴定

yl-t3-cyp505d13发酵：2.1)将构建好yl-t3-cyp505d13酵母转化子进行ypd培养基发酵(1％酵母粉，2％牛肉蛋白胨，2％葡萄糖)，并以不含cyp基因的空质粒菌株作为对照，比较它们之间代谢产物的差异，具体操作如下：

2.1.1)转化子的发酵培养。将阳性转化子接种至4mlsc-hlu的种子培养试管，30℃，220rpm培养约30h，吸取1ml培养的种子，转接至50ml的ypd培养基中，30℃、220rpm发酵培养。

2.1.2)发酵培养第4天，取20ml发酵液加20ml乙酸乙酯220rpm振荡30min。5000rpm，5min离心并吸取上层有机相，转移至旋蒸瓶，旋转蒸发仪40℃，-0.09mpa旋干乙酸乙酯，加600μl甲醇溶解剩余物，12000rpm离心10min，uplc分析发酵产物。

通过和空质粒对照菌株发酵产物uplc峰图对比，观察发现当在酵母中导入了包含cyp505d13的重组质粒后，该重组菌株在uplc峰图上和对照有明显不同(图2)。

实施例3

酵母转化株的发酵产物测定与动态积累过程

3.1)发酵产物的高效液相色谱分析方法：

仪器：安捷伦1200分析型hplc；色谱柱：安捷伦zorbaxsbc18反相色谱柱(5um，4.6x250mm)

柱温：30℃；流速：1ml/min；进样量：20μl；

a相：甲醇(含0.1％乙酸)，b相：纯水；

梯度洗脱程序：起始a相80％，b相20％；0-30min，80％-100％a相；30-40min，100％a相。检测波长210nm。

3.2)包含cyp的转化菌株yl-t3-cyp505d13与yl-t3空质粒对照菌在ypd培养基中发酵，两菌株生长(od600)及产物积累动态过程如图3所示。yl-t3-cyp505d13菌株(实线)和空质粒对照菌株yl-t3-voidplasmid(虚线)的生长状况类似(图3a)。有关产物积累，三种化合物均在发酵第3天时达最大产量，其中1号化合物产量约为5mg/l发酵液，1号化合物产量约为25mg/l发酵液，3号化合物产量约为40mg/l发酵液。(图3b)。

实施例4

过表达cyp505d13酵母菌株产物分离纯化及鉴定

4.1)挑取过表达cyp505d13的酵母转化菌株，接种至4mlsc-hlu试管，30℃、220rpm培养至0d600为3左右，约30h；

4.2)转接至200mlsc-hlu摇瓶，30℃、220rpm培养至0d600为2左右,约24h；

4.3)初始od600为0.05接种10l发酵罐，内含ypd培养基6.5l，30℃、转速250rpm，培养3-4天。采用共获得约40l发酵液，5000rpm离心收集菌体，共约1100g。

4.4)以每克菌体加入1ml去离子水悬浮。重悬菌液：乙酸乙酯＝1：20的比例进行搅拌提取。提取两次，每次搅拌1h，搅拌后静置分层，合并上清40℃、-0.09mpa减压旋蒸浓缩。最终得到约30g棕色浸膏状粗提物。

4.5)过硅胶柱，取其中15g浸膏加入约50ml甲醇溶解，11000rpm离心10min，取上清。加入45g，100-200目的硅胶，旋蒸至硅胶完全干。硅胶柱装250g的200-300目硅胶。梯度洗脱：纯石油醚，冲1个柱体积；石油醚：乙酸乙酯＝20：1，冲2个柱体积；石油醚：乙酸乙酯＝10：1，冲2个柱体积；石油醚：乙酸乙酯＝5：1，冲2个柱体积；石油醚：乙酸乙酯＝2：1，冲2个柱体积；石油醚：乙酸乙酯＝1：1，冲2个柱体积；纯甲醇冲1个柱体积。约80ml更换一根新的接液管。共得到近150管，经tlc分析测定寻找目标产物，并分别合并浓缩。

