DNA拓扑异构酶Ⅰ的制备方法和表达纯化方法与流程

本发明属于分子生物学和细胞工程领域，特别涉及dna拓扑异构酶ⅰ的制备。

背景技术：

dna拓扑异构酶(dnatopoisomerase)，普遍存在于各类生物种群中，这类酶能够调节核酸空间结构动态变化，在dna的转录，复制以及修复等重要的活动中发挥作用，因此它们是控制核酸生理功能的关键酶，其生理学特性与肿瘤相关性的研究引起人们的广泛关注。dna拓扑异构酶ⅰ是催化dna在不同拓扑异构结构质之间转换的蛋白，真核生物的dna拓扑异构酶ⅰ对特定的核酸序列仅仅表现出一定的偏好性，对特定序列的识别能力未有报道，对其作为体外实验工具酶的实用性带来了限制。

技术实现要素：

为了解决现有各种方法的不足，本发明其中一方面开发了针对真核dna拓扑异构酶ⅰ的缺点，本发明采用重组蛋白制备技术，制备天花病毒的dna拓扑异构酶ⅰ，该蛋白具有识别特异性dna序列5’-(t/c)cctt-3’的特点，且制备过程简便，成本低，为dna拓扑异构酶ⅰ的研究和应用奠定基础。

本发明有以下特点：

产量高：可达到1mg/g菌体的收率；

制备简便：两步纯化即获得纯度高，核酸残留检测合格的样品，工艺简便易于重复；

具有位点特异性：能够切割特定序列且样品活性稳定。

本发明其中一个技术方案提供了一种dna拓扑异构酶ⅰ的制备方法，dna拓扑异构酶ⅰ的制备方法为构建dna拓扑异构酶ⅰ的原核表达载体，转入工程菌中，经培养后，获得表达菌株，然后进行表达纯化。

本发明其中一个技术方案提供了一种dna拓扑异构酶ⅰ的制备方法，上述拓扑异构酶ⅰ到原核表达载体使用pet30a，工程菌为bl21(de3)。

本发明其中一个技术方案提供了一种dna拓扑异构酶ⅰ的制备方法，其中拓扑异构酶ⅰ为重组dna拓扑异构酶ⅰ其氨基酸序列如seqidno.3：

mralfykdgklftdnnflnpvsdnnpayevlqhvkipthltdvvvygqtweealtrlifvgsdskgrrqyfygkmhvqnrnakrdrifvrvynvmkrincfinknikksstdsnyqlavfmlmetmffirfgkmkylkenetvglltlknkhieispdkivikfvgkdkvshefvvhksnrlykpllkltddsspeeflfnklserkvyecikqfgirikdlrtygvnytflynfwtnvksisplpspkklialtikqtaevvghtpsiskraymattilemvkdknfldvvskttfdeflsivvdhvksstdglehhhhhh。

本发明其中一个技术方案提供了一种dna拓扑异构酶ⅰ的表达纯化方法，表达纯化步骤如下：

步骤1，将获得的菌种1：100接种到lb培养基中，37℃，250rmp震荡培养到od600＝0.6时，加入1mmiptg诱导表达，同时低温诱导表达，转离心收菌；

步骤2破菌，菌体总量与破菌缓冲液1∶10混合，超声破菌，转离心收集上清。

本发明其中一个技术方案提供了一种dna拓扑异构酶ⅰ的表达纯化方法，破菌缓冲液为50mmtis-hcl，500mmnacl混合溶液ph8.0。

本发明其中一个技术方案提供了一种dna拓扑异构酶ⅰ的表达纯化方法，纯化的方法为镍柱纯化。

本发明其中一个技术方案提供了一种dna拓扑异构酶ⅰ的表达纯化方法，纯化步骤如下：

步骤3.1第一步平衡：用平衡缓冲液(20mmtris-hcl，ph8.0，500mmnacl，10mm咪唑)平衡柱子，缓冲液及样品中不可有edta，arg等物质，直至ph达到8.0，紫外检测读数稳定，一般为5～10个柱体积，检测调零后可以上样。

