一种新型脂肪酶及其制备与应用的制作方法

本发明属于酶的基因工程
技术领域：
，具体涉及一种耐碱性能提升的脂肪酶突变体及其制备与应用。
背景技术：
：脂肪酶(lipase,e.c.3.1.1.3)，全称为三酰基甘油酯基水解酶(triacylglyce-rolacylhydrolase)，隶属于羧基酯水解酶类，它能催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单脂，主要分布在动植物和微生物组织中。动物中的脂肪酶其含量及活性不高就会造成工业生产程度也不高。植物中的脂肪酶主要存在于油脂丰富的油料种子中，因为酶活力差异较大，所以对植物脂肪酶的研究也就相对较少。由于微生物种类多、繁殖快，拥有更为宽泛的反应ph值、反应温度和底物选择性，且微生物脂肪酶一般是胞外酶。因此，微生物脂肪酶是工业脂肪酶的重要来源。已有报道，产脂肪酶的微生物至少有65个属，其中细菌28个属，酵母菌10个属，其他真菌23个属以及放线菌4个。总体而言，脂肪酶由于其分布广泛，其催化反应多样，且能在有机相体系中进行催化反应，脂肪酶的反应条件温和，对环境污染小，成本低廉，因此广泛应用于洗涤剂、制革、造纸、纺织、食品、药品、化工等领域。目前，微生物脂肪酶作为一种重要的工业酶，在传统工业和新型的产业中都有广泛的应用，一直是行业中的研究热点。与其他水解酶类相比，不同类型脂肪酶的应用严格受限于其活性、专一性、最适温度和ph值、温度和酸碱稳定性、溶剂耐受性等酶学性质，因此市场对酶制剂的各项性质和指标提出了更高的要求。微生物脂肪酶基因和蛋白相关资源信息虽丰富，但适合食品、药品和能源等工业应用的脂肪酶制剂品种依然较少，所以筛选到合适的脂肪酶及其编码基因是脂肪酶研发的重要基础。目前，已发现的脂肪酶中有一些表现出了一定的碱耐受性，但仍需进一步提升其耐碱性能，以适应各行业的需要。定向进化属于蛋白质的非理性设计，属于蛋白质工程的范畴。定向进化是指模拟自然选择的进化机制，通过分子生物学手段在体外快速建立含大量目的蛋白编码基因的突变体文库，并通过高通量的定向筛选方法，快速得到符合人类应用价值的蛋白突变体。定向进化与自然进化都遵循试错法的策略，通过不断的实验尝试获得符合预期的突变体。由于定向进化不需要获得蛋白的高级结构以及催化位点等结构，因此只须对蛋白氨基酸序列做随机突变，这是蛋白质工程的重要研究手段。定向进化的核心步骤主要包括两部分，即构建具有多样性的突变体文库和高通量的筛选方法。常用的包括：易错pcr、dna改组、交错延伸过程、随机引导重组、截断状模板重组延伸等。与此不同，需要事先了解蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素，并根据这些因素有的放矢做对其dna进行改造的是定点突变，即理性设计。枯草芽孢杆属于革兰氏阳性菌，无致病性，不产生任何内毒素，作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种已广泛应用于工业、农业、医药、卫生、食品、畜牧业、水产及科研领域。枯草芽孢杆菌并且属于人体肠道菌，能促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道ph值，间接抑制其它致病菌生长。此外枯草芽孢杆菌作为基因工程受体菌，可表达出近200种原核和真核生物来源的蛋白基因。在微生物遗传学领域，芽孢杆菌属背景研究的也十分清楚，密码子偏爱性不明显、发酵简单、生长迅速、对培养基无特殊要求等优点。它与常用的大肠杆菌表达系统相比有着独特的优势，即可将目的基因表达的产物分泌到胞外，从而降低进一步收集、分离、纯化基因表达产物的成本和工作量。毕赤酵母属于单细胞低等真核生物，是表达外源基因比较理想的工具。它具有多种优异的特点，如遗传操作简单，外源基因整合于毕赤酵母基因组中，对外源蛋白进行翻译后修饰及在基础培养基中实现高密度发酵等。近年来毕赤酵母逐渐发展为一种有效的异源蛋白表达系统，并采用严谨调控的aox(醇氧化酶基因)启动子，可用甲醇严格地调控外源基因的表达。毕赤酵母碳源一般为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，故培养成本低，产物易分离，能够对外源蛋白基因进行稳定遗传，且作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。毕赤酵母表达系统已成为现代分子生物学研究最重要的工具和模型，最常用的宿主菌包括组氨酸缺陷型菌株gs115、野生型x-33、醇氧化酶基因敲除宿主菌km71和km71h以及蛋白酶缺陷型菌株smd1168和smd1168h等。