4.6)半制备液相制备

浓缩后的粗品通过半制备液相按照如下程序进一步纯化：

流动相a100％乙腈和流动相b为100％水。1号：0-30min，85％-90％a相，流速10ml/min。手动截取29-30min。2号：0-30min，90％-95％a相，流速10ml/min。手动截取18.6-21.2min。3号：0-10min，95％-100％乙腈a相，流速10ml/min。手动截取25.7-28min。每2ml接一个ep管，随后通过hplc分析检测，将没有其他杂质的组分合并。

4.7)旋蒸仪浓缩至约1ml，转移至一干净2ml离心管离心真空挥干。得约1号物质5.2mg，2号物质20.3mg，4号物质35.6mg均为油状液体。

4.9)通过nmr数据确定其发生氧化的具体位置。化合物1、2、3号的¹h-nmr、¹³c-nmr、dept、hmbc、hmqc、cosy谱图分别参见图4至图6所示。

实验表明，通过灵芝基因组cyp基因的挖掘，得到一个可以催化前体角鲨烯进行环氧化或羟化的细胞色素氧化酶基因cyp505d13，并通过将其在酵母中异源表达，实现了线性三萜的异源合成。由于酿酒酵母细胞生长快，且酿酒酵母的遗传操作平台成熟，今后通过代谢工程结合发酵工程技术，有望继续探究线性三萜的后修饰过程及生物合成，故本发明是一种有生产和科研前景的线性三萜生物合成技术。

上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。

序列表

<110>上海交通大学

<120>生物合成线性三萜类化合物的方法

<130>f-b469e

<141>2018-12-26

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3175

<212>dna

<213>灵芝(ganodermalucidum)

<400>1

atgaccatccccatcccttgtccccccgctttgcccttcttgggacacatcactactgtt60

gacaccgacctgttcaccaagtccacctatcttctcgctcagcaatacggtgaaatctac120

gagctctatttcttcagtgaaaagagaatcctcatcaactcgtacgagctagcgaatgaa180

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aacctccgagacccgaaggtctggggcgaagatgctgaccagttccgcccggaacgcatg1140

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ctgcagcggtttgacctcatcatggacgatccctcctatgaactggaggtcaagcagacg1320

ctaactatcaagcccgacaacttctatatccatgcgatcccccgcaagaacaagccgcgc1380

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gggtccaacactggaagctcaaagtcattcgcggagcgtctcgccgccgatgcccccctg1560

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gggcccatcgtgatcgtcaccgcgtcgttcgagggcctgccagcggataacgcgggccac1680

tttgtgagctggctcgagagcgtgaaggacacggacgcgttcgcagacgtcaagttcgca1740

gtctttggctgtggaaaccgcgattgggtcaacacataccagcgcatcccgaggctcctt1800

gacgatggactcgctgcgcatggggcgacgcgacttgtggagcgcggggagggagacgcg1860

tctggatcggagtttttcgaggcgttcgacgtgtgggagaagggactgtgggagaagctg1920

ggcaaggaatatggtaccacgaagagtactgagaccgcaggaattgaggtcaagactgtc1980

tcggagggttcgacgcgtgcggagatcctccacgagaaggataccgcgctcggcacggtc2040

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ctatcaaccccgagagggttgtgcacagggcaattgctccagtctccctatcaaccccga2160

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gaaggtattcaagacccgcctcagcgtcctcgacatcctcgaagagaataaggacatcgg2460

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agtgaagcagacgttcgtcgcgtccatcaaggagcgggatggcgtcgatgaggagggcgc3120

tgtgaagatcttcagcgagatgatgaaggatcgctatgctacggatatcttcgag3175

<210>2

<211>1066

<212>prt

<213>灵芝(ganodermalucidum)

<400>2

metthrileproileprocysproproalaleupropheleuglyhis

151015

ilethrthrvalaspthraspleuphethrlysserthrtyrleuleu

202530

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245250255

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260265270

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275280285

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290295300

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325330335

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<213>引物序列(ganodermalucidum)

<400>8

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