步骤3.2第二步上样：样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，收集流出。

步骤3.3第三步平衡：上样结束，用平衡缓冲液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定。

步骤3.4第四步预洗：用预洗缓冲液(20mmtris-hcl，ph8.0，500mmnacl，50mm咪唑)预洗，收集洗脱组分。

步骤3.5第五步洗脱：用洗脱液(20mmtris-hcl，ph8.0，500mmnacl，200mm咪唑)洗脱目标蛋白，收集洗脱组分。

步骤3.6第六步洗柱：用洗柱缓冲液(20mmtris-hcl，ph8.0，500mmnacl，500mm咪唑)冲洗层析柱，收集洗脱组分。

本发明其中一个技术方案提供了一种dna拓扑异构酶ⅰ的表达纯化方法，步骤3.6后再经过疏水柱纯化，所述再经过疏水柱纯化步骤如下：

4.1第一步平衡：用缓冲液(20mmtris,1m(nh4)2so4,ph8.0)平衡柱子，直至紫外检测读数稳定，一般为5～10个柱体积，检测调零后可以上样。

4.2第二步上样：样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，样品中离子强度不宜超过5ms/cm，收集流出。

4.3第三步平衡：上样结束，用平衡液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定。

4.4第四步洗脱：用不同盐浓度:1)20mmtris,800mm(nh4)2so4,ph8.0；2)20mmtris,400mm(nh4)2so4,ph8.0；3)20mmtris,200mm(nh4)2so4,ph8.0；4)20mmtris,ph8.0；5)ddh2o

收集低盐洗脱的蛋白质样品，得到所需的dna拓扑异构酶ⅰ。

本发明其中一个技术方案提供了一种dna拓扑异构酶ⅰ的活性检测方法，该活性检测方法使用上述任意一种方法获得的dna拓扑异构酶ⅰ作用于底物a和b，能够连接成大片段则证明制备的重组dna拓扑异构酶ⅰ具有识别并切割5’-(t/c)cctt-3’序列的活性。

本发明其中一个技术方案提供了一种dna拓扑异构酶ⅰ的活性检测方法，上述底物a和b的序列分别为seqidno.1和seqidno.2。

附图说明

图1、为本发明其一个实施例中电泳图；

图2、为本发明另一个实施例中电泳图。

具体实施方式

下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。下面将结合附图对本发明作进一步的说明。

实施例1：dna拓扑异构酶ⅰ的制备

构建dna拓扑异构酶ⅰ到原核表达载体pet30a，转入工程菌中，经培养后，获得表达菌株。

重组dna拓扑异构酶ⅰ氨基酸序列：

mralfykdgklftdnnflnpvsdnnpayevlqhvkipthltdvvvygqtweealtrlifvgsdskgrrqyfygkmhvqnrnakrdrifvrvynvmkrincfinknikksstdsnyqlavfmlmetmffirfgkmkylkenetvglltlknkhieispdkivikfvgkdkvshefvvhksnrlykpllkltddsspeeflfnklserkvyecikqfgirikdlrtygvnytflynfwtnvksisplpspkklialtikqtaevvghtpsiskraymattilemvkdknfldvvskttfdeflsivvdhvksstdglehhhhhh*。

然后进行表达纯化：

1.将获得的bl21(de3)菌种1：100接种到lb培养基中，37℃，250rmp震荡培养到od600＝0.6时，加入1mmiptg诱导表达，为了提高蛋白可溶性表达的比例，同时将培养温度降至20℃，低温诱导表达过夜(16h)，5k转离心收菌。

2.破菌∶菌体总量与破菌缓冲液(50mmtis-hcl，ph8.0，500mmnacl)1:10混合，即1g菌体加入10ml缓冲液，超声破菌。12k转离心30min收集上清，过ni柱纯化。

3.chelatingsff(ni)-ff柱纯化：

3.1第一步平衡：用平衡缓冲液(20mmtris-hcl，ph8.0，500mmnacl，10mm咪唑)平衡柱子，缓冲液及样品中不可有edta，arg等物质，直至ph达到8.0，紫外检测读数稳定，一般为5～10个柱体积，检测调零后可以上样。