此外，毕赤酵母细胞表面展示系统不但具有外源基因的翻译后加工能力和蛋白的折叠加工及适度糖基化等优点，而且经该系统得到的全细胞催化剂可以重复利用从而降低生产成本。技术实现要素：基于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种耐碱性提高的新型脂肪酶及其制备与应用。实现本发明目的的技术路线概述如下：通过基本的分子生物学技术手段获得圆弧青霉野生型的脂肪酶基因，通过酶切、连接等构建重组载体之后，利用易错pcr技术对大肠杆菌密码子优化后的野生型脂肪酶基因进行随机突变，得到脂肪酶突变体n157f，及其编码基因mpcl，重新构建重组载体，并实现了其在枯草芽孢杆菌wb600和毕赤酵母gs115中的高效表达，通过发酵、提取等技术获得耐碱性能提高的脂肪酶突变体。在本发明中采用如下定义：1.氨基酸和dna核酸序列的命名法使用氨基酸残基的公认iupac命名法，用三字母代码形式。dna核酸序列采用公认iupac命名法。2.脂肪酶突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸。如asn157phe，表示位置157的氨基酸由野生型脂肪酶的asn替换成phe，位置的编号对应于seqidno.1中野生型脂肪酶的氨基酸序列编号。在本发明中，小写斜体pcl表示野生型脂肪酶的编码基因，小写斜体mpcl表示突变体脂肪酶n157f的编码基因，信息如下表。脂肪酶氨基酸突变位点基因突变位点氨基酸seqidno.核苷酸seqidno.野生型——12n157fasn157pheaac→ttc34所述的脂肪酶突变体及其编码基因的宿主细胞为枯草芽孢杆菌wb600，表达载体为pbsa43；所述的脂肪酶突变体及其编码基因的宿主细胞为毕赤酵母gs115，表达载体为ppic9k；所述的脂肪酶突变体及其编码基因的宿主细胞为毕赤酵母gs115，展示载体为ppic9k-flo。本发明的实验方案具体如下：1、所述耐碱性能提升的脂肪酶突变体编码基因的获得，包括如下步骤：(1)将大肠杆菌密码子优化后的圆弧青霉野生型脂肪酶基因pcl(seqidno.5)与载体pet-22b(+)连接，构建重组质粒pet-pcl，以pet-pcl为模板通过易错pcr随机突变野生型脂肪酶基因，得到耐碱性能提升的脂肪酶突变体编码基因mpcl；(2)将含有耐碱性能提高的脂肪酶突变体编码基因的质粒pet-mpcl保存。2、一株含耐碱性能提高的脂肪酶基因的枯草芽孢杆菌重组菌株及以其制备耐碱脂肪酶的过程，包括如下步骤：(1)将脂肪酶突变体编码基因mpcl进行枯草杆菌密码子优化后的基因(seqidno.6)，与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pbsa43通过连接得到新的重组质粒；(2)将重组质粒转入枯草芽孢杆菌wb600中，得到重组菌株，之后将重组菌株进行培养发酵，得到耐碱性能提高的脂肪酶。3、一株含有耐碱性能提高的脂肪酶基因的毕赤酵母重组菌株及以其制备耐碱性能提高的脂肪酶的过程，包括如下步骤：(1)将脂肪酶突变体编码基因mpcl进行毕赤酵母密码子优化后的基因(seqidno.7)，与表达载体ppic9k通过连接得到新的重组质粒；(2)将重组质粒转入毕赤酵母gs115中，得到的重组菌株经过遗传霉素筛选和脂肪酶的酶活测定，得到耐碱性能提高的脂肪酶的高产菌株；(3)之后进行发酵，制备耐碱性能提高的脂肪酶。4、一株含有耐碱性能提高的脂肪酶基因的毕赤酵母细胞表面展示重组菌株及以其制备耐碱性能提高的脂肪酶全细胞催化剂的过程，包括如下步骤：(1)将脂肪酶突变体编码基因mpcl进行毕赤酵母密码子优化后的基因(seqidno.7)，与毕赤酵母展示载体ppic9k-flo通过连接得到新的重组质粒；(2)将重组质粒转入宿主菌株毕赤酵母gs115中，得到毕赤酵母细胞表面展示脂肪酶重组菌株。(3)将重组菌株发酵后制备耐碱性提高的脂肪酶全细胞催化剂。所述脂肪酶突变体n157f的酶学特性如下：(1)酶活：枯草芽孢表达系统脂肪酶酶活为5000-6000u/ml；毕赤酵母游离表达系统脂肪酶酶活为6000-7000u/ml；毕赤酵母表面展示表达系统脂肪酶酶活为2000-3000u/g。(2)最适反应温度：23-27℃。(3)最适反应ph：9.5-10.5。(4)ph稳定性：在ph分别为9，10，11的条件下，30℃保温120min后，突变体脂肪酶活的残余酶活分别为72％，82％，70％；相比之下野生型的残余酶活分别为54％，61％，47％。