本发明涉及微生物菌株筛选技术领域，具体涉及一种多抗霉素高产菌株的筛选方法。
背景技术：
多抗霉素（polyoxin）又称“多氧霉素”、“多效霉素”、“农抗2188”，主要有效成分是多抗霉素b（polyoxinb）。多抗霉素具有较好的内吸传导作用，可干扰病原菌细胞壁几丁质的生物合成，接触药剂的牙管和菌丝局部膨大、破裂、细胞内含物溢出，导致菌体不能正常发育而死亡，可广泛应用于农业黄瓜霜霉病、白粉病、人参黑斑病、苹果灰斑病、水稻纹枯病等多种植物真菌性病害的防治。
多抗霉素是一种由金色产色链霉菌产生的次级代谢产物，工业上通过微生物发酵制备。已经公开的涉及提高多抗霉素产量的方法如中国专利申请cn201410631830.4所涉及的一种提高多抗霉素产量的发酵方法，包括如下步骤：（1）配置培养基，将培养基消毒，灭菌；（2）在培养基中接种链霉菌株，发酵培养；（3）对发酵产物进行过滤，取滤液，即得。所述培养基含有终浓度为8～12g/l的玉米淀粉、18～22g/l的豆饼粉、5～8g/l的酵母粉、5～7g/l的氯化钠、1～1.2g/l的硫酸铵、1.5～2g/l的碳酸钙以及终浓度为50～150mg/l的5-甲基-脲嘧啶。将培养基在121～130℃高温下消毒，灭菌30～35min；在培养基中接种链霉菌株，在28～30℃下发酵70～72h；培养基中的固形物投加量为1075g时，得到富含多抗霉素的滤液16400ml，所述滤液含有10％的多抗霉素。测定该滤液的生物效价，可达到32000ppm，远远高于现有方法所得的滤液效价结果10000μg/ml。
多抗霉素高产菌株的筛选是提高工业发酵水平的一个重要途径，传统诱变方法主要有：诱变剂处理、n+注入、紫外线诱变及attp诱变育种等方法，其中诱变剂处理、n+注入、紫外线诱变和artp诱变的对象是孢子或者菌丝。针对菌丝体的诱变，细胞壁对菌体内部遗传物质起保护作用，这使得诱发突变不定向，正变型频率较低，诱变菌株遗传稳定性差，另外孢子结构特殊，对诱变处理不敏感，会产生很多假阳性结果。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种多抗霉素高产菌株筛选方法，首先制备金色产色链霉菌原生质体，对原生质体进行多次artp诱变和再生培养，再依据诱变菌株的生长形态特征和生长速率挑选单菌落进行抑菌活性测试，最后以多抗霉素生物效价及多抗霉素b组分含量为考核指标，摇瓶筛选出多抗霉素高产菌株。本发明对金色产色链霉菌产生多抗霉素的性能进行了改进，进而提高多抗霉素发酵水平。
在本发明的优选的实施方式中，所述的筛选方法，具体包括以下步骤：
s1.将多抗霉素产生菌转接至大试管斜面培养基，经过培养后获得孢子斜面；孢子接入含玻璃珠的种子培养基，培养至菌丝生长对数期，收集菌悬液用作原生质体的制备；
s2.将步骤s1中处于生长对数期的菌悬液进行离心，弃上清，冲洗后，离心下层菌丝沉淀，弃上清；再用溶菌酶溶液和p缓冲液与菌丝混匀，水浴振荡，得到酶解液，然后过滤，收集滤液，再将滤液离心，弃下层，上层物质继续离心，弃上层，向下层物质中加入缓冲液混匀，制得原生质体溶液，冷藏备用；
s3.原生质体悬液中加甘油作为保护剂，混合均匀，取适量涂于无菌载片上，进行artp诱变；然后无菌操作收集载片至含缓冲液的离心管中，震荡，对诱变后的原生质体悬液进行洗脱，按10-10000倍梯度稀释，取相同量的各梯度稀释液涂布于再生培养基上，25-30℃培养8-15d；每隔1d对诱变后再生的单菌落进行外观特征观察标记，选取外形饱满，生长快速的单菌落作为单菌落抑菌活性测试的对象；
s4.将灭好菌的水琼脂加热溶解后倒入玻璃大盘，上层培养基与指示菌株混匀平铺在下层培养基上；挑选步骤s3中生长外形饱满、生长速率快的单菌落放于玻璃大盘中，25-30℃培养19-30h，通过抑菌圈大小考察单菌落的抑菌生物活性；
