一种用于将拭子上的细胞洗脱、裂解释放核酸的洗脱裂解液、试剂盒和方法与流程

本发明涉及一种用于将拭子上的细胞洗脱、裂解释放核酸的洗脱裂解液、试剂盒和方法。

背景技术：

细胞是由英国科学家罗伯特·胡克(roberthooke，1635～1703)于1665年发现的。细胞是生物体基本的结构和功能单位。而细胞生物学广泛地利用相邻学科的成就，在技术方法上是博采众长，凡是能够解决问题的都会被使用。例如用分子生物学的方法研究基因的结构，用生物化学、分子生物学的方法研究染色体上的各种非组蛋白和它们对基因活动的调节和控制或者利用免疫学的方法研究细胞骨架的各种蛋白(微管蛋白、微丝蛋白、各种中等纤维蛋白)在细胞中的分布以及在生命活动中的变化。起源于分子遗传学的重组dna技术和起源于免疫学的产生单克隆抗体的杂交瘤技术，也成了细胞生物学的有力工具。

而细胞的培养、增殖、保存都需要严格的条件。细胞培养的环境必须要满足无毒和无菌是体外培养细胞的首要条件，哺乳类与禽类细胞在体外培养的适宜温度是37～38℃，渗透压是体外培养细胞的重要条件之一，细胞的体外培养需要理想的气体环境，氧气、二氧化碳是细胞生存的必要条件。而且需要提供固定细胞培养基包含：细胞生长所需的各种营养物质，包括碳水化合物、氨基酸、无机盐、维生素等。为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度—－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂(一般为二甲亚砜或甘油)的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

而目前我们应用于大众健康基因检测，天赋基因检测，遗传病筛查等检测都主要使用干燥的拭子采集口腔上皮细胞后，因其采集、运输、保存较为方便，而被大量采用。但使用拭子收集的细胞量非常有限，而且细胞的生长和保存的条件都极为严苛，经过运输、常温储存，对拭子中的细胞造成大量的损伤，导致下游实验很容易造成假阳性或假阴性。

我们通过大量实验研制出使拭子中的细胞进行高效洗脱及裂解释放核酸，能有效的解决细胞因运输、不当储存带来的损伤后造成假阳性或假阴性，同时提高的检出率，以用于后续的分子检测。与目前核酸提取方法比较，因细胞粘附于拭子上，目前市面上的产品基于直接裂解拭子上的细胞，后续通过纯化，洗涤会后回收核酸，往往回收率偏低，提取成本高，提取效率偏低。因此寻找一种让细胞高效洗脱裂解的试剂，而不需要核酸提取直接pcr的方法对提高检测效率和质量具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于将拭子样本上的细胞洗脱、裂解释放核酸的洗脱裂解液，采用该洗脱裂解液对干燥拭子上的细胞先进行洗脱，后续通过高温裂解方法释放核酸，裂解后直接进行实时定量pcr检测snp，以优化现有检测技术。为干燥拭子样本提供了一种快速、简便、高效、精准的检测方法，省略核酸提取过程，简化了操作过程，节约了时间和成本，更重要的是提高了检出率，操作检测时可防止污染。

为实现上述目的，所采取的技术方案：一种用于将拭子样本上的细胞洗脱、裂解释放核酸的洗脱裂解液，所述洗脱裂解液包括以下浓度的组分：25～50mm的tris-hcl、3～11mm的mgcl2、3～6μm的edta、0.1～1μm的sds、5～50μg/ml的蛋白酶k、0.1～0.5μm的bsa以及1～10％的吐温20，tris-hcl的ph值为7～8.5。本发明所述洗脱裂解液不仅可以用于洗脱干燥拭子上的细胞，还能够用于裂解该细胞。这里的吐温20在裂解过程中作为柔性裂解剂，在后续pcr扩增中作为稳定剂，提供一个稳定的缓冲体系。吐温20比吐温80更温和一些，后续pcr扩增提供稳定体系，不能用吐温80或60取代。

优选地，所述拭子为不带保护液的拭子。现有拭子分两种；不带保护液的拭子和带保护液的拭子，本发明的洗脱裂解液是针对不带保护液的拭子开发的，本发明的洗脱裂解液适合对不带保护液的拭子进行洗脱，不适合对带保护液的拭子进行洗脱。

优选地，所述拭子样本为口腔拭子样本。

本发明提供了一种用于将拭子样本上的细胞洗脱、裂解释放核酸的试剂盒，所述试剂盒包括上述所述的洗脱裂解液。

本发明提供了一种用于将拭子样本上的细胞洗脱、裂解释放核酸的方法，所述方法是采用上述所述的洗脱裂解液将拭子样本上的细胞洗脱、裂解释放核酸的。

本发明提供了一种用于将拭子样本上的细胞洗脱、裂解释放核酸的方法，所述方法包括以下步骤：

(1a)配制上述所述的洗脱裂解液；

(2a)将步骤(1a)得到的洗脱裂解液加入到离心管中，将拭子样本浸泡于所述洗脱裂解液中，涡旋混匀，37℃下孵育60min；

(3a)取出拭子，在65℃水浴5min，95℃水浴10min。

优选地，其特征在于，所述步骤(2a)中孵育是在摇床中进行的，转速为300转/min。

本发明提供了一种用于对拭子样本上的细胞进行snp检测的方法，包括以下步骤：

(1b)配制上述所述的洗脱裂解液；

(2b)将步骤(1b)得到的洗脱裂解液加入到离心管中，将拭子样本浸泡于所述洗脱裂解液中，涡旋混匀，37℃下孵育60min；

(3b)将离心管中的拭子取出，将取出拭子后的离心管在65℃下水浴5min，95℃下水浴10min，取上清液作为待检测液；

(4b)将待检测液加入到snp位点检测反应液中，在实时荧光定量pcr仪上进行扩增，根据扩增结果得到snp检测结果。

在65℃水浴是为了裂解洗脱下来的细胞。在95℃下水浴是为了灭活pcr抑制剂，主要灭活蛋白酶k。

优选地，所述步骤(4b)中扩增程序为：95℃10min，，进行40个循环的95℃15s，65℃1min，在65℃检测荧光信号。

本发明方法能有效的将细胞先从干燥拭子中洗脱，然后通过柔性裂解释放核酸，并通过高温灭活pcr抑制剂，简洁易操作，且省略了核酸提取过程，简化了操作过程，大大提高检出率和效率。