本发明还提供上述脂肪酶突变体n157f及其编码基因的应用。有益效果：1、本发明利用易错pcr技术对野生型脂肪酶进行随机突变，得到耐碱性提高的突变体n157f，在ph分别为9，10，11时，30℃分别保温40、80、120min后，发现突变体脂肪酶与野生型脂肪酶相比随着保温时间的增加稳定性有所提高。ph为9时，保温120min后，突变体脂肪酶残余酶活比野生型酶活提高18％；ph为10时，保温120min后，突变体脂肪酶残余酶活比野生型酶活提高21％；ph为11时，保温120min后，突变体脂肪酶残余酶活比野生型酶活提高23％。2、本发明分别使用了枯草芽孢杆菌表达系统、毕赤酵母表达系统、毕赤酵母表面展示系统，实现耐碱性能提高的脂肪酶突变体不同方式的高效表达。附图说明：图1为本发明野生型脂肪酶基因的pcr扩增电泳图其中：m为dnamarker，1为脂肪酶基因；图2为本发明重组质粒pbsa43-bsmpcl酶切验证图其中：m为dnamarker，1为pbsa43-bsmpcl经bamhi和hindiii双酶切；图3为本发明重组质粒ppic9k-ppmpcl酶切验证图其中：m为dnamarker，1为ppic9k-ppmpcl经ecori和noti双酶切；图4为本发明重组质粒ppic9k-flo-ppmpcl酶切验证图其中：m为dnamarker，1为ppic9k-flo-ppmpcl经过snabi和ecori双酶切。具体实施方式：下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。本发明实施例所用培养基如下：pda培养基(100ml)：100ml土豆汁，2.0g葡萄糖。lb培养基(g/l)：酵母提取物5.0，胰蛋白胨10.0，nacl10.0。md培养基(g/l)：ynb13.4，葡萄糖20，生物素4×10-4。ypd培养基(g/l)：酵母提取物10，蛋白胨20，葡萄糖20。bmgy培养基(g/l)：ynb13.4，酵母提取物10，蛋白胨20，甘油10，生物素4×10-4，ph6.0。bmmy培养基(g/l)：ynb13.4，酵母提取物10，蛋白胨20，甲醇5g，生物素4×10-4，ph6.0。上述培养基的固体培养基均添加2％琼脂。实施例1：野生型脂肪酶基因的获得1.野生型脂肪酶基因来自圆弧青霉(penicilliumcyclopium)cicc41049菌株，提取其总rna。(1)菌株活化：从甘油管中吸取100μl保存的圆弧青霉孢子液，均匀涂布于pda茄子瓶内，28℃恒温培养5d；(2)转接：用无菌水将茄子瓶内孢子洗下，12000r/min离心1min，反复清洗，最后转接于50ml的pda液体培养基中，置于摇床中，28℃，200r/min，培养2d；(3)收集菌体：用双层灭菌的纱布，过滤菌体，并用无菌水冲洗，拧干，将菌体放置研钵内，加入液氮研磨至粉末；(4)加入trizol：将研磨后的粉末分别取少量分装至ep管中，各管内加入1mltrizol试剂，室温旋窝震荡10min，冰上放置15min；(5)酚仿抽提：每1mltrizol试剂加入0.2μl的氯仿，震荡15s，室温放置3min，在4℃下，12000r/min离心15min，将上清转移至新的ep管中，再加入等体积的酚仿，在4℃下，12000r/min离心10min，取上清，重复酚仿抽提一次；(6)沉降：加入等体积的异丙醇，混匀，-70℃放置20min，取出在4℃下12000r/min离心10min，除去上清；(7)清洗与晾干：加入500μl的75％的乙醇，4℃下12000r/min离心5min，重复一次，其中75％乙醇是由depc处理水与乙醇按比例混合而成，空离一次，倒置晾干；(8)保存：晾干后加入50μl的depc处理水，混匀，取出部分立即在经过depc处理过的水配制的1％琼脂糖凝胶上点样电泳，剩余部分经过55℃水浴10min，放置于-70℃保存。2.反转录(1)取总rna2μg，加入10mmdntp，oligodt(0.5μg/μl)各1μl，；(2)70℃加热5min，冰上放置2min；(3)离心数秒，使模版和rna引物变性，聚集于ep管底部；(4)在同一管中加入10×primerscripebuffer2μl，rnase抑制剂1μl，反转录酶primerscripereversetranscriptase(50unit/μl)1μl以及rnasefreeh2o4.5μl(注：上述试剂均购自北京百泰克生物技术有限公司)；(5)轻轻混匀后置于42℃，60min。