s5.从步骤s4中挑选的抑菌圈大的单菌落接种至斜面培养基上，25-30℃培养10-15d，获得孢子；将孢子接种到种子培养基中培养48-72h至菌丝生长对数期，按2%-10%（v/v）的接种量立即转入含发酵培养基的摇瓶中，25-30℃，200-220rpm/min摇床震荡培养140-180h，收集发酵液并进行酸化过滤，测定多抗霉素的生物效价，同时采用hplc法检测多抗霉素b的含量，筛选出效价高，且多抗霉素b含量高的菌株。
更优选的，所述的筛选方法具体包括以下步骤：
s1.将多抗霉素产生菌从保藏的沙土管转接至大试管斜面培养基，25-30℃培养10-15d，获得孢子斜面；用接种铲将孢子接入含10-20颗玻璃珠的种子培养基，28-30℃，180-200rpm/min培养2-3d至菌丝生长对数期，停止培养，收集菌悬液用作原生质体的制备；
s2.用移液枪吸取8ml步骤s1中处于生长对数期的菌悬液，加入灭菌干燥处理后的离心管中，3000rpm/min离心10-15min，弃上清，依次用10.3%蔗糖水溶液和p缓冲溶液冲洗，离心下层菌丝沉淀，离心速度为3000rpm/min，离心时间为10-15min，弃上清；再用溶菌酶溶液：p缓冲液=1:10（v/v）与菌丝混匀，水浴振荡，得到酶解液。脱脂棉过滤酶解液去除未彻底酶解的菌丝片段，收集滤液，再将滤液300rpm/min离心3-5min，弃下层，上层物质转入新离心管，继续3000rpm/min离心5-10min，弃上层，向下层物质中加1-2mlp缓冲液混匀，制得原生质体溶液，-20℃冷藏备用；
s3.原生质体悬液中加终浓度为5%甘油作为保护剂，混合均匀，取10μl涂于无菌载片上，进行artp诱变；无菌操作收集载片至含缓冲液的离心管中，震荡，对诱变后的原生质体悬液进行洗脱，按10、100、1000、10000倍梯度稀释，取100μl各梯度稀释液涂布于再生培养基上，25-30℃培养8-15d；每隔1d对诱变后再生的单菌落进行外观特征观察标记，选取外形饱满，生长快速的单菌落作为单菌落抑菌活性测试的对象；
s4.根据多抗霉素的抑菌特性选择烟草赤星病菌作为单菌落生物活性测试的指示菌株，将灭好菌的下层培养基加热溶解后倒入玻璃大盘，上层培养基与指示菌株混匀平铺在下层培养基上；挑选步骤s3中生长外形饱满、生长速率快的单菌落放于玻璃大盘中，25-30℃培养19-30h，通过抑菌圈大小考察单菌落的抑菌生物活性；
s5.从步骤s4中挑选的抑菌圈大的单菌落接种至斜面培养基上，25-30℃培养10-15d，获得孢子；用接种铲将孢子接种到种子培养基中培养48-72h至菌丝生长对数期，按2%-10%（v/v）的接种量立即转入含发酵培养基的摇瓶中，25-30℃，200-220rpm/min摇床震荡培养140-180h，收集发酵液并进行酸化过滤，采用杯蝶法测定多抗霉素的赤星效价，同时采用hplc法检测多抗霉素b的含量，筛选出效价高，且多抗霉素b含量高的菌株。
优选地，步骤s1中所述的斜面培养基组分为：麦芽糖0.2-1.0%，豆饼粉0.2-5.0%，酵母粉0.1-0.5%，琼脂0.5-2.0%，其余水，ph为6.0-7.0。
优选地，步骤s1中所述的种子培养基组分为：豆饼粉1.0-5.0%，玉米粉0.1-0.5%，酵母粉0.1-0.5%，磷酸二氢钾0.1-0.2%，氯化钠0.1-1.0%，其余为水，ph自然。
优选地，步骤s2中所述的p缓冲溶液组分为：蔗糖10.3%，硫酸钾0.025%，六水氯化镁0.202%，微量元素0.2%，磷酸二氢钾0.005%，氯化钙0.368%，三羟甲基甲胺基乙磺酸（tes）0.573%；其中微量元素溶液组分为：氯化锌40μg/ml，六水氯化铁200μg/ml，二水氯化铜10μg/ml，四水氯化锰10μg/ml，十水硼酸钠10μg/ml，四水钼酸铵10μg/ml。
优选地，步骤s2中所述溶菌酶浓度为20-40mg/ml，溶菌酶：湿菌体=1:1000（m/m），酶解时间为40-60min。
优选地，步骤s3中所述原生质体诱变条件为：高纯氦气作为artp工作气体、照射距离2mm、气流量6-8l/min、照射时间为40-80s，重复2-4次，每次照射结束后黑暗静置1-10min。