3.2第二步上样：样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，收集流出。

3.3第三步平衡：上样结束，用平衡缓冲液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定。

3.4第四步预洗：用预洗缓冲液(20mmtris-hcl，ph8.0，500mmnacl，50mm咪唑)预洗，收集洗脱组分。

3.5第五步洗脱：用洗脱液(20mmtris-hcl，ph8.0，500mmnacl，200mm咪唑)洗脱目标蛋白，收集洗脱组分。

3.6第六步洗柱：用洗柱缓冲液(20mmtris-hcl，ph8.0，500mmnacl，500mm咪唑)冲洗层析柱，收集洗脱组分。

4.为了去除蛋白中微量的但会影响后期实验的宿主残留dna或质粒dna，样品会再经过疏水柱纯化(phenylhp)。疏水柱纯化具体步骤如下：

4.1第一步平衡：用缓冲液(20mmtris,1m(nh4)2so4,ph8.0)平衡柱子，直至紫外检测读数稳定，一般为5～10个柱体积，检测调零后可以上样。

4.2第二步上样：样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，样品中离子强度不宜超过5ms/cm，收集流出。

4.3第三步平衡：上样结束，用平衡液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定。

4.4第四步洗脱：用不同盐浓度:1)20mmtris,800mm(nh4)2so4,ph8.0；2)20mmtris,400mm(nh4)2so4,ph8.0；3)20mmtris,200mm(nh4)2so4,ph8.0；4)20mmtris,ph8.0；5)ddh2o

分步洗脱，分步收集各个洗脱组分。因为残留dna一般在高盐组分中，所以收集低盐洗脱的蛋白质样品。

最后得到我们所需的dna拓扑异构酶ⅰ(如图1所示)：

图1中泳道mk：molecularweightmarker；泳道1：finalproduct(3μg,reduced)；泳道2：finalproduct(3μg,non-reduced)。

酶储存溶液：10mmtris-hcl(ph7.5),1mmdtt,0.1mmedta,50mmkcl,35mm(nh4)2so4and50％(v/v)glycerol.

实例2：dna拓扑异构酶ⅰ活性检测

pcr扩增特定底物a和b，再将两种底物反应体系进行跑胶回收。

底物a序列seqidno.1：

aattgttatccgctcacaattcccctatagtgagtcgtattaatttcgcgggatcgagatcgatctcgatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagcgagagcgtcgagatcccggacaccatcgaatggcgcaaaacctgtcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacac

底物b序列seqidno.2:

cccttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctcagaattaaccctcactaaatggactagtcctgcaggtttaaacgaattcgccgttaagcgcgaattcgcggccgctaaattcaattcgccctatagtgagtcgtattacaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatcccgctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcacttcccaacagttgcgcagcctatacgtacggcagtttaaggtttacacctataaaagagagagccgttatcgtctgtttgtggatgtacagagtgatattattgacacgccggggcgacggatggtgatccccctggccagtgcacgtctgctgtcagataaagtctcccgtgaactttacccggtggtgcatatcggggatgaaagctggcgcatgatgaccaccgatatggccagtgtgccggtctccgttatcggggaagaagtggctgatctcagccaccgcgaaaatgacatcaaaaacgccattaacctgatgttctggggaatataaatgtcaggcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttcacgtagaaagccagtccgcagaaacggtgctgaccccggatgaatgtcagctactgggctatctggacatgggaaaacgcaagcgcaaagagaaagcaggtagcttgcagtgggcttacatggcgatagctagactgggcggttttatggacagcaagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactggatggctttctcgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagctctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggcagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgaattattaacgcttacaatttcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatacaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaaggaccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaaggg

上述序列5’到3’。

两种回收片段以dna拓扑异构酶ⅰ作用底物a和b能够连接成大片段，证明我们制备的重组dna拓扑异构酶ⅰ具有识别并切割5’-(t/c)cctt-3’序列的活性。底物及连接片段的电泳图如图2所示：