然后置70℃，保温15分钟，可直接用于pcr。3.扩增野生型脂肪酶基因设计野生型脂肪酶基因的扩增引物，序列如下：上游p1(seqidno.8)：cgcggatccgcaactgctgacgccgctgc下游p2(seqidno.9)：cccaagctttcagctcagatagccacaaccagcapcr扩增的反应体系为50μl，其组成为：2×labuffer25μldntps(2.5mmol/l)2μl上游引物p1(20μmol/l)5μl下游引物p2(20μmol/l)5μl模板cdna2μllataqdna聚合酶0.5μlddh2o10.5μl总体积50μl注：上述所需试剂来自宝生物工程有限公司takara。扩增程序的设置为：a.预变性:95℃5min；b.变性：95℃30s；c.退火：70℃45s；d.延伸：72℃90s；e.b-d反应30个循环；f.延伸:72℃10min。将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，可以看到圆弧青霉野生型脂肪酶基因的条带，共774bp(见图1)，再由小量dna回收试剂盒回收pcr产物，得到了野生型脂肪酶基因，送测序公司进行测序，获得野生型基因序列，并由基因合成公司进行大肠杆菌密码子优化，获得优化后野生型基因序列，即pcl(seqidno.5所示)。实施例2：脂肪酶突变体n157f的获得1.将大肠杆菌密码子优化后的野生型脂肪酶基因与pet-22b(+)载体进行连接。纯化后的pcl与pet-22b(+)载体进行连接，随后将重组质粒化转入大肠杆菌dh5α中，通过bamhi和hindiii双酶切，成功验证大肠杆菌密码子优化后的野生型脂肪酶基因已克隆至pet-22b(+)载体上构建了重组质粒pet-pcl。2.易错pcr：以上述构建的重组质粒pet-pcl为模板，其反应体系如下：ddh2o21μl重组质粒pet-pcl(5ng/μl)1μl上游引物p1(10μmol/l)2μl下游引物p2(10μmol/l)2μltaqdna聚合酶0.5μl10×taqbuffer5μldatp(10mmol/l)1μldgtp(10mmol/l)1μldttp(10mmol/l)5μldctp(10mmol/l)5μlmgcl2(25mmol/l)10μlmncl2(10mmol/l)1.25μl注：上述所需试剂来自宝生物工程有限公司takara。体系完成后，进行易错pcr反应，程序设置如下：a.预变性:95℃5min；b.变性：95℃30s；c.退火：70℃45s；d.延伸：72℃90s；e.b-d反应35个循环；f.延伸:72℃10min。pcr反应结束后，将pcr产物与载体质粒进行bamhi和hindiii双酶切，经过纯化回收，易错pcr产物与同样经过双酶切的载体质粒pet-22b(+)进行连接，通过化转至e.colibl21(de3)中，涂布于含ampr(100μg/ml)的lb的固体平板中，37℃培养箱静置培养12h，得到转化子。3.筛选方法：对硝基苯酚酯(p-nitrophenylester)是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pnp在碱性条件下显黄色，在405nm下有吸光值，且灵敏度很高且检测方便，非常适合于菌株的筛选。由于发酵上清存在目的蛋白，可以直接用发酵上清进行筛选。提前称取30mg对硝基苯酚酯至10ml异丙醇中配制成底物，配好后按1:9加入底物和0.05mph8.0的pbs缓冲液，配制成对硝基苯酚酯反应液。4.突变体文库的筛选：在96孔板中每个孔中加入200μl含ampr(100μg/ml)的lb液体培养基，随后，用灭过菌的牙签挑取每一个转化子的单克隆至96孔板中，挑取过程中尽可能使得每次都刚好沾到少量的菌。将96孔板转移至摇床培养，160r/min，37℃培养至od600达到0.6-0.8，此时加入iptg，至终浓度为0.5mm，随后进行低温诱导，16℃，160r/min培养16h。经过4000r/min离心10min(4℃下)，取50μl离心上清加入到含200μl对硝基苯酚酯反应液的96孔板中，检测出具有酶活的突变体后，这些突变体剩余发酵上清被均匀的分至两个一样的96孔板中，每个孔中50μl。板1立即检测酶活力，用排枪取200μl的反应液加入到各个孔中，在25℃的酶标仪内准确反应10min后，检测od405。而板2放置在ph11.0的pbs缓冲液中，25℃保温30min，随后冰上放置10min后按同样方法在25℃下检测酶活力。5.