优选地，步骤s3中所述的再生培养基组分为：麦芽糖0.20-1.00%，豆饼粉0.20-5.00%，酵母粉0.10-0.50%，胰蛋白胨0.01-0.50%，l-脯氨酸0.01-0.05%，硫酸钾0.01-0.03%，琼脂0.50-2.00%，多抗霉素b0.01-0.05%，其余水，ph为6.0-7.0。
优选地，步骤s4中所述的下层培养基组分为：1.8-2.2%琼脂，其余为水，ph自然。上层培养基组分为：葡萄糖1.5-3.5%、土豆15-30%、琼脂1.8-2.2%，其余为水，ph自然。
优选地，步骤s5中所述的发酵培养基组分为：豆饼粉1.00-4.00%，玉米粉5.0-8.0%，碳酸钙0.10-0.50%，磷酸二氢钾0.01-0.50%，氯化钠0.01-0.50%，其余为水，ph自然。
本发明通过酶处理制备金色产色链霉菌原生质体，利用等压室温等离子体atmosphericandroom-temperatureplasma（artp）育种仪对原生质体进行间断式诱变，再结合诱变后单菌落的生长形态特征和生长速率为指标挑选单菌落进行抑菌活性测试，最后以多抗霉素抑制烟草赤星效价及多抗霉素b组分含量为考核指标进行摇瓶筛选，获得多抗霉素产量高，且有效组分含量高的菌株。本发明有效地提高了多抗霉素发酵水平，降低了制备相关产品的成本，具有重要的工业化应用潜力和价值。
具体实施方式
下面结合实施例做进一步的说明。
本发明使用的多抗霉素生产菌株为金色产色链霉菌(streptomycesaureochromogenes)accc40048进行发酵，指示菌为烟草赤星病菌(alternarialongipes)accc30002。
1.培养基及缓冲液的制备方法
斜面培养基：麦芽糖0.2-1.0%，豆饼粉0.2-5.0%，酵母粉0.1-0.5%，琼脂0.5-2.0%，其余水，ph：6.0-7.0，121℃灭菌30min，备用。
种子培养基：豆饼粉1.0-5.0%，玉米粉0.1-0.5%，酵母粉0.1-0.5%，磷酸二氢钾0.1-0.2%，氯化钠0.1-1.0%，其余为水，ph自然，121℃灭菌30min，备用。
p缓冲溶液组分为：蔗糖10.3%，硫酸钾0.025%，六水氯化镁0.202%，微量元素0.2%，磷酸二氢钾0.005%，氯化钙0.368%，三羟甲基甲胺基乙磺酸（tes）0.573%，其余为水，ph自然，121℃灭菌20min，备用。
微量元素溶液组分（μg/ml）：氯化锌40，六水氯化铁200，二水氯化铜10，四水氯化锰10，十水硼酸钠10，四水钼酸铵10，其余为水，ph自然，115℃灭菌25min，备用。
再生培养基组分为：麦芽糖0.20-1.00%，豆饼粉0.20-5.00%，酵母粉0.10-0.50%，胰蛋白胨0.01-0.50%，l-脯氨酸0.01-0.05%，硫酸钾0.01-0.03%，琼脂0.50-2.00%，多抗霉素b0.01%，其余为水，ph：6.0-7.0，115℃灭菌25min，备用。
上层培养基组分为：葡萄糖2.0%、土豆20%、琼脂2.0%，其余为水，ph：6.0-7.0，115℃灭菌30min，备用。
发酵培养基组分为：豆饼粉1.00-4.00%，玉米粉5.0-8.0%，碳酸钙0.10-0.50%，磷酸二氢钾0.01-0.50%，氯化钠0.01-0.50%，其余为水，ph自然，121℃灭菌20min，备用。
2.一种多抗霉素高产菌株的筛选方法
s1.将多抗霉素产生菌从保藏的沙土管转接至大试管斜面培养基，25-30℃培养10-15d，获得孢子斜面。用接种铲将孢子接入含15-20颗玻璃珠的种子培养基，28-30℃，180-200rpm/min培养2-3d，收集菌悬液，备用。
s2.用移液枪吸取8mls1中的菌悬液于灭菌干燥处理后的离心管中，3000rpm/min离心10-15min，弃上清，保留下层菌丝沉淀。依次用10.3%蔗糖水溶液和p缓冲溶液对菌丝冲洗离心（3000rpm/min，10min），再用溶菌酶缓冲液：p缓冲液=1:10（v/v）与菌丝混匀，32℃水浴振荡，酶解40-60min，去除菌丝体细胞壁，得到酶解液。脱脂棉过滤酶解液去除未彻底酶解的菌丝片段，收集滤液，再将滤液300rpm/min离心5min，弃下层，上层物质转入新离心管，继续3000rpm/min离心5min，弃上层。向下层物质中加1mlp缓冲液混匀，制得原生质体悬浮液，-20℃冷藏备用。