图2中泳道1：底物a；泳道2：底物b；泳道3：底物a和b连接片段；泳道m：dnaladder5000。

上述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。

序列表

<110>吴江近岸蛋白质科技有限公司

<120>dna拓扑异构酶ⅰ的制备方法和表达纯化方法

<130>2019

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>895

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<221>

<223>人工设计

<400>1

aattgttatccgctcacaattcccctatagtgagtcgtattaatttcgcgggatcgagat60

cgatctcgatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcgg120

ttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggc180

tcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgg240

gcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctac300

tactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagcgagagcgtcgagatcccggacacc360

atcgaatggcgcaaaacctgtcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattc420

agggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctct480

tatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaa540

aaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactg600

gcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccg660

tcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtg720

tcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcg780

caacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtg840

gaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacac895

<210>3

<211>3106

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<221>

<223>人工设计

<400>3

cccttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtga60

gcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattc120

attaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaa180

ttaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctc240

gtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatg300

attacgccaagctcagaattaaccctcactaaatggactagtcctgcaggtttaaacgaa360

ttcgccgttaagcgcgaattcgcggccgctaaattcaattcgccctatagtgagtcgtat420

tacaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaa480

cttaatcgccttgcagcacatcccgctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgc540

accgatcgcacttcccaacagttgcgcagcctatacgtacggcagtttaaggtttacacc600

tataaaagagagagccgttatcgtctgtttgtggatgtacagagtgatattattgacacg660

ccggggcgacggatggtgatccccctggccagtgcacgtctgctgtcagataaagtctcc720

cgtgaactttacccggtggtgcatatcggggatgaaagctggcgcatgatgaccaccgat780

atggccagtgtgccggtctccgttatcggggaagaagtggctgatctcagccaccgcgaa840

aatgacatcaaaaacgccattaacctgatgttctggggaatataaatgtcaggcatgaga900

ttatcaaaaaggatcttcacctagatccttttcacgtagaaagccagtccgcagaaacgg960

tgctgaccccggatgaatgtcagctactgggctatctggacatgggaaaacgcaagcgca1020

aagagaaagcaggtagcttgcagtgggcttacatggcgatagctagactgggcggtttta1080

tggacagcaagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccc1140

tgcaaagtaaactggatggctttctcgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagc1200

tctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgca1260

ggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatc1320

ggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtc1380

aagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtgg1440

ctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggcagg1500

gactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcct1560

gccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggct1620

acctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaa1680

gccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaa1740

ctgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggc1800

gatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgt1860

ggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgct1920

gaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctccc1980

gattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgaattattaacgct2040

tacaatttcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcata2100

caggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatac2160

attcaaatatgtatccgctcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaa2220

attaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagtt2280

accaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatag2340

ttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggcccca2400

gtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaacc2460

agccagccggaaggaccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagt2520

ctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacg2580

ttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattca2640

gctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcgg2700

ttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactca2760

tggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctg2820

tgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgct2880

cttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctca2940

tcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatcca3000

gttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcg3060

tttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaaggg3106

<210>3

<211>322

<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<221>

<223>人工设计

<400>3

metargalaleuphetyrlysaspglylysleuphethraspasnasn

151015

pheleuasnprovalseraspasnasnproalatyrgluvalleugln

202530

hisvallysileprothrhisleuthraspvalvalvaltyrglygln

354045

thrtrpgluglualaleuthrargleuilephevalglyseraspser

505560

lysglyargargglntyrphetyrglylysmethisvalglnasnarg

65707580

asnalalysargaspargilephevalargvaltyrasnvalmetlys

859095

argileasncyspheileasnlysasnilelyslysserserthrasp

100105110

serasntyrglnleualavalphemetleumetgluthrmetphephe

115120125

ileargpheglylysmetlystyrleulysgluasngluthrvalgly

130135140

leuleuthrleulysasnlyshisilegluileserproasplysile

145150155160

valilelysphevalglylysasplysvalserhisgluphevalval

165170175

hislysserasnargleutyrlysproleuleulysleuthraspasp

180185190

serserprogluglupheleupheasnlysleusergluarglysval

195200205

tyrglucysilelysglnpheglyileargilelysaspleuargthr

210215220

tyrglyvalasntyrthrpheleutyrasnphetrpthrasnvallys

225230235240

serileserproleuproserprolyslysleuilealaleuthrile

245250255

lysglnthralagluvalvalglyhisthrproserileserlysarg

260265270

alatyrmetalathrthrileleuglumetvallysasplysasnphe

275280285

leuaspvalvalserlysthrthrpheaspglupheleuserileval

290295300

valasphisvallysserserthraspglyleugluhishishishis

305310315320

hishis