选取在碱性条件下稳定性提高的突变体。根据板1与板2的情况，计算每个突变体的残余酶活，选取相较于野生型耐碱性能提升的突变体，对选取的突变体进行酶活与耐碱性能的重复实验后，选取相对野生型耐碱性能明显提高的突变体接入平板，并送出菌样进行测序。经过上述步骤的易错pcr，选取出耐碱性能提高的突变体，测序后得到其中含有一个氨基酸突变，即n157f(aac→ttc)，从而获得脂肪酶突变体n157f，及其编码基因mpcl(seqidno.4)。实施例3：枯草芽孢杆菌耐碱性能提高的脂肪酶重组菌的构建1.表达载体pbsa43的构建以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭克隆载体pbe2为骨架，克隆入一个强的芽孢杆菌组成型启动子p43(seqidno.10)和能够使重组蛋白直接分泌到培养基中的果聚糖蔗糖酶信号序列sacb(seqidno.11)获得了表达载体pbsa43。它带有ampr和kanar基因，可以在大肠杆菌中利用氨苄青霉素抗性作为筛选标记，同时又可以在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中利用卡那霉素抗性作为筛选标记。2.构建耐碱性能提升的脂肪酶表达质粒pbsa43-bsmpcl将枯草芽孢杆菌密码子优化后的脂肪酶突变体基因bsmpcl(seqidno.6)与枯草芽孢杆菌表达载体pbsa43都经bamhi和hindiii双酶切，随后进行连接，构建得到重组质粒pbsa43-bsmpcl，转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑选阳性转化子，提取质粒进行酶切验证(如图2所示)并测序，确定构建成功，即获得重组表达质粒pbsa43-bsmpcl。3.表达质粒pbsa43-bsmpcl转化枯草芽孢杆菌wb600向预冷的1mm电转杯中加入60μl感受态细胞和1μl(50ng/μl)pbsa43-mpcl，混匀并冰浴5min，设置参数(25μf，200ω，4.5-5.0ms)，电击一次，随后立即加入1ml复苏培养基(lb+0.5mol/l山梨醇+0.5mol/l甘露醇)，混匀后吸取至1.5mlep管中，37℃摇床震荡培养3h，离心后留取200μl复苏物涂布在具有抗性的lb平板上，37℃培养24h，挑取转化子，提质粒、酶切验证，得到枯草芽孢杆菌重组菌株wb600/pbsa43-bsmpcl。实施例4：构建毕赤酵母耐碱性能提升的脂肪酶游离表达重组菌1.耐碱性能提高的脂肪酶表达载体ppic9k-mpcl的构建将毕赤酵母密码子优化后的脂肪酶突变体基因ppmpcl(seqidno.7)和毕赤酵母表达载体ppic9k经过ecori和noti双酶切，随后进行连接，转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，选择ampr的阳性转化子，菌落培养后提质粒，酶切验证成功(如图3所示)，即得到重组表达载体ppic9k-ppmpcl。2.构建耐碱性能提升的脂肪酶高表达重组菌株(1)质粒dna的线性化在转化毕赤酵母gs115之前，分别用saci和sali限制性内切酶对重组表达质粒ppic9k-ppmpcl进行线性化。(2)将线性化质粒ppic9k-ppmpcl电转至毕赤酵母①将感受态细胞与线性化质粒ppic9k-ppmpcl加入到1.5ml预冷的离心管中，吹打混匀，随后加入预冷的电转杯中；②对转化杯冰浴10min，随后电转化；③电击后，立即加入1ml预冷的1mol/l的山梨醇溶液于电转杯中，并将电转液转移到新的1.5ml离心管中；④30℃静置培养1-2h，吸取毕赤酵母gs115电转液200μl涂布在md培养基上。(3)阳性转化子的鉴定及脂肪酶高产菌株的筛选①涂有电转液的md平板在30℃培养2-3d；②挑取转化子，提取酵母基因组，稀释100倍后作为模板进行pcr。另以转入空质粒ppic9k的毕赤酵母gs115/ppic9k作为对照，确定阳性转化子。③确定阳性转化子后，先挑取在含不同浓度遗传霉素抗性平板上单菌落比较大的高遗传霉素抗性转化子，随后分别测定挑选出的转化子的脂肪酶酶活，从而得到脂肪酶的高产菌株gs115/ppic9k-ppmpcl。实施例5：毕赤酵母细胞表面展示耐碱性能提升的脂肪酶重组菌的构建1.重组表达质粒ppic9k-flo-mpcl的构建将毕赤酵母密码子优化后的脂肪酶突变体基因ppmpcl(seqidno.7)和毕赤酵母表面展示表达载体ppic9k-flo经过snabi和ecori双酶切，随后进行连接，转化至大肠杆菌dh5α感受态中，选择ampr的阳性转化子，菌落培养后提质粒，酶切验证成功(如图4所示)，即得到重组表达载体ppic9k-flo-ppmpcl。