s3.原生质体悬液中加终浓度为5%甘油作为保护剂，混合均匀，取10μl涂于无菌载片上，采用高纯氦气作为artp工作气体，照射距离2mm，气流量8l/min，诱变分两次进行，每次照射40-80s，中间黑暗条件下间隔1-10min。无菌操作收集载片至装有含p缓冲液的离心管中，震荡，对诱变后的原生质体悬液进行洗脱，按10、100、1000、10000倍梯度稀释，取各梯度稀释液100μl涂布于再生培养基上，25-30℃培养8-15d，每隔1天对诱变再生的单菌落进行观察标记，选取外形饱满，生长快速的单菌落作为单菌落抑菌效果测试的对象。
s4.根据多抗霉素的抑菌特性选择烟草赤星病菌作为指示菌株，将灭好菌的下层2%水琼脂加热溶解后倒入玻璃大盘，上层培养基与指示菌株混匀平铺在下层培养基上。挑选s3中生长外形饱满、生长速率快的单菌落放于玻璃大盘中，28℃培养20h，通过抑菌圈考察单菌落产多抗霉素量的大小。
s5.从步骤4中挑选的抑菌圈大的单菌落接种至斜面培养基上，25-30℃培养10-15d，获得孢子。用接种铲将孢子接种到种子培养基中培养48-72h至菌丝生长对数期，按2%-10%（v/v）的接种量立即转入发酵培养基摇瓶中进行发酵培养，25-30℃，200-220rpm/min摇床震荡培养140-180h，对发酵液进行酸化过滤，采用杯蝶法测定多抗霉素的赤星效价，同时采用hplc法检测多抗霉素b的含量，从而筛选出效价高，且多抗霉素b含量高的菌株。
实施例1
1.培养基及缓冲液的制备方法
斜面培养基：麦芽糖0.5%，豆饼粉0.5%，酵母粉0.5%，琼脂2.0%，其余水，ph：6.0-7.0，121℃灭菌30min，备用。
种子培养基：豆饼粉2.5%，玉米粉1.5%，酵母粉0.5%，磷酸二氢钾0.1%，氯化钠0.1%，其余为水，ph自然，121℃灭菌30min，备用。
p缓冲溶液组分为：蔗糖10.3%，硫酸钾0.025%，六水氯化镁0.202%，微量元素0.2%，磷酸二氢钾0.005%，氯化钙0.368%，三羟甲基甲胺基乙磺酸（tes）0.573%，其余为水，ph自然，121℃灭菌20min，备用。
微量元素溶液组分（μg/ml）：氯化锌40，六水氯化铁200，二水氯化铜10，四水氯化锰10，十水硼酸钠10，四水钼酸铵10，其余为水，ph自然，115℃灭菌25min，备用。
再生培养基组分为：麦芽糖0.5%，豆饼粉2.0%，酵母粉0.5%，胰蛋白胨0.1%，l-脯氨酸0.01%，硫酸钾0.02%，琼脂2.00%，多抗霉素b0.01%，其余为水，ph：6.0-7.0，115℃灭菌25min，备用。
上层培养基组分为：葡萄糖2.0%、土豆20%、琼脂2.0%，其余为水，ph：6.0-7.0，115℃灭菌30min，备用。
发酵培养基组分为：豆饼粉2.0%，玉米粉5.0%，碳酸钙0.2%，磷酸二氢钾0.05%，氯化钠0.05%，其余为水，ph自然，121℃灭菌20min，备用。
s1.将多抗霉素产生菌从保藏的沙土管转接至大试管斜面培养基，28℃培养12d，获得孢子斜面。用接种铲将孢子接入含20颗玻璃珠的种子培养基，28℃，200rpm/min培养2d，收集菌悬液。
s2.用移液枪吸取8mls1中的菌悬液于灭菌干燥处理后的离心管中，3000rpm/min离心10min，弃上清，保留下层菌丝沉淀。依次用10.3%蔗糖水溶液和p缓冲溶液对菌丝冲洗离心（3000rpm/min，10min），再用溶菌酶缓冲液（20mg/ml）：p缓冲液=1:10（v/v）与菌丝混匀，32℃水浴振荡，酶解40min，去除菌丝体细胞壁，得到酶解液，酶解过程每10min对酶解液进行显微镜观察并拍照。脱脂棉过滤酶解液去除未彻底酶解的菌丝片段，收集滤液，再将滤液300rpm/min离心5min，弃下层，上层物质转入新离心管，继续3000rpm/min离心5min，弃上层。向下层物质中加1mlp缓冲液混匀，制得原生质体悬浮液，-20℃冷藏备用。
