一种检测鱼糜制品中谷氨酰胺转氨酶的方法与流程

本发明涉及食品添加剂的检测方法，特别涉及一种检测鱼糜制品中谷氨酰胺转氨酶的方法。

背景技术：

谷氨酰胺转胺酶具有催化蛋白质分子内和分子间的交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基水解的功能，被广泛应用于食品、医药及纺织等领域。蛋白质是维持肉制品组织特性的主要因素，蛋白质分子交联凝结使食品具有机械性能。蛋白质分子的交联作用赋予食品许多特性，包括粘性、可溶性、乳化性以及胶凝特性。转谷氨酰胺酶由于能够使蛋白质发生交联作用而备受关注，它催化伯胺与谷酰胺残基肽键上的羧氨基，发生酰基转移反应。本发明提出的检测方法，能够有效检测出市售鱼糜制品中谷氨酰胺转氨酶含量。

技术实现要素：

针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种检测鱼糜制品中谷氨酰胺转氨酶的方法，其操作简单、结果准确。

为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种检测鱼糜制品中谷氨酰胺转氨酶的方法，包括如下步骤：

(1)谷氨酰胺转氨酶(mtgase)食品添加剂的分离纯化：利用双水相萃取的方法，称量6g谷氨酰胺转氨酶(mtgase)食品添加剂，溶于400ml的20mmol/l的tris-hcl中，与聚乙二醇6000/(nh4)2so4萃取液按照1：5的比例混合，静置2h后，取下层液相；

(2)谷氨酰胺转氨酶(mtgase)浓度的测定：利用bio-rad试剂盒的方法测定蛋白浓度，根据不同的浓度的bsa在595nm处的吸光值建立标准曲线，计算tgase的浓度；

(3)western-blotting灵敏度的检测分析：以1/50mg/mlmtgase为起始浓度，采用2倍稀释法，逐级稀释至1/800mg/ml，在抗mtgase的抗体以1：10000的比例稀释下，上样10μl，确定western-blotting的最低检测限；

(4)采取建立的western-blotting法检测市售鱼糜制品：用20mmol/ltris-hcl缓冲液对鱼糜制品进行mtgase提取及蛋白浓度的测定；以纯化的mtgase为半定量的对照，进行sds-page分析，由此检测鱼浆中添加的mtgase。

作为优选的，所述的tris-hcl缓冲液为含8mol/l尿素、0。1mmol/ldtt、ph＝8。0的tris-hcl缓冲液。

作为优选的，在步骤(4)蛋白浓度的测定中，tris-hcl缓冲液浓度太大时需进行适当的稀释。

附图说明

图1为本发明mtgase提取液的sds-page的电泳图谱；

其中，m、标准分子量蛋白；1、市售谷氨酰胺转氨酶食品添加剂，2、纯化的mtgase。

图2为mtgase提取液的免疫印迹分析。

图3为牛血清白蛋白浓度标准曲线。

图4为方法灵敏度的分析图；

其中，各泳道mtgase浓度分别为：1、1/50mg/ml，2、1/100mg/ml，3、1/200mg/ml，4、1/400mg/ml，5、1/800mg/ml。