2.毕赤酵母重组菌的构建将测序验证正确的重组表达载体ppic9k-flo-ppmpcl经sali线性化后，用电转化法转化毕赤酵母gs115，md平板筛选重组子，获得毕赤酵母细胞表面展示耐碱性能提升的脂肪酶重组菌gs115/ppic9k-flo-ppmpcl。实施例6：耐碱性能提升的脂肪酶在枯草芽孢杆菌重组菌中的表达及制备1.将枯草芽孢杆菌重组菌株wb600/pbsa43-bsmpcl接种于含卡纳霉素(50μg/ml)的lb液体培养基中，37℃，220r/min培养过夜；2.按1％接种量转接于50ml的lb培养基中，37℃，220r/min培养48h，离心收集发酵上清，即得到耐碱性能提升的脂肪酶粗酶液；3.随后采用分级盐析法沉淀酶蛋白，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得耐碱性能提升的脂肪酶纯酶n157f酶粉。实施例7：耐碱性能提升的脂肪酶在毕赤酵母游离表达重组菌中的表达及制备1.挑取ypd平板上的毕赤酵母重组菌gs115/ppic9k-ppmpcl接种至50ml的ypd液体培养基中，30℃、250r/min培养24h；2.以1％的接种量转接至bmgy培养基中，30℃，250r/min培养约24h，随后4000r/min离心5min得到菌体，转接至bmmy培养基；3.继续培养，30℃，250r/min，每隔24h补加250μl甲醇,在培养5d后，离心收集发酵上清，即得到脂肪酶的粗酶液；4.然后采用分级盐析法沉淀酶蛋白，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得耐碱性能提高的脂肪酶n157f纯酶酶粉。实施例8：毕赤酵母细胞表面展示耐碱性能提高的脂肪酶全细胞催化剂的制备1.挑取ypd平板上的毕赤酵母细胞表面展示耐碱性能提高的脂肪酶重组菌gs115/ppic9k-flo-ppmpcl接种至50ml的ypd液体培养基中，30℃、250r/min培养24h；2.以1％的接种量转接到新鲜bmgy培养基中，30℃，250r/min培养约24h，随后4000r/min离心5min得到菌体，转接至bmmy培养基；3.继续培养，30℃，250r/min，每隔24h补加250μl甲醇。在培养5d后，离心收集取菌体，用过膜水冲洗1-2次，经真空冷冻干燥制得毕赤酵母细胞表面展示耐碱性能提高的脂肪酶n157f细胞催化剂。实施例9：脂肪酶酶活力和耐碱性能测定1.脂肪酶酶活测定原理在油水界面，脂肪酶可以将天然底物如橄榄油水解为甘油酯类和脂肪酸，通过使用标准浓度的naoh滴定，可以定量计算出脂肪酶在一定时间内的水解效率，从而得到其酶活力大小。2.脂肪酶酶活的定义1.0g固体酶粉或者1.0ml液体酶，在一定温度和ph条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定脂肪酸，即1个酶活力单位(u/g或u/ml)。3.脂肪酶酶活测定方法与步骤根据国标法(gb-t23535-2009)，其步骤为：取100ml烧杯两个，于空白杯(a)和实验杯(b)各加入底物溶液，即橄榄油乳化液4.0ml和gly-naoh缓冲液5.0ml(ph10.0)，(a)中加入15ml95％的乙醇；在25℃预热5min后，(a)和(b)中各加入酶液1ml，准确反应10min，随后(b)加入15ml95％乙醇终止反应；两个烧杯中分别加入酚酞作为指示剂，并各加入一枚转子，置于磁力搅拌器上，边搅拌，边用0.05m的标准naoh滴定直至溶液呈淡粉色不再发生变化，记录naoh的消耗体积，计算酶活。样品均含有3组平行实验。4.酶活测定结果如下表(以实施例6、7和8制备的n157f粗酶液和细胞催化剂，以及同样方法制备的野生型脂肪酶粗酶液和细胞催化剂为实验对象)：注：野生型脂肪酶粗酶液和细胞催化剂的制备中，首先采用实施例3、4、5同样的方法构建野生酶重组菌株，之后采用实施例6、7、8同样的发酵方法制备野生酶粗酶液或细胞催化剂。5.耐碱性能的检测通过记录野生型与突变体在不同ph下，不同时间段内的残余酶活的变化，以体现脂肪酶的耐碱性能的提升。以相同酶活力的野生型与突变体的酶粉保存于0.05m的ph8.0的pbs缓冲液中，在30℃，ph分别为9，10，11的条件下，分别保温40、80、120min，每个时间点测一次残余酶活力。测定方法按上述国标法进行。