s3.取原生质体悬浮液在显微镜下用血球计数板计数，再分别用p缓冲溶液和0.01%十二烷基硫酸钠梯度稀释原生质体悬浮液，各取稀释液100μl涂布于再生培养基上，28℃培养，待长出单菌落，进行计数，计算原生质体再生率。
s3.原生质体悬液中加终浓度为5%甘油作为保护剂，混合均匀，取10μl涂于无菌载片上，采用高纯氦气作为artp工作气体，照射距离2mm，气流量8l/min，诱变分两次进行，每次照射60s，中间黑暗条件下间隔1min。无菌操作收集载片至装有含p缓冲液的离心管中，震荡，对诱变后的原生质体悬液进行洗脱，10稀释，取各梯度稀释液100μl涂布于再生培养基上，28℃培养15天，每隔1天对诱变再生的单菌落进行观察标记，选取外形饱满，生长快速的单菌落作为单菌落抑菌效果测试的对象。
s4.根据多抗霉素的抑菌特性选择烟草赤星病菌作为指示菌株，将灭好菌的下层2%水琼脂加热溶解后倒入玻璃大盘，上层培养基与指示菌株混匀平铺在下层培养基上。挑选s3中生长外形饱满、生长速率快的单菌落放于玻璃大盘中，28℃培养20h，通过抑菌圈考察单菌落产多抗霉素量的大小。
s5.从步骤4中挑选的抑菌圈大的单菌落接种至斜面培养基上，28℃培养12d，获得孢子。用接种铲将孢子接种到种子培养基中培养48h至菌丝生长对数期，按2%-10%（v/v）的接种量立即转入发酵培养基摇瓶中进行发酵培养，28℃，200rpm/min摇床震荡培养140h，对发酵液进行酸化过滤，采用杯蝶法测定多抗霉素的赤星效价，同时采用hplc法检测多抗霉素b的含量，从而筛选出效价高，且多抗霉素b含量高的菌株。从试验中选取16株效价较高的菌株（含出发菌株），同时测得菌株产多抗霉素的生物效价和多抗霉素b含量如表1所示。
表1多抗霉素的生物效价和多抗霉素b含量
从表1可以看出，本发明的筛选方法筛选出来的菌株生物效价和多抗霉素b含量相对于出发菌株菌有所提高，其中，菌株7和15的生物效价分别为3409u/ml和3255u/ml，较出发菌株分别提高了70%和62%。菌株7的多抗霉素b含量为2908μg/ml，占组分含量的85%，较出发菌株多抗霉素b的含量提高107%。菌株15的多抗霉素b的含量为2934μg/ml，占组分含量的90%，较出发菌株多抗霉素b的含量提高109%。
实施例2不同酶解时间对原生质体形成与再生的影响
1.试验材料：按实施例1中方法获得处于生长对数期的湿菌体。
2.试验方法：
用20mg/ml溶菌酶处理菌丝体，在32℃条件水浴，分别酶解40、50、60min，得到酶解液。分别取不同酶解时间得到的原生质体悬浮液在显微镜下用血球计数板计数，再分别用p缓冲溶液和0.01%十二烷基硫酸钠梯度稀释原生质体悬浮液，各取稀释液100μl涂布于再生培养基上，28℃培养，待长出单菌落，进行计数，计算原生质体再生率。
3.实验结果：实验结果见表2。
表2不同酶解时间对原生质体形成与再生的影响
从表2可以看出，酶解时间为50min，制备的原生质体再生率最佳；酶解时间为60min，制备的原生质体个数为1.8×108ml-1，相对酶解50min制备的原生质体的个数多，但原生质体再生率为20%，相对酶解50min制备的原生质体再生率降低了13%。
实施例3突变菌株遗传稳定性验证
1.试验材料：选取实施例1获得的多抗霉素高产菌株15（见表1）为试验菌株。
2.试验方法：采用大试管斜面传代，连续转接五代，每一代斜面菌株均采用摇瓶发酵法结合杯碟法及hplc测定每代菌株的效价及含量。
3.实验结果：试验结果见表3。
表3突变菌株遗传稳定性验证
从表3可以看出，菌株15传代过程中，生物效价变化幅度在2%以内，同时，每一代的菌落形态和颜色均没有变化，表现出较好的遗传稳定性。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。