图5为市售鱼浆中mtgase的检测结果；

其中，c、纯化的mtgase，1、杂鱼鱼浆，2、金线鱼鱼浆，3、淡水鱼鱼浆。

图6为市售鱼丸中mtgase的检测结果；

其中，c、纯化的mtgase，1、鱼丸，2、鱼豆腐，3、脆丸。

图7为抗体特异性的sds-page和western-blotting分析结果；

其中，c、1/200mg/mltgase，1、鲢鱼粗提的蛋白，2、巴浪鱼粗提的蛋白，3、草鱼粗提的蛋白。

图8为鱼肉中内源性谷氨酰胺转氨酶含量的比较；

其中，c、1/200mg/mltgase，1、草鱼粗提的蛋白，2、鲢鱼粗提的蛋白，3、巴浪鱼粗提的蛋白，4、鲈鱼粗提的蛋白，5、鲫鱼粗提的蛋白。

图9为鱼丸与内源性tgase抗体特异性的比较；

其中，c、对照(1/200mg/mlmtgase)，1、鲈鱼粗提的蛋白，2、1号鱼丸，3、2号鱼豆腐，4、3号脆丸，5、4号虾饺，6、5号鱼豆腐。

具体实施方式

为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

一种检测鱼糜制品中谷氨酰胺转氨酶的方法，包括如下步骤：

(1)谷氨酰胺转氨酶(mtgase)食品添加剂的分离纯化：利用双水相萃取的方法，称量6g谷氨酰胺转氨酶(mtgase)食品添加剂，溶于400ml的20mmol/l的tris-hcl(ph8。0)中，与聚乙二醇6000/(nh4)2so4萃取液按照1：5的比例混合，静置2h后，取下层液相；

将得到的溶液进行sds-page分析，最终结果如图1所示。仅在35kda和45kda之间存在单一条带，与参考标准文献中报道的mtgase分子量一致。通过western-blotting对该蛋白进一步验证，结果如图2所示，该蛋白与兔抗mtgase发生免疫反应，说明下层液相为纯化的mtgase。

(2)谷氨酰胺转氨酶(mtgase)浓度的测定：利用bio-rad试剂盒的方法测定蛋白浓度，根据不同的浓度的bsa在595nm处的吸光值建立标准曲线，计算tgase的浓度；

如图3所示，计算方程为：y＝0。8899x+0。5187，相关系数为0。9924，说明曲线线性较好，计算可得tgase的浓度为0。12mg/ml。

(3)western-blotting灵敏度的分析：以1/50mg/mlmtgase为起始浓度，采用2倍稀释法，逐级稀释至1/800mg/ml，在抗mtgase的抗体以1：10000的比例稀释下，上样10μl，确定western-blotting的最低检测限；

结果如图4所示，sds-page结果显示，最低检测限为1/200mg/mlmtgase，相当于25mgtgase食物。western-blotting结果显示，随着tgase浓度的降低，条带呈现递减的趋势；当tgase浓度为1/400mg/ml时，仍有清晰的条带，最终确定western-blotting的最低检测限为1/400mg/mlmtgase，相当于5mgtgase食物。

(4)采取建立的western-blotting法检测市售鱼糜制品：用含8mol/l尿素、0。1mmol/ldtt的20mmol/ltris-hcl(ph8。0)缓冲液对鱼糜制品进行谷氨酰胺转氨酶(mtgase)提取，进行蛋白浓度的测定，浓度太大时需适当稀释；以纯化的mtgase为半定量的对照，进行sds-page分析，由此检测鱼浆中添加的mtgase。

在此过程中，分别对市售三种鱼浆、三种鱼丸进行了分组检测，结果如下：

采用(4)过程所述的方法对3种市售鱼浆中mtgase进行检测，如图5-ⅰ所示，在目的蛋白条带位置，三种鱼浆的蛋白均有蛋白显示。在抗mtgase抗体以1：10000的比例稀释的情况下进行western-blotting分析，结果如图5-ⅱ所示，泳道2、泳道3均存在强烈的免疫反应，证明该方法可检测鱼浆中添加的mtgase。

采用(4)过程所述的方法对3种市售鱼丸中mtgase进行检测，如图6-ⅰ所示，在目的蛋白分子量的位置，泳道1的提取蛋白明显高于其他2个泳道。在抗mtgase抗体以1：10000的比例稀释的情况下进行western-blotting分析，结果如图6-ⅱ所示，泳道1、泳道2、泳道3均存在免疫反应，由于添加量较少，泳道1的免疫反应较弱，说明该方法可检测鱼丸中添加的谷氨酰胺转氨酶(mtgase)。

注意事项：

一、在检测之前，需要先配置含8mol/l尿素、0。1mmol/ldtt的20mmol/ltris-hcl缓冲液；

为了提取更多的谷氨酰胺转氨酶(mtgase)，选取了两种缓冲液对mtgase进行提取比对：

缓冲液a：含0。5mol/lnacl的20mmol/ltris-hcl(ph8。0)缓冲液；

缓冲液b：含8mol/l尿素、0。1mmol/ldtt的20mmol/ltris-hcl；

以纯化的mtgase为阳性对照，选取6组市售鱼糜制品为提取的原材料，通过sds-page实验得出：在38kda的目的蛋白处，采用两种缓冲液提取的蛋白量相当；通过western-blotting实验得出：采用缓冲液b对目的蛋白的提取率明显高于缓冲液a的提取效率。

因此，采用缓冲液b提取鱼糜制品中的mtgase效率更高。

二、检测过程中需排除内源性tgase的干扰，鱼糜制品中谷氨酰胺转氨酶(mtgase)检测的难点在于鱼肉内源性tgase干扰，虽然鱼肉内源性tgase与微生物产生的mtgase在活性部位中心周围的氨基酸组成有所差异，但是二级结构相似，两者的的最适ph和最适温度基本相同，因此，仅依靠对其活性的检测难以将二者区分。

由于制备的抗mtgase抗体为多克隆抗体，抗体具有非特异性，不排除该抗体与鱼肉中内源性tgase存在免疫反应。

为了验证该抗体对鱼肉内源性tgase的特异性，判断其是否与鱼肉中tgase存在免疫反应，实验选取了鲢鱼、草鱼、巴浪鱼，在抗mtgase抗体以1：1000的比例稀释的情况下，对其进行western-blotting。如图7所示，鲢鱼、巴浪鱼均会发生明显的免疫反应，因此，该抗体与鱼肉中tgase存在反应。

1、内源性tgase的选取：原材料选取了经常作为鱼糜制品原料的淡水鱼和低值海水鱼，包括：草鱼、鲢鱼、巴浪鱼、鲈鱼、鲫鱼。用含tris-hcl缓冲液对其进行了tgase的提取，在抗mtgase抗体以1：1000的比例稀释的条件下，通过免疫印迹的方法，判断鱼肉中谷氨酰胺转氨酶含量的高低。western-blotting结果如图8所示，鲢鱼、巴浪鱼、鲈鱼、鲫鱼均显示条带，表明发生免疫反应，鲈鱼处显示的条带最为清晰，说明在这五种鱼中，鲈鱼所含的内源性谷氨酰胺转氨酶含量较高，因此选择鲈鱼为鱼内源性tgase的代表。

2、内源性和外源性tgase抗体特异性比较：用tris-hcl缓冲液对6组市售鱼丸进行蛋白粗提，以鲈鱼中tgase为内源性参照，以1/200mg/mlmtgase为半定量的对比，在不同抗体浓度下进行了免疫印迹分析，western-blotting结果如图9所示，图9-ⅰ是抗体以1:3000的比例稀释，9-ⅱ是抗体以1：5000的比例稀释，图9-ⅲ是抗体以1：10000的比例稀释。从结果可知，随着抗体浓度的降低，市售鱼丸的免疫条带逐渐变浅，通过与对照组纯化的mtgase条带相比较，可初步确认其浓度。当抗体浓度逐渐降低，鱼肉内源性tgase免疫条带会逐渐消失。当抗体以1：10000的比例稀释时，鱼肉内源性tgase没有免疫反应，而鱼丸仍有免疫反应。

综上所述，采用含8mol/l尿素、0.1mmol/ldtt的20mmol/ltris-hcl(ph8.0)缓冲液进行样品的制备能获得最多的蛋白量；选取含量最高的鲈鱼tgase为内源性参照，当抗体以1：10000的比例稀释时，该检测方法排除内源性tgase的干扰，能特异地检测出鱼糜制品中添加的mtgase。

以上所述仅为本发明专利的较佳实施例而已，并不用以限制本发明专利，凡在本发明专利的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明专利的保护范围之内。