以未经过处理时的酶活为100％，计算处理后的残余酶活力。本实验记录发现，在ph＝9时，30℃，保温120min，野生型(wt)的残余酶活为54％，n157f突变体的残余酶活为72％，其残余酶活相对于野生型提高了18％；ph＝10时，30℃，保温120min，野生型(wt)的残余酶活为61％，n157f突变体的残余酶活为82％，其残余酶活相对于野生型提高了21％；ph＝11时，30℃，保温120min，野生型(wt)的残余酶活为47％，n157f突变体的残余酶活为70％，其残余酶活相对于野生型提高了23％。通过以上对比发现，n157f突变体的酶活以及耐碱性相较于野生型脂肪酶都有一定程度的提高。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。序列表<110>天津科技大学<120>一种新型脂肪酶及其制备与应用<130>1<141>2018-12-06<160>11<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>258<212>prt<213>圆弧青霉(penicilliumcyclopiumcicc41049)<400>1alathralaaspalaalaalapheproaspleuhisargalaalalys151015leuserseralaalatyrthrglycysileglylysalapheaspval202530thrilethrlysargiletyraspleuvalthraspthrasnglyphe354045valglytyrserthrglulyslysthrilealavalilemetarggly505560serthrthrilethraspphevalasnaspileaspilealaleuile65707580thrprogluleuserglyvalthrpheproseraspvallysilemet859095argglyvalhisargprotrpseralavalhisaspthrileilethr100105110gluvallysalaleuilealalystyrproasptyrthrleugluala115120125valglyhisserleuglyglyalaleuthrserilealahisvalala130135140leualaglnasnpheproasplysserleuvalserasnalaleuasn145150155160alapheproileglyasnglnalatrpalaasppheglythralagln165170175alaglythrpheasnargglyasnasnvalleuaspglyvalproasn180185190mettyrserserproleuvalasnphelyshistyrglythrglutyr195200205tyrserserglythrglualaserthrvallyscysgluglyglnarg210215220asplyssercysseralaglyasnglymettyralavalthrprogly225230235240hisilealaserpheglyvalvalmetleuthralaglycysglytyr245250255leuser<210>2<211>774<212>dna<213>圆弧青霉(penicilliumcyclopiumcicc41049)<400>2gcaactgctgacgccgctgccttccctgatctgcaccgtgcagcaaagctttcttccgct60gcctacacaggttgcatcggaaaggccttcgatgtcactatcaccaagaggatttatgac120ctcgtgaccgacaccaatggattcgtcggatactccaccgagaagaagaccatcgcggtc180atcatgaggggctcgactaccatcaccgacttcgtgaacgacattgacattgctctcatc240actcctgagctctcgggcgtgactttcccctctgatgtgaagatcatgagaggtgttcac300agaccttggtccgctgtacacgacaccatcattactgaagtcaaggctctcattgcgaag360taccctgattacactctggaagcagtcggacattccctcggtggtgccctcacatccatt420gcccacgttgccctggcccagaacttcccggacaagtcacttgtcagcaatgcccttaac480gccttccccatcggcaaccaagcgtgggccgactttggtactgcgcaggccggtaccttc540aaccgcggaaataacgttcttgacggtgtccctaacatgtactcgagcccgcttgttaac600ttcaagcactatggaaccgaatactacagctctggtaccgaggctagcaccgtgaagtgc660gaaggccagcgtgacaagtcttgctctgccggcaatggcatgtacgctgtcactcccggt720cacatcgcaagctttggcgtcgtgatgcttactgctggttgtggctatctgagc774<210>3<211>258<212>prt<213>人工序列()<400>3alathralaaspalaalaalapheproaspleuhisargalaalalys151015leuserseralaalatyrthrglycysileglylysalapheaspval202530thrilethrlysargiletyraspleuvalthraspthrasnglyphe354045valglytyrserthrglulyslysthrilealavalilemetarggly505560serthrthrilethraspphevalasnaspileaspilealaleuile65707580thrprogluleuserglyvalthrpheproseraspvallysilemet859095argglyvalhisargprotrpseralavalhisaspthrileilethr100105110gluvallysalaleuilealalystyrproasptyrthrleugluala115120125valglyhisserleuglyglyalaleuthrserilealahisvalala130135140leualaglnasnpheproasplysserleuvalserphealaleuasn145150155160alapheproileglyasnglnalatrpalaasppheglythralagln165170175alaglythrpheasnargglyasnasnvalleuaspglyvalproasn180185190mettyrserserproleuvalasnphelyshistyrglythrglutyr195200205tyrserserglythrglualaserthrvallyscysgluglyglnarg210215220asplyssercysseralaglyasnglymettyralavalthrprogly225230235240hisilealaserpheglyvalvalmetleuthralaglycysglytyr245250255leuser<210>4<211>774<212>dna<213>人工序列()<400>4gcaaccgcagacgcagcagcatttccggatctgcatcgcgcagcaaaactgagttctgca60gcgtataccggttgcattggcaaagcgtttgacgttaccatcaccaaacgcatctacgac120ctggttaccgataccaacggttttgttggctacagcaccgagaaaaagaccatcgccgtc180attatgcgcggtagtaccaccatcaccgatttcgtcaacgacatcgacatcgcgctgatt240accccggaactgtctggcgttacctttccgagcgacgtcaaaattatgcgcggcgttcat300cgtccgtggtctgcagttcacgataccattatcaccgaggtcaaagcgctgattgcgaaa360tacccggattataccctggaagcagttggtcatagtctgggcggcgcactgacctctatt420gcacatgttgcactggcacagaattttccggataaaagcctggttagcttcgcgctgaac480gcatttccgattggtaaccaggcgtgggcagattttggtaccgcacaagcagg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