有益效果：

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1、本发明通过洗脱后再进行裂解，检出效率高于商业化试剂盒提取的效率。

2、本发明洗脱裂解液不影响下游pcr扩增。

3、本发明方法操作简单，去除提取中繁琐的纯化、洗涤、洗脱步骤。

4、本发明方法整个过程只开盖一次，避免因大量操作引入的交叉污染。

5、本发明方法简化了操作过程，节约了时间和成本。

附图说明

图1为本发明实施例1中采用本发明方法对1号样本(野生型样本)进行snp分型的检测结果图。

图2为本发明实施例1中采用本发明方法对2号样本(野生型样本)进行snp分型的检测结果图。

图3为本发明实施例1中采用本发明方法对3号样本(杂合型样本)进行snp分型的检测结果图。

图4为本发明实施例2中对1号样本(野生型样本)进行常规核酸提取与本发明方法进行对比的snp分型结果图。

图5为本发明实施例2中对2号样本(野生型样本)进行常规核酸提取与本发明方法进行对比的snp分型结果图。

图6为本发明实施例2中对3号样本(杂合型样本)进行常规核酸提取与本发明方法进行对比的snp分型结果图。

具体实施方式

下面将结合附图说明和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，试剂或材料均为通过商业途径得到。

以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明，实施例提供的方案为优选方案，但不作为对本申请的限定，实施例中所用的pcr扩增仪器为abi7500。通过设计aldh2基因rs671位点的引物探针，进行基因分型。

上游引物：cccccagcaggtcccacac(seqidno:1)；

下游引物：gctacaagatgtcggggagtgg(seqidno:2)；

野生型探针pw：cacagttttcacttcagtgtatgcct(seqidno:3)；

突变型探针pm：cacagttttcactttagtgtatgcctg(seqidno:4)。

实施例1

取干燥拭子样本，对其snp位点进行实时荧光定量pcr检测。

(1)配制洗脱裂解液，所述洗脱裂解液包括以下浓度的组分：25～50mm的tris-hcl、3～11mm的mgcl2、3～6μm的edta、0.1～1μm的sds、5～50μg/ml的蛋白酶k、0.1～0.5μm的bsa以及1～10％的吐温20，tris-hcl的ph值为7～8.5。

(2)取3例保存的干燥拭子样本，加入到含300μl步骤(1)洗脱裂解液的离心管中，分别作为1号样本、2号样本、3号样本，涡旋混匀，37℃摇床中，在转速为300转/min下，孵育60min。

(3)将离心管中的拭子取出，将取出拭子后的离心管在65℃水浴5min，95℃水浴10min，取上清液作为待检测液。

(4)将上述步骤(3)得到的3个样本的待检测液各取2ul，加入到snp位点检测反应液中，在实时荧光定量pcr仪(abi7500)上进行扩增，扩增程序为95℃15min，，进行40个循环的95℃15s，65℃1min，在65℃检测荧光信号。

实验结果如图1、2、3所示，图1、2、3分别为1号样本、2号样本、3号样本的实验结果，结果表明，按照本实施例的方法进行操作，可以有效准确清晰地对snp进行分型。并与一代测序结果比较，分型结果一致。

实施例2

对同一个人同时采集的两份拭子样本进行常规核酸提取与本发明方法进行对比。取口腔拭子样本，采用本发明方法对其snp位点进行实时荧光定量pcr检测，具体步骤如下：

(1)配制洗脱裂解液，所述洗脱裂解液包括以下浓度的组分：25～50mm的tris-hcl、3～11mm的mgcl2、3～6μm的edta、0.1～1μm的sds、5～50μg/ml的蛋白酶k、0.1～0.5μm的bsa以及1～10％的吐温20，tris-hcl的ph值为7～8.5。

(2)取3例保存的干燥拭子样本，加入到含300μl步骤(1)洗脱裂解液的离心管中，分别作为1号样本、2号样本、3号样本，涡旋混匀，37℃摇床中，在转速为300转/min下，孵育60min。

(3)将离心管中的拭子取出，将取出拭子后的离心管在65℃水浴5min，95℃水浴10min，取上清液作为待检测液。

(4)将上述步骤(3)得到的3个样本的待检测液各取2ul，加入到snp位点检测反应液中，在实时荧光定量pcr仪(abi7500)上进行扩增，扩增程序为95℃15min，，进行40个循环的95℃15s，65℃1min，在65℃检测荧光信号。

取口腔拭子样本，采用使用商业化的试剂盒提取拭子样本上的细胞dna。

实验结果如图4、5、6所示，图4、5、6分别为1号样本、2号样本、3号样本的实验结果，图4、5、6中数字1、2、3为按照本发明方法进行操作的结果，对应地，图4、5、6中数字1`、2`、3`为使用商业化的试剂盒提取dna的检测结果。结果表明，按照本发明方法进行操作，通过高效洗脱后裂解，检出率和效率都优于商业化的提取试剂盒，可以替代核酸，省略核酸提取步骤，能有效准确，高效地